曹曉曉 徐菁 王海燕 馬巍 李秀維 王建強(qiáng)

摘要：目的：對(duì)比分析碘營(yíng)養(yǎng)適宜和過(guò)量對(duì)有自身免疫性甲狀腺炎遺傳傾向小鼠甲狀腺轉(zhuǎn)錄組的影響，為碘過(guò)量致自身免疫性甲狀腺疾病的發(fā)病機(jī)制提供科學(xué)依據(jù)。方法：將18只5周齡NOD·H2h4小鼠隨機(jī)分為對(duì)照組和高碘組，分別予適宜碘和過(guò)量碘飼養(yǎng)16周。ELISA和HE法進(jìn)行血清甲功和甲狀腺病理檢測(cè)。建立甲狀腺轉(zhuǎn)錄組文庫(kù)，利用Illumina HiSeq平臺(tái)測(cè)序，進(jìn)行基因轉(zhuǎn)錄組表達(dá)差異和差異基因KEGG通路分析。結(jié)果：適宜碘和過(guò)量碘飼養(yǎng)建立了甲狀腺正常和自身免疫性甲狀腺炎小鼠模型，兩組小鼠甲狀腺轉(zhuǎn)錄組存在304個(gè)差異表達(dá)基因，其中與細(xì)胞因子、細(xì)胞趨化因子和細(xì)胞粘附分子通路，以及抗原處理呈遞相關(guān)的基因轉(zhuǎn)錄水平在高碘組顯著升高。結(jié)論：碘過(guò)量可能會(huì)過(guò)度激活多個(gè)與免疫反應(yīng)和炎癥發(fā)生密切相關(guān)的分子通路，共同促進(jìn)自身免疫性甲狀腺疾病的發(fā)生發(fā)展。

關(guān)鍵詞：碘過(guò)量;轉(zhuǎn)錄組學(xué);自身免疫性甲狀腺疾病;小鼠

國(guó)內(nèi)外流行病學(xué)調(diào)查顯示，碘缺乏地區(qū)人群在補(bǔ)碘后較長(zhǎng)時(shí)間內(nèi)AITD患病率和發(fā)病率均會(huì)增高[12]，且高水碘地區(qū)的居民中甲狀腺自身抗體陽(yáng)性伴隨甲狀腺功能減退的患者顯著多于適碘地區(qū)[3]，這些現(xiàn)象能夠在有疾病遺傳易感性的動(dòng)物模型中得到重復(fù)。研究發(fā)現(xiàn)，90%的NOD·H2h4小鼠在005%NaI水喂養(yǎng)的條件下可被誘發(fā)出實(shí)驗(yàn)性自身免疫性甲狀腺炎（EAT）[4]?？梢?jiàn)，碘過(guò)量是AITD發(fā)病的危險(xiǎn)因素，特別是對(duì)于具有遺傳背景的敏感人群而言，過(guò)量碘攝入可能會(huì)誘導(dǎo)或加速該類(lèi)疾病的發(fā)生發(fā)展。有學(xué)者認(rèn)為，碘過(guò)量可導(dǎo)致甲狀腺上皮細(xì)胞氧化應(yīng)激增強(qiáng)，造成細(xì)胞損傷，進(jìn)而誘導(dǎo)甲狀腺濾泡上皮細(xì)胞發(fā)生凋亡，誘發(fā)甲狀腺免疫功能異常[56]。另外，過(guò)量碘攝入還可促使甲狀腺球蛋白（Tg）碘化程度增高，進(jìn)而可能增加其免疫原性[1]。然而，有關(guān)碘攝入過(guò)量誘發(fā)AITD的具體分子機(jī)理目前尚不明確。近年來(lái)，隨著高通量分析技術(shù)和信息科學(xué)的迅速發(fā)展，轉(zhuǎn)錄組學(xué)能夠在整體水平上研究細(xì)胞特定時(shí)空中全部基因轉(zhuǎn)錄本種類(lèi)、結(jié)構(gòu)和功能及轉(zhuǎn)錄調(diào)控的學(xué)科，其相關(guān)技術(shù)為疾病的不同階段、不同結(jié)局的分子機(jī)理和調(diào)控網(wǎng)絡(luò)的研究提供了強(qiáng)有力工具[7]。本研究通過(guò)適宜碘和過(guò)量碘飼養(yǎng)具有自身免疫性甲狀腺炎遺傳傾向的NOD·H2h4小鼠，建立甲狀腺正常和EAT小鼠模型，對(duì)比分析兩組甲狀腺轉(zhuǎn)錄組學(xué)，旨在探索碘過(guò)量攝入誘發(fā)自身免疫性甲狀腺炎中發(fā)揮關(guān)鍵作用的相關(guān)通路，為碘致AITD發(fā)病的分子機(jī)制提供科學(xué)依據(jù)。

1材料與方法

11儀器與試劑

NaI，上海國(guó)藥集團(tuán)化學(xué)試劑有限公司;ELISA試劑盒，武漢伊萊瑞特生物科技股份有限公司;RNA提取與純化試劑盒、cDNA文庫(kù)構(gòu)建試劑盒、PCR反應(yīng)體系，深圳華大基因有限公司;其余試劑，均為分析純，上海國(guó)藥集團(tuán)化學(xué)試劑有限公司。

AR3130電子天平，中國(guó)上海梅特勒托利多公司;5407離心機(jī)，德國(guó)Eppendorf公司;EXL 800酶標(biāo)測(cè)試儀，美國(guó)Biotech公司;AE31顯微鏡，中國(guó)廈門(mén)麥克奧迪公司;Hiseq 2500測(cè)序平臺(tái)，Illumina公司。

12實(shí)驗(yàn)動(dòng)物與分組處理

5周齡雌性NOD·H2H4小鼠（中國(guó)醫(yī)科大學(xué)滕衛(wèi)平教授課題組惠贈(zèng)），在中國(guó)疾病預(yù)防控制中心實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心SPF環(huán)境下飼養(yǎng)。按體重將18只小鼠隨機(jī)分成2組：對(duì)照組（C）和高碘組（HI），每組9只，分別給予蒸餾水和005%NaI水[4]喂養(yǎng)16周。第16周末處死小鼠，取血清和甲狀腺，將甲狀腺的一葉固定在4%多聚甲醛溶液中，另一葉在液氮中快速冷凍。本實(shí)驗(yàn)程序經(jīng)中國(guó)疾病預(yù)防控制中心動(dòng)物倫理委員會(huì)審核批準(zhǔn)（批準(zhǔn)文號(hào)：NHPF064101）。

13血清指標(biāo)的ELISA檢測(cè)

每組隨機(jī)取5只小鼠血清，進(jìn)行甲狀腺過(guò)氧化物酶抗體（TPOAb）、游離三碘甲狀腺原氨酸（FT3）、促甲狀腺素（TSH）的檢測(cè)，采用ELISA檢測(cè)試劑盒，具體操作參照說(shuō)明書(shū)。

14甲狀腺組織病理檢測(cè)

與13相對(duì)應(yīng)，取5只小鼠的一葉甲狀腺進(jìn)行病理檢測(cè)。采用HE染色，在光學(xué)顯微鏡下觀察。甲狀腺炎癥程度分級(jí)主要依據(jù)甲狀腺濾泡破壞程度和淋巴細(xì)胞浸潤(rùn)?！?”代表陰性;“+”代表有淋巴細(xì)胞浸潤(rùn)，濾泡腔內(nèi)充滿膠質(zhì)，濾泡上皮細(xì)胞變扁平;“++”代表有淋巴細(xì)胞浸潤(rùn)，出現(xiàn)較多的大濾泡腔，部分有融合破壞;“+++”代表有淋巴細(xì)胞浸潤(rùn)，50%的濾泡腔壁斷裂、破壞;“++++”代表所有的濾泡腔遭到破壞或者沒(méi)有濾泡腔存在。

15轉(zhuǎn)錄組建庫(kù)與測(cè)序

每組隨機(jī)取9只小鼠的一葉甲狀腺組織，分別稱(chēng)量，各加入500μL Trizol 裂解液，放入研磨機(jī)中，研磨30s，取出靜置5min，使組織細(xì)胞充分裂解。4℃、12 000 g離心5min。將上清轉(zhuǎn)入加有100μL氯仿/異戊醇（24∶1）的EP管中，顛倒振蕩混勻。4℃、12 000 g離心8min。將上清轉(zhuǎn)入加有200μL異丙醇的離心管中，顛倒混勻置于-20℃冰箱靜置2h以上。4℃、17 500 g離心25min，棄上清，用09 mL 75%乙醇洗滌，上下顛倒懸浮沉淀，4℃、17 500 g 離心3min。棄上清，短暫離心后吸去殘留液體，晾干3～5min。用50μL DEPC水溶解沉淀。Aglient 2100 Bioanalyzer進(jìn)行RNA定量。將每組9葉甲狀腺RNA隨機(jī)分成3個(gè)亞組（對(duì)照組分為C1、C2、C3;高碘組分為HI1、HI2、HI3），每個(gè)亞組取3只小鼠等量的RNA進(jìn)行混勻。然后分別取等量 1μg 亞組RNA樣品，使用oligodT磁珠進(jìn)行純化。將純化的mRNA依次進(jìn)行片段化處理，cDNA合成，末端修復(fù)和接頭連接，PCR反應(yīng)及產(chǎn)物回收，建立最終文庫(kù)樣本。按照Illumina Hiseq 2500測(cè)序平臺(tái)的操作說(shuō)明制備上機(jī)樣本，進(jìn)行測(cè)序;測(cè)序結(jié)束后，整理數(shù)據(jù)，并進(jìn)行生物信息學(xué)統(tǒng)計(jì)和分析。

16測(cè)序結(jié)果的分析

共得到6個(gè)樣品原始測(cè)序結(jié)果，平均產(chǎn)出為550 Gb/樣品。然后過(guò)濾去除測(cè)序的原始數(shù)據(jù)（raw reads）包含低質(zhì)量、接頭污染以及未知堿基N含量過(guò)高的序列。使用HISAT[8]將過(guò)濾后的序列（clean reads）與參考基因組序列進(jìn)行比對(duì)，分析樣品之間的可比性。然后對(duì)組間基因表達(dá)差異性分析和差異基因的京都基因和基因組數(shù)據(jù)庫(kù)（KEGG）的通路注釋分析。

17統(tǒng)計(jì)分析

利用SPSS l30軟件進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析。正態(tài)計(jì)量資料用±s表示，兩兩比較采用t檢驗(yàn);非正態(tài)計(jì)量資料用中位數(shù)M（p25～p75）表示，組間比較選用秩和檢驗(yàn)，相關(guān)性分析采用Spearman線性相關(guān);計(jì)數(shù)資料的比較采用χ2檢驗(yàn)，檢驗(yàn)水準(zhǔn)α=005。

2結(jié)果與分析

21小鼠模型的驗(yàn)證

由表1可見(jiàn)，與C組相比，HI組小鼠血清中TPOAb和TSH水平顯著升高，而血清FT3水平降低，差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P<005）。HI組小鼠表現(xiàn)出自身免疫性甲狀腺炎的血清學(xué)特征。由圖1可見(jiàn)，C組甲狀腺組織形態(tài)和結(jié)構(gòu)正常，而HI組小鼠甲狀腺組織則出現(xiàn)了濾泡擴(kuò)張和融合，濾泡內(nèi)膠體積聚，甲狀腺濾泡上皮細(xì)胞扁平以及少量淋巴細(xì)胞浸潤(rùn)。結(jié)合血清學(xué)結(jié)果，本研究通過(guò)適宜碘和過(guò)量碘飼養(yǎng)NOD·H2h4小鼠分別建立了甲狀腺正常小鼠和EAT小鼠模型。

22小鼠甲狀腺組織轉(zhuǎn)錄組差異表達(dá)分析

針對(duì)每個(gè)樣本的原始測(cè)序數(shù)據(jù)進(jìn)行質(zhì)量評(píng)估，經(jīng)過(guò)測(cè)序數(shù)量質(zhì)量剪切及統(tǒng)計(jì)，與小鼠參考基因組對(duì)比，進(jìn)行轉(zhuǎn)錄組整體質(zhì)量評(píng)估。

221測(cè)序結(jié)果質(zhì)量分析測(cè)序的原始數(shù)據(jù)包含低質(zhì)量、接頭污染以及未知堿基N含量過(guò)高的序列。數(shù)據(jù)分析之前需要去除這些序列以保證結(jié)果的可靠性。得到clean reads之后，使用 HISAT[8]將其與參考基因組序列進(jìn)行比對(duì)。平均每個(gè)樣品的比對(duì)率達(dá)到 8699%，同時(shí)樣品間均勻的比對(duì)率表明樣品之間的數(shù)據(jù)具有可比性（表2）。

222組間差異表達(dá)基因分析圖2結(jié)果顯示，C組和HI組高碘組的基因轉(zhuǎn)錄表達(dá)存在一定差異性，其中304個(gè)基因表達(dá)有顯著統(tǒng)計(jì)學(xué)差異。如圖2A所示，使用散點(diǎn)圖展示差異表達(dá)基因（DEG）的分布。與C組相比，HI組有168個(gè)基因的表達(dá)水平降低、125個(gè)基因的表達(dá)水平升高。并且對(duì)每組 DEG 作表達(dá)量熱圖（圖2B）。

223差異表達(dá)基因的KEGG分析將差異表達(dá)基因進(jìn)行KEGG通路注釋分析。根據(jù)P值和Q值從大到小進(jìn)行排列（表3）。其中與機(jī)體免疫反應(yīng)和炎癥發(fā)生密切相關(guān)的TNF信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)通路，細(xì)胞粘附分子（CAMs）、細(xì)胞因子受體相互作用和趨化因子信號(hào)通路，以及抗原處理及呈遞均在高碘誘發(fā)的EAT小鼠甲狀腺組織中過(guò)度激活。

細(xì)胞因子主要包括腫瘤壞死因子（TNF）、白細(xì)胞介素（IL）等[9]。研究發(fā)現(xiàn)，AITD患者血清中TNF水平顯著升高[10]，且高碘刺激還可誘導(dǎo)AITD患者甲狀腺組織分離細(xì)胞中TNFα的高表達(dá)[11]。同樣，本研究中TNF通路在EAT小鼠甲狀腺中也異常活躍，其中TNFα誘導(dǎo)蛋白3（Tnfaip3）、TNF 受體超家族1b（Tnfrsf1b）、IL1、IL18等基因呈高表達(dá)狀態(tài)。除了細(xì)胞因子通路，在機(jī)體免疫應(yīng)答過(guò)程中，細(xì)胞趨化因子則參與淋巴組織的發(fā)生與分化過(guò)程?，F(xiàn)已證實(shí)，甲狀腺內(nèi)淋巴細(xì)胞和甲狀腺濾泡細(xì)胞均能產(chǎn)生CC和CXC細(xì)胞趨化因子，它們促進(jìn)了炎癥發(fā)展過(guò)程[12]。本研究發(fā)現(xiàn)，EAT小鼠甲狀腺組織中CXC趨化因子配體10/11/16（Cxcl10/Cxcl11/Cxcl16）基因轉(zhuǎn)錄水平顯著升高。其中，Cxcl10和Cxcl11分子水平被證實(shí)在AITD患者血清中顯著升高[1315]。另外，CAMs通路能夠介導(dǎo)細(xì)胞間或細(xì)胞與細(xì)胞外基質(zhì)間相互接觸和結(jié)合，是免疫應(yīng)答重要的分子基礎(chǔ)。細(xì)胞間粘附分子1（Icam1）能促進(jìn)甲狀腺細(xì)胞與淋巴細(xì)胞的粘附與識(shí)別[16]。結(jié)果顯示，Icam1轉(zhuǎn)錄水平在高碘誘發(fā)的EAT小鼠甲狀腺中高于適碘對(duì)照組，且CAMs cd40在HI組也是高表達(dá)的?？梢?jiàn)碘過(guò)量攝入會(huì)過(guò)度激活甲狀腺內(nèi)多條交錯(cuò)復(fù)雜的分子通路共同促進(jìn)EAT的發(fā)生發(fā)展。

KEGG分析還發(fā)現(xiàn)，高碘攝入能夠改變甲狀腺組織相容性抗原處理呈遞關(guān)鍵基因的轉(zhuǎn)錄水平，主要表現(xiàn)為EAT小鼠甲狀腺H2組織相容性抗原中H2Q2、H2Q8、H2Q10、H2T10、H2K2基因的轉(zhuǎn)錄水平的增高。甲狀腺組織相容性抗原發(fā)生變化，可能會(huì)引起相容性抗原處理呈遞的紊亂，最終導(dǎo)致甲狀腺受到自身免疫細(xì)胞的攻擊。當(dāng)然，NODH2h4小鼠的H2抗原相關(guān)基因表達(dá)水平的升高與其AITD遺傳傾向性的特征可能有關(guān)，而過(guò)量碘攝入則誘發(fā)了這一改變。

3結(jié)論

通過(guò)適宜碘和過(guò)量碘飼養(yǎng)NOD·H2h4小鼠成功建立了甲狀腺正常小鼠和EAT小鼠模型。經(jīng)對(duì)比分析兩組小鼠甲狀腺組織的轉(zhuǎn)錄組學(xué)，揭示出碘攝入過(guò)量可能會(huì)過(guò)度激活細(xì)胞因子、細(xì)胞趨化因子、CAMs以及抗原處理呈遞等相關(guān)的分子通路，共同誘發(fā)和促進(jìn)了小鼠甲狀腺炎的發(fā)生發(fā)展。然而，轉(zhuǎn)錄組的這種變化是否會(huì)隨著碘干預(yù)時(shí)間、濃度和動(dòng)物模型類(lèi)型的不同帶來(lái)結(jié)果上的差異仍有待于進(jìn)一步的研究。

感謝中國(guó)醫(yī)科大學(xué)滕衛(wèi)平教授課題組惠贈(zèng)NOD·H2h4小鼠?！?/p>

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