繆卓寧，胡福良

（浙江大學(xué)動物科學(xué)學(xué)院，浙江 杭州 310058）

1 引言

10- 羥基-△2- 癸烯酸（10-hydroxy-△2-dece-noic acid，10-HDA） 是蜂王漿特有的脂肪酸，俗稱王漿酸，是蜂王漿的標(biāo)志物。人們對10-HDA 的研究, 可以追溯到20 世紀(jì)40年代甚至更早。 Townsend 和Luas(1940)全面分析了蜂王漿的理化性質(zhì)[1]。有趣的是，在用乙醚提取的過程中，他們發(fā)現(xiàn)了一種脂肪酸。經(jīng)過一系列有機(jī)化學(xué)分析測試后， 排除了內(nèi)酯或內(nèi)酯酐的可能, 并得到脂肪酸的分子式為C10H18O3,奇怪的是，他們發(fā)現(xiàn)碳鏈上不存在不飽和鍵。 關(guān)于這種脂肪酸的具體結(jié)構(gòu)的困惑持續(xù)了將近20年, 直到Butenandt (1957)首次從蜂王漿中分離出這一脂肪酸，并且，他通過紅外光譜方法首次確定了其結(jié)構(gòu)為10-羥基-2- 癸烯酸[2]， 隨后Barker(1959)等經(jīng)核磁共振確認(rèn)其為反式異構(gòu)體[3]。隨后在Brown 和Frere(1959)等人的進(jìn)一步努力下, 通過輻照生成空間異構(gòu)體才最終確定雙鍵兩側(cè)基團(tuán)呈反式排列(圖1)。

圖1 10-HDA 結(jié)構(gòu)示意圖

它之所以被稱為王漿酸，是因?yàn)槠洫?dú)一無二的結(jié)構(gòu)，至今為止只在蜂王漿中發(fā)現(xiàn)，使之當(dāng)之無愧成為了蜂王漿的代表物質(zhì)。

10-HDA 的發(fā)現(xiàn)和確認(rèn)引發(fā)了國內(nèi)外學(xué)術(shù)界對蜂王漿中脂肪酸的探究熱潮，從結(jié)構(gòu)、性質(zhì)、生理活性及其含量的測定方法等方面對10-HDA 進(jìn)行了深入的研究。

2 10-HDA 生理活性的研究

10-HDA 具有十分廣泛的生物學(xué)活性，主要表現(xiàn)在以下幾個方面。

2.1 抗菌活性

10-HDA 被認(rèn)為是一種特別強(qiáng)的抗菌劑，Alreshoodi(2015)等人的研究表明10-HDA 對金黃色葡萄球菌、 大腸桿菌和大腸桿菌枯草芽孢桿菌抑菌效果極強(qiáng)[4]。除此之外，Yousefi(2012)等人發(fā)現(xiàn)該脂肪酸通過干擾葡糖基轉(zhuǎn)移酶gtfB 和gtfC 的表達(dá)來干擾口腔病原體變形鏈球菌對細(xì)胞表面的粘附[5]。 與此同時，Melliou(2005)等人的結(jié)果也表明10-HDA 對熱帶念珠菌和白色念珠菌等真菌有良好的抗菌活性[6]。

2.2 抗炎活性

在Fang(1994)等人的一項(xiàng)關(guān)于蜂王漿可能導(dǎo)致消化系統(tǒng)疾病的研究中他們發(fā)現(xiàn)10-HDA可以保護(hù)大鼠免受實(shí)驗(yàn)性胃潰瘍的傷害[7]。此外，Sugiyama(2012)等人在鼠巨噬細(xì)胞RAW264細(xì)胞系的研究中表明， 10-HDA 是通過抑制LPS 誘導(dǎo)的NF-kB 信號通路的活化來發(fā)揮其抗炎癥活性[8]。 隨后，陳伊凡(2018)等人的結(jié)果從體內(nèi)和體外的角度驗(yàn)證其抗炎活性，10-HDA 對炎癥介質(zhì)和NO 的主要釋放的抑制作用是有效的，并存在劑量依賴性。并且IL-1β，IL-6，MCP-1 和COX-2 等幾種關(guān)鍵炎癥基因也被10-HDA 抑制[9]。另有 Wang(2015)等人的研究顯示類風(fēng)濕性關(guān)節(jié)炎患者的成纖維樣滑膜細(xì)胞具有10-HDA 抑制作用，這也證明了其對慢性炎癥退行性疾病的治療潛力[10]。

2.3 免疫調(diào)節(jié)活性

目前已經(jīng)報道了10-HDA 的各種免疫調(diào)節(jié)活性，包括10-HDA 通過抑制活化T 細(xì)胞的IL-2Rα 的表達(dá)和IL-2 的產(chǎn)生達(dá)到抑制異種T 細(xì)胞的增殖的效果[11]。除此之外，石晶(1990)等人發(fā)現(xiàn)10-HDA(50，100 mg／L)能提高巨噬細(xì)胞的吞噬活性，一定量的提高免疫系統(tǒng)活性[12]。與此同時，Gasic (2007)和Sugiyama (2013) 等人的研究結(jié)果表明10-HDA 能抑制脾樹突狀細(xì)胞產(chǎn)生白介素12以及抑制巨噬細(xì)胞中LPS 和IFN-β 誘導(dǎo)的NO 產(chǎn)生[13-14]。在另一項(xiàng)研究中，Mihajlovic(2013)等人發(fā)現(xiàn)10-HDA 在人單核細(xì)胞衍生的樹突狀細(xì)胞上具有雙相行為，導(dǎo)致Th1 反應(yīng)刺激和Th2 在50μM 下調(diào)，并在500μM 抑制Th1 和Th2[15]。

2.4 抗衰老活性

Honda(2015)等人發(fā)現(xiàn)10-HDA 可能通過飲食限制和TOR 激酶信號傳導(dǎo)來延長線蟲的壽命并賦予其耐熱和氧化應(yīng)激耐受性[16]。Koya-Miyata (2004)和Park(2011)等人的研究表明10-HDA 促進(jìn)人皮膚成纖維細(xì)胞中增加膠原蛋白的合成和膠原蛋白促進(jìn)因子（轉(zhuǎn)化生長因子β1） 的產(chǎn)生，這種作用介導(dǎo)了蜂王漿皮膚對UVB 誘導(dǎo)的光老化的保護(hù)作用[17-18]。除了促進(jìn)膠原蛋白合成外，Yang(2010)和Wang(2012)等人還發(fā)現(xiàn)10-HDA 可能通過下調(diào)涉及JNK /p38 MAP 激酶和AP-1 轉(zhuǎn)錄因子的途徑來抑制類風(fēng)濕關(guān)節(jié)炎滑膜成纖維細(xì)胞釋放MMP-1 和MMP-3[19]和MMP 調(diào)節(jié)劑結(jié)締組織生長因子[20]。并且，Zheng (2013)等人發(fā)現(xiàn)10-HDA 還抑制了成纖維細(xì)胞中UVA 誘導(dǎo)的JNK/p38 活化以及MMP-1 和MMP-3 的上調(diào)[21]。

2.5 抗腫瘤活性

Izuta(2009)等人實(shí)驗(yàn)表明10-HDA 促進(jìn)具有抗癌活性和免疫調(diào)節(jié)作用的白細(xì)胞介素2 和淋巴細(xì)胞亞群的生長[22]。除此之外，Pengpanich 和Srisuparbh (2019)發(fā)現(xiàn)10-HDA 不僅降低了三惡性乳腺癌細(xì)胞（TNBC） 的細(xì)胞存活率，而且10-HDA 處理細(xì)胞后，顯著抑制TNBC 的侵襲、粘附和釋放，對侵襲性乳腺癌細(xì)胞具有抗轉(zhuǎn)移活性[23]。

2.6 抗輻射活性

Zheng(2012)等人的研究表明了10-HDA 對紫外線（UV） A 誘導(dǎo)的人皮膚成纖維細(xì)胞（HDFs） 的保護(hù)作用。10-HDA 通過抑制紫外線A 誘導(dǎo)產(chǎn)生細(xì)胞毒性和活性氧(ROS)，和刺激膠原蛋白生成，來達(dá)到保護(hù)HDF 的目的。此外，10-HDA 在轉(zhuǎn)錄和蛋白質(zhì)水平上均抑制UVA 誘 導(dǎo) 的 MMP-1 和 MMP-3 表 達(dá)。10-HDA 處理還減少了UVA 誘導(dǎo)的JNK 和p38 MAPK 途徑的激活[24]。另有Park(2011)等人的研究表明，10-HDA 可與蜂王漿中其他脂肪酸組分發(fā)生協(xié)同作用，通過刺激UVB 誘導(dǎo)的NHDF 中TGF-β1 的產(chǎn)生來上調(diào)I 型膠原蛋白的水平[25]。

2.7 降血糖活性

Xu(2002)等人已發(fā)現(xiàn)該脂肪酸可改善大鼠模型的高脂血癥狀況[26]。此外，Takikawa(2013)等人的針對L6 肌管的體外研究以及針對小鼠的體內(nèi)研究均表明10-HDA 通過AMP 激活的蛋白激酶活化和GLUT4 轉(zhuǎn)運(yùn)至質(zhì)膜來增強(qiáng)胰島素非依賴性肌肉葡萄糖攝取[27]。

2.8 神經(jīng)調(diào)節(jié)活性

Terada(2011)等人證明10-HDA 和10- 羥基-2-癸烯酸是人類TRPA1 和TRPV1 受體的有效激動劑[28]。此外，Hattori (2007)等人的研究表明10-HDA 刺激了大鼠胚胎神經(jīng)干細(xì)胞的神經(jīng)元分化，可能起著ω-3 二十二碳六烯酸的作用。ω-3 二十二碳六烯酸是一種必需的飲食成分，已知會促進(jìn)中樞神經(jīng)系統(tǒng)的神經(jīng)發(fā)生。二十二碳六烯酸被認(rèn)為對大腦發(fā)育和功能必不可少， 并且已在大鼠帕金森氏模型中顯示出積極作用，這表明10-HDA 的潛力相似，此外，由于10-HDA 是較小的分子，它還可以更容易地穿過血腦屏障[29]。Hirakawa(2010)等人的關(guān)于合成中鏈脂肪酸的研究也表明了蜂王漿脂肪酸的神經(jīng)生成潛能，其中2- 癸烯酸乙酯（10-HDA 的衍生物） 促進(jìn)了大鼠模型的功能恢復(fù)[30]。另有Pyrzanowska(2012)等人的研究顯示，10-HDA 增加神經(jīng)元的生成[31]。

3 10-HDA 含量測定方法

鑒于10-HDA 作為蜂王漿的化學(xué)指標(biāo)已被普遍接受，測定10-HDA 含量的方法已有很多種。隨著色譜法以及其他相關(guān)技術(shù)的發(fā)展，分光光度法和色譜法等原始測定方法得到不斷的改進(jìn)與優(yōu)化。與此同時，新測定方法如雨后春筍般層出不窮，如ELISA法等。

3.1 分光光度法

目前對分光光度計(jì)的研究集中在最佳波長的選擇和樣品前處理的改進(jìn)上。

趙靜(1998)研究表明，使用三波長紫外光譜法來測定 10-HDA 的含量，可減輕干擾因子的影響，使傳統(tǒng)紫外光譜法帶來的測量結(jié)果偏高的問題得到改進(jìn)[32]。近年來出現(xiàn)了不需要將樣品事先分離即可消除共有組分的干擾的方法，如示差分光光度法，簡便準(zhǔn)確。

3.2 色譜法

李青(2000)等人先用一定量的甲醇萃取10-HDA，快速震蕩混勻1 min 后，取上清液， 然后通過大口徑毛細(xì)管交聯(lián)柱分離， 并使用氫火焰檢測器檢測，保持柱溫在180℃，進(jìn)樣口240℃，氣相色譜法直接測定，該方法消除了其他脂肪酸的干擾[33]。劉滿倉(1996)等人開發(fā)了一種只需稀釋的高效液相色譜方法[34]， 10-HDA 的測定變得更為方便省時。李蔚(2005)等人用Waters Oasis HLB 固相萃取小柱處理樣品，使樣品中的10-HDA 富集，其他雜質(zhì)用水洗去后，然后用少量甲醇洗脫10-HDA，以實(shí)現(xiàn)相當(dāng)程度的富集。該方法簡便，雜質(zhì)去除完全[35]。

3.3 酶聯(lián)免疫吸附法（ELISA）

潘榮生(2001)等人在測定10-HDA 時首次使用了這一方法，該方法的原理是先通過酯化保護(hù)10-HDA 中的原始羧基，再加入琥珀酸酐，與結(jié)構(gòu)另一端的羥基反應(yīng)，引入一個帶有羥基的“橋”。將這個“橋”通過混合酸酐法與載體蛋白偶聯(lián)，制備得到10-HDA 免疫原。酶聯(lián)免疫吸附法方便快捷且準(zhǔn)確， 通過和液相色譜法平行對比，結(jié)果符合率為95%[36]。

4 10-HDA 提取工藝

4.1 乙醚萃取法

定量稱量蜂王漿，將其溶解在乙醇中，離心后棄沉淀，加入1 ∶1 體積比的乙醚進(jìn)行萃取，震蕩，靜置10 min，分層后，使用分液漏斗分液，乙醚層在40℃常壓下用旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)器蒸出，然后將燒瓶中的殘留物溶于少量乙醇（約2 mL） 中，于低溫下靜置結(jié)晶。

4.2 乙醇萃取法

稱取一定量的蜂王漿放入三角燒瓶中，以1 ∶ 3 的比例加入95%的乙醇，充分振蕩， 靜置2 h，以5000 r／min 的轉(zhuǎn)速離心20 min，棄去沉淀，取上清液，向上清液中加入3 倍體積的去離子水進(jìn)行反萃取， 震蕩后放于-20℃冰箱中結(jié)晶5 h。結(jié)晶后，趁冷微濾，并將濾餅置于室內(nèi)風(fēng)干，然后將其移至真空干燥器中干燥60 min 左右后得最終產(chǎn)物10-HDA。

5 結(jié)語

21 世紀(jì)以來，隨著社會經(jīng)濟(jì)與生活水平的提高,人們對于功能性天然保健品的需求正在迅速增長?；谕鯘{酸10-HDA 具有多種生理學(xué)活性, 是純天然的生物保健品，10-HDA 存在著巨大的發(fā)展前景。 它對腫瘤起到有效的抑制作用，有作為放療和化療理想的輔助藥物的潛力, 有改善機(jī)體的免疫系統(tǒng)活性的功能，因此作為預(yù)防癌癥的新藥，市場更加廣闊。然而，目前10-HDA 抗癌具體工作機(jī)制尚未明確，對于10-HDA 與許多種類的腫瘤的作用研究也尚屬空白，還有許多工作需要深入探究。