何翠，陳春麗，柯青，沈力，鄧鑫州，顧兵，孫蕊格，段奇文

0 引言

食管癌是消化系統(tǒng)常見(jiàn)的惡性腫瘤，其發(fā)病率和死亡率一直居高不下。放射治療是食管癌的重要治療方式，不僅能提高手術(shù)切除率，而且在控制局部復(fù)發(fā)方面也發(fā)揮重要的作用，但放射抗拒是導(dǎo)致放療失敗的主要原因[1]。DLK1是表皮生長(zhǎng)因子家族成員之一，它參與多種細(xì)胞的增殖、分化，并且與腫瘤的發(fā)生發(fā)展有著密切的關(guān)系[2]，但目前尚未有關(guān)于DLK1與食管癌放射抵抗的研究。本研究主要是通過(guò)合成DLK1 siRNA，轉(zhuǎn)染前期構(gòu)建的放射抗拒食管癌細(xì)胞KYSE-R，觀察DLK1干擾后對(duì)食管癌放射抗拒細(xì)胞的放射敏感度影響。

1 材料與方法

1.1 實(shí)驗(yàn)材料

DMEM培養(yǎng)基、胎牛血清購(gòu)自美國(guó)Gibco公司；DLK1抗體、GAPDH抗體、HRP-標(biāo)記二抗購(gòu)自美國(guó)Abcam公司，DLK1 siRNA干擾序列和陰性對(duì)照序列均由上海吉瑪公司合成。蛋白裂解液、蛋白提取試劑盒、BCA蛋白定量試劑盒、細(xì)胞周期檢測(cè)試劑盒、細(xì)胞凋亡檢測(cè)試劑盒均購(gòu)自上海碧云天生物技術(shù)研究所；RNA反轉(zhuǎn)錄試劑盒、PCR擴(kuò)增試劑盒購(gòu)自日本TaKaRa公司；Lipofectamine 3000購(gòu)自美國(guó)Invitrogen公司；流式細(xì)胞儀購(gòu)自美國(guó)BD公司；熒光定量PCR儀、凝膠成像系統(tǒng)購(gòu)自美國(guó)Bio-Rad公司；相機(jī)購(gòu)自日本Canon公司。

1.2 實(shí)驗(yàn)方法

1.2.1 細(xì)胞培養(yǎng) 用含10%胎牛血清的DMEM培養(yǎng)基培養(yǎng)KYSE、KYSE-R細(xì)胞，并置于37℃、飽和濕度、5%CO2的細(xì)胞培養(yǎng)箱中，待貼壁生長(zhǎng)至80%時(shí)進(jìn)行胰酶消化傳代。

1.2.2 放射抗拒食管癌KYSE-R細(xì)胞的構(gòu)建 選取對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期的KYSE細(xì)胞接種于10 cm塑料培養(yǎng)皿內(nèi)（細(xì)胞數(shù)1×106個(gè)/皿），培養(yǎng)皿內(nèi)均加入8 ml含10%胎牛血清的DMEM培養(yǎng)液，置于恒溫箱中培養(yǎng)24 h后，接受2 Gy劑量的X線重復(fù)照射（放療設(shè)備Varian Unique，照射能量6 MV，照射野15 cm×15 cm，照射距離100 cm，劑量率2 Gy/min），每次照射后放回恒溫箱中繼續(xù)培養(yǎng)，累積照射28次，即當(dāng)總劑量達(dá)到56 Gy時(shí)，對(duì)存活的細(xì)胞進(jìn)行單克隆，穩(wěn)定傳代后得到放射抗拒KYSE-R細(xì)胞株。

1.2.3 細(xì)胞克隆形成實(shí)驗(yàn) 收集對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期的KYSE和KYSE-R細(xì)胞，選取恰當(dāng)?shù)募?xì)胞數(shù)接種于6孔培養(yǎng)板內(nèi)：0 Gy（400個(gè)/孔）、2 Gy（800個(gè)/孔）、4 Gy（1 600個(gè)/孔）、6 Gy（3 200個(gè)/孔）、8 Gy（6 400個(gè)/孔）、10 Gy（12 800個(gè)/孔）。采用X線對(duì)細(xì)胞進(jìn)行體外照射，照射結(jié)束后，繼續(xù)培養(yǎng)12天，取出培養(yǎng)板，移去培養(yǎng)液，PBS洗兩次，甲醇固定15 min。移去固定液，0.1%結(jié)晶紫染色。顯微鏡下計(jì)數(shù)大于50個(gè)細(xì)胞的集落數(shù)，并計(jì)算存活分?jǐn)?shù)。存活分?jǐn)?shù)為縱坐標(biāo)，照射劑量為橫坐標(biāo)，繪制劑量存活曲線。實(shí)驗(yàn)重復(fù)3次。

1.2.4 RT-PCR實(shí)驗(yàn) 收集對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期的KYSE和KYSE-R細(xì)胞裂解后，按照RNA反轉(zhuǎn)錄試劑盒說(shuō)明書(shū)操作提取RNA，并進(jìn)行反轉(zhuǎn)錄合成cDNA，然后進(jìn)行PCR反應(yīng)，PCR反應(yīng)條件：95℃預(yù)變性1 min，95℃變性15 s，60℃退火1 min，72℃延伸1 min，40個(gè)循環(huán)。DLK1引物序列：F:5′-CAAAATGGATTCTGCGAGGAT-3′，R:5′-CCCGAACATCTCTATCACAGA-3′；GAPDH引物序列：F:5′-CCAACCGCGAGAAGATGA-3′，R:5′-CCAGAGGCGTACAGGGATAG-3′。以GAPDH為內(nèi)參，按照2-ΔΔCt法計(jì)算DLK1相對(duì)表達(dá)量。

1.2.5 Western blot實(shí)驗(yàn) 分別收集對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期的KYSE和KYSE-R細(xì)胞，PBS洗滌2次，加入裂解緩沖液置冰上裂解30 min,4℃，12 000 r/min離心10 min，收集上清液，采用BCA法檢測(cè)各樣本蛋白含量。各組取50 μg樣品上樣行10%SDS-PAGE電泳（80 V恒壓30 min，120 V恒壓50 min），將蛋白轉(zhuǎn)移至PVDF膜上，5%脫脂奶粉室溫封閉2 h，加入一抗（DLK1:1:500、GADPH:1:1 000），置4℃冰箱過(guò)夜，次日TBST洗滌5 min×3次,加羊抗兔Ig G-HRP（1:1 000）、羊抗鼠Ig G-HRP（1:1 000）室溫孵育2 h，TBST洗滌5 min×3次，ECL化學(xué)發(fā)光法試劑盒顯影。

1.2.6 DLK1 siRNA轉(zhuǎn)染 吉瑪公司合成的三條siDLK1干擾序列為：siDLK-1:F:5′-GGACGAUGGCCUCUAUGAATT-3′，R:5′-UUCAUAGAGGCCAUCGUCCTT-3′；siDLK-2:F:5′-CCUGAAGGUGUCCAUGAAATT-3′，R:5′-UUUCAUGGACACCUUCAGGTT-3′；siDLK-3:F:5′-GCACUGUGGGUAUCGUCUUTT-3′，R:5′-AAGACGAUACCCACAGUGCTT-3′；陰性對(duì)照（Negative control,NC）序列為：F:5′-UUCUCCGAACGUACGUTT-3′，R:5′-ACGUGACACGUUCGGAGAATT-3′。收集對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期的KYSE-R細(xì)胞，調(diào)整細(xì)胞密度為2×105個(gè)/毫升接種于6孔板，按照Lipofectamine 3000說(shuō)明書(shū)操作轉(zhuǎn)染siDLK1和Negative control，收集轉(zhuǎn)染48、72 h后的細(xì)胞進(jìn)行后續(xù)實(shí)驗(yàn)。

1.2.7 細(xì)胞凋亡檢測(cè) KYSE-R細(xì)胞經(jīng)DLK siRNA轉(zhuǎn)染后，采用4 Gy X射線照射細(xì)胞，24 h后離心收集細(xì)胞（約1×106個(gè)），預(yù)冷PBS洗3次。按照細(xì)胞凋亡檢測(cè)試劑盒說(shuō)明書(shū)操作，采用Annexin V/PI雙染，流式細(xì)胞儀檢測(cè)細(xì)胞凋亡。

1.2.8 細(xì)胞周期檢測(cè) KYSE-R細(xì)胞經(jīng)DLK siRNA轉(zhuǎn)染，采用4 Gy X線照射后，收集細(xì)胞（約1×106個(gè)），預(yù)冷PBS洗3次。70%的冷乙醇4℃固定過(guò)夜。按照細(xì)胞周期檢測(cè)試劑盒說(shuō)明書(shū)操作染色，采用流式細(xì)胞儀檢測(cè)細(xì)胞周期。

1.3 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法

使用SPSS22.0軟件分析數(shù)據(jù)。以上所有實(shí)驗(yàn)至少重復(fù)三次，數(shù)據(jù)結(jié)果以表示，通過(guò)配對(duì)樣本t檢驗(yàn)進(jìn)行計(jì)算分析。P<0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 KYSE-R細(xì)胞放射敏感度檢測(cè)

我們前期通過(guò)X線反復(fù)照射及培養(yǎng)獲得了放射抗拒食管癌細(xì)胞KYSE-R，并通過(guò)細(xì)胞克隆形成實(shí)驗(yàn)對(duì)其放射敏感度進(jìn)行檢測(cè)，結(jié)果顯示：與KYSE細(xì)胞相比，KYSE-R細(xì)胞表現(xiàn)出顯著的放射抗拒性，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P=0.021），見(jiàn)圖1。

圖1 KYSE與KYSE-R照射后細(xì)胞存活曲線Figure 1 Survival curves of KYSE and KYSE-R cells after irradiation

2.2 DLK1在KYSE和KYSE-R中細(xì)胞的表達(dá)

RT-PCR檢測(cè)結(jié)果顯示：KYSE、KYSE-R細(xì)胞中DLK1 mRNA相對(duì)表達(dá)量分別為1.002±0.011、1.795±0.068，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P=0.032），見(jiàn)圖2A；Western blot檢測(cè)結(jié)果顯示：KYSE-R細(xì)胞中DLK1蛋白表達(dá)水平顯著高于KYSE細(xì)胞，見(jiàn)圖2B。

2.3 DLK1干擾效果驗(yàn)證

RT-PCR檢測(cè)結(jié)果顯示：Blank組、NC組、siDLK1-1組、siDLK1-2組、siDLK1-3組mRNA相對(duì)表達(dá)量分別為1.038±0.029、1.035±0.018、0.712±0.039，0.446±0.037、0.218±0.01，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（與空白對(duì)照組相比，Psi-1=0.038,Psi-2=0.022,Psi-3=0.001），見(jiàn)圖3A；Western blot檢測(cè)DLK1蛋白表達(dá)，結(jié)果顯示：siDLK1-3顯著抑制了DLK1蛋白水平的表達(dá)，沉默效果最佳，見(jiàn)圖3B。因此，我們選擇siDLK1-3進(jìn)行后續(xù)功能實(shí)驗(yàn)。

2.4 干擾DLK1對(duì)KYSE-R細(xì)胞放射敏感度的影響

圖2 RT-PCR(A)和Western blot(B)檢測(cè)DLK1在KYSE和KYSE-R細(xì)胞中的表達(dá)Figure 2 DLK1 expression in KYSE and KYSE-R cells detected by RT-PCR(A) and Western blot(B)

圖3 RT-PCR(A)和Western blot(B)檢測(cè)siDLK1的干擾效果Figure 3 Interference effects of siDLK1 detected by RTPCR(A) and Western blot(B)

克隆形成實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示，干擾DLK1后，經(jīng)4 Gy射線照射，siDLK1組細(xì)胞克隆形成能力顯著低于Blank組與NC組（PBlank=0.026,PNC=0.017），提示DLK1干擾后增強(qiáng)了KYSE-R細(xì)胞的放射敏感度，見(jiàn)圖4。

2.5 干擾DLK1對(duì)KYSE-R細(xì)胞凋亡的影響

流式細(xì)胞術(shù)檢測(cè)結(jié)果顯示：經(jīng)4 Gy射線照射，Blank組、NC組和siDLK1干擾組細(xì)胞凋亡率分別為（8.037±0.822）%、（9.49±0.573）%和（22.6±1.77）%，siDLK1干擾組的細(xì)胞凋亡率顯著高于Blank組和NC組，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（PBlank=0.001,PNC=0.002），見(jiàn)圖5。表明干擾DLK1增強(qiáng)了射線誘導(dǎo)的細(xì)胞凋亡。

圖4 克隆形成實(shí)驗(yàn)檢測(cè)照射后各組細(xì)胞存活情況Figure 4 Cell survival of each group detected by cloning formation assay after irradiation

2.6 干擾DLK1對(duì)KYSE-R細(xì)胞周期的影響

經(jīng)4 Gy 射線照射后，Blank 組、NC 組、siDLK1干擾組G2/M細(xì)胞所占比例分別為（15.7±1.743）%、（17.38±0.682）%、（34.81±1.574）%，siDLK1干擾組G2/M細(xì)胞比例顯著高于Blank組和NC組，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（PBlank=0.003,PNC=0.002），見(jiàn)圖6。表明干擾DLK1可誘導(dǎo)射線引起的G2/M期阻滯。

圖5 流式細(xì)胞術(shù)檢測(cè)各組照射后細(xì)胞凋亡Figure 5 Cell apoptosis of each group detected by flow cytometry after irradiation

圖6 流式細(xì)胞術(shù)檢測(cè)各組照射后細(xì)胞周期Figure 6 Cell cycle of each group detected by flow cytometry after irradiation

3 討論

放射治療效果取決于腫瘤對(duì)放射線的敏感程度。目前國(guó)內(nèi)外調(diào)控食管癌放射敏感度的分子研究，如X線修復(fù)交叉互補(bǔ)基因（XRCC）[3]、Cox酶[4]、信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)與轉(zhuǎn)錄激活因子3（STAT3）[5]、組蛋白去乙?；?[6]等使人們對(duì)食管癌放療抵抗的分子機(jī)制有了深入了解。DLK1是位于人類(lèi)染色體14q32上,具有跨膜和分泌功能的蛋白[7]，參與多種腫瘤的發(fā)生發(fā)展，DLK1可通過(guò)調(diào)節(jié)Wnt/β-catenin信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)途經(jīng)抑制膠質(zhì)瘤的生長(zhǎng)[8]，可通過(guò)NOTCH途徑抑制MDA-MB-231乳腺癌細(xì)胞增殖和侵襲[9]。這些研究加深了我們對(duì)DLK1在腫瘤發(fā)生發(fā)展過(guò)程中的作用的理解，但是其在食管癌放射抗拒中的作用還不清楚。本研究發(fā)現(xiàn)放射抗拒食管癌細(xì)胞KYSE-R中DLK1的表達(dá)明顯上調(diào)，提示DLK1可能與食管癌的放射敏感度密切相關(guān)。

在放射治療中，射線通過(guò)引起DNA雙鏈斷裂誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡達(dá)到治療目的，因此細(xì)胞凋亡可能是放射增敏的重要環(huán)節(jié)，王亞飛等[10]研究顯示通過(guò)上調(diào)miRNA-145表達(dá)，能夠抑制A549細(xì)胞增殖，促進(jìn)細(xì)胞凋亡，增強(qiáng)放射敏感度。金德蕙等[11]研究證實(shí)干擾BAG-1基因表達(dá)，可通過(guò)增加細(xì)胞凋亡提高黑色素瘤B16F10細(xì)胞對(duì)X線的敏感度，Shen等[12]研究發(fā)現(xiàn)通過(guò)下調(diào)UBE2T，可顯著抑制骨肉瘤細(xì)胞的克隆形成，促進(jìn)細(xì)胞凋亡，從而增強(qiáng)放射敏感度，Li等[13]研究通過(guò)敲除整合素β1抑制下游的FAK/cortactin途徑抑制喉癌細(xì)胞增殖，增強(qiáng)放射敏感度，這些研究均證明通過(guò)增加細(xì)胞凋亡和抑制細(xì)胞增殖能明顯增強(qiáng)放療的敏感度，本研究證實(shí)，下調(diào)食管癌細(xì)胞KYSE-R中DLK1的表達(dá)，經(jīng)X線照射后，細(xì)胞凋亡率明顯增加，增殖能力明顯下降，表現(xiàn)出對(duì)放射線更加敏感。

細(xì)胞周期分布與腫瘤細(xì)胞的放射敏感密切相關(guān)，Shetake等[14]研究發(fā)現(xiàn)，氧化鐵納米顆粒誘導(dǎo)人纖維肉瘤細(xì)胞G2/M期阻滯，增強(qiáng)人纖維肉瘤細(xì)胞的放射敏感度，Adeberg等[15]研究顯示，二甲雙胍可以誘導(dǎo)膠質(zhì)母細(xì)胞瘤細(xì)胞系LN18細(xì)胞的G2/M期阻滯，從而提高放射敏感度，同樣，我們的研究證實(shí)，抑制DLK1的表達(dá)，經(jīng)X線照射后，G2/M期細(xì)胞分布增加。因此抑制DLK1的表達(dá)，可誘導(dǎo)放射抗拒食管癌細(xì)胞照射后引起的G2/M期細(xì)胞阻滯，從而增強(qiáng)放射敏感度。

綜上所述，本研究初步證實(shí)了DLK1在食管癌細(xì)胞放射抗拒中的作用，但仍有一些問(wèn)題需要進(jìn)一步闡明，如DLK1介導(dǎo)食管癌細(xì)胞放射抗拒的具體分子機(jī)制，以及本研究目前僅在一株食管癌細(xì)胞中進(jìn)行了驗(yàn)證，在今后的研究中我們將會(huì)建立多種食管癌放射抗拒細(xì)胞株，提供更為充分的實(shí)驗(yàn)室證據(jù)。