李 越，李 晶，沈詩琪，楊雪清*

(1. 沈陽農(nóng)業(yè)大學(xué)植物保護(hù)學(xué)院，沈陽 110866；2. 西北農(nóng)林科技大學(xué)植物保護(hù)學(xué)院，陜西楊凌 712100)

中華地鱉EupolyphagasinensisWalker俗稱地鱉蟲、土元、土鱉蟲等，屬鱉蠊科地鱉或冀地鱉Steleophagaphancyi，其8～10齡雌蟲可入藥(國家藥典委員會，2000)，是我國一種重要的藥用昆蟲(陳梅生，2011)。由于其具有治療心血管疾病等藥理作用(付英杰等，2005；雷瓊，2011)，近年來被越來越多的人關(guān)注。研究表明，土鱉蟲發(fā)揮藥用作用主要是因為其體內(nèi)富含的蛋白質(zhì)、氨基酸等活性物質(zhì)(楊紅蓮和劉梅，2005)。中華地鱉體內(nèi)蛋白質(zhì)含量達(dá)60%以上(王鳳霞和吉愛國，2009)，體內(nèi)還幾乎包含了構(gòu)成蛋白質(zhì)的所有氨基酸及人體必需的7種氨基酸(周彥鋼和任玉翠，1998)。

工業(yè)化發(fā)展導(dǎo)致全球氣候逐漸變暖。預(yù)計至本世紀(jì)末，全球平均氣溫將升高1.5～4.5℃(戈峰等，2010；Hondetal., 2016)。中國作為氣候變暖最顯著的國家之一，預(yù)計未來將持續(xù)變暖(Teametal., 2015)。溫度是影響昆蟲生長發(fā)育最重要的因素(Hoffmann & Klaus, 2012)，高溫對昆蟲的影響主要表現(xiàn)在影響昆蟲的發(fā)育速度(Luoetal., 2005)、生殖(Maetal., 2004a)和存活率(Maetal., 2004b)。這種影響，可能會通過對生物大分子的結(jié)構(gòu)和功能改變而發(fā)生(杜堯等，2007)。然而，關(guān)于高溫對昆蟲的影響的研究主要集中于農(nóng)林業(yè)害蟲，在藥用昆蟲上很少有報道。中華地鱉人工飼養(yǎng)的室內(nèi)溫度應(yīng)維持在25～30℃(唐慶峰，2005)，但在夏季極端高溫天氣、飼養(yǎng)室控溫裝置故障或電力中斷，以及飼養(yǎng)密度較大等情況下，環(huán)境溫度迅速升高，中華地鱉將遭受高溫脅迫。盡管已有一些文獻(xiàn)對中華地鱉蛋白質(zhì)、氨基酸等活性成分進(jìn)行了測定和報道，但在全球變暖的背景下，高溫脅迫對中華地鱉體內(nèi)活性物質(zhì)的含量的影響尚不清楚。因此，本研究以中華地鱉8齡雌若蟲為研究對象，設(shè)置了適溫區(qū)較高溫度(29℃)、中等高溫(33℃)和高溫(37℃)三組處理組和對照(25℃)組，研究了短時高溫脅迫下中華地鱉體內(nèi)總氮量、蛋白質(zhì)、氨基酸等物質(zhì)含量的變化。研究結(jié)果為進(jìn)一步明確高溫對中華地鱉藥用價值的影響，以及為中華地鱉人工養(yǎng)殖條件提供理論依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 材料

供試中華地鱉卵鞘于2016年10月19日購自山東省臨沂市中藥材市場，在人工氣候箱(MLR-352H-PC，松下)中以溫度為25±1℃，相對濕度70%±1%，光照強度為2 Lx，光周期為16 L ∶8 D條件下令其孵化并飼養(yǎng)。孵化后的若蟲用人工飼料(潘紅平和鄧寅業(yè)，2014)進(jìn)行喂養(yǎng)。人工飼料是由麥麩(購于山東濟(jì)寧那一村莊農(nóng)家糧)、花生粉(購于江蘇淮安休閑戶外漁具店)和魚骨粉(PESQUERA HAYDUK S.A)按照4 ∶5 ∶1的比例以及少量蒸餾水(135 mL)炒制而成的。制作之前用高溫滅菌鍋(ToMY KG-SX-500, Niigata, Japan)在120℃條件下滅菌20 min，制作完成后，裝入滅菌完畢的長方形塑料盒中(13 cm×8.5 cm×5 cm)密封，放入4℃冰箱保存。飼料投喂時，切成方形，以利于中華地鱉取食。待若蟲生長至8齡，挑選大小基本一致的雌若蟲進(jìn)行試驗。

1.2 方法

將8齡雌若蟲放置在飼養(yǎng)盒(32 cm×22 cm×15 cm)中，并分別于25℃(對照)，29℃、33℃、37℃恒溫培養(yǎng)箱(HPX-9082 MBE，上海博迅)中進(jìn)行2 h高溫脅迫處理，試驗設(shè)3次重復(fù)。

1.2.1短時高溫脅迫對中華地鱉存活率的影響

從每個溫度處理中隨機(jī)挑取100頭若蟲，統(tǒng)計存活率，用毛筆輕撥試蟲，不動則為死亡。

1.2.2短時高溫脅迫對中華地鱉氮含量及蛋白質(zhì)的影響

從每個處理的飼養(yǎng)盒中分別隨機(jī)挑選出30頭若蟲，每10頭為1個重復(fù)，用液氮速凍后放入坩堝中研磨，-80℃留存待測(樣品中含水量為0%)。總氮量測定采用凱氏定氮法(陳智慧等，2008)。由于蛋白質(zhì)中含氮量比較恒定，可由其氮含量計算蛋白質(zhì)含量，故蛋白質(zhì)含量的測定采用凱氏定氮法進(jìn)行測量(羅美蘭等，2013；趙武玲，2013)，計算公式為：蛋白質(zhì)含量(%)=含氮量×6.25。

1.2.2短時高溫脅迫對中華地鱉氨基酸含量的影響

采用檀華蓉的方法測定中華地鱉體內(nèi)總氨基酸及游離氨基酸含量。

1.3 數(shù)據(jù)處理

試驗所得數(shù)據(jù)結(jié)果采用SPSS Statistics 20軟件進(jìn)行單因素方差分析，處理間的多重比較采用LSD方法分析，結(jié)果采用GraphPad Prism 5軟件作圖。

2 結(jié)果與分析

2.1 短時高溫脅迫對中華地鱉存活率的影響

中華地鱉8齡雌若蟲經(jīng)29℃、33℃、37℃高溫脅迫處理2 h后，存活率均為100%，且與對照(25℃)相比無差異。與對照組相比，短時高溫脅迫對中華地鱉雌若蟲活力也無明顯影響。

2.2 短時高溫脅迫對中華地鱉體內(nèi)氮含量及蛋白質(zhì)的影響

結(jié)果表明，中華地鱉8齡雌若蟲體內(nèi)氮含量與對照(25℃)(13.52%±0.26%)相比，29℃(12.02%±0.87%)、33℃(12.74%±0.15%)、37℃(12.32%±0.11%)3個高溫處理2 h后總氮量均明顯減少(F3,7=5.122，P=0.035)；而3個高溫處理組間總氮量無顯著差異。

短時高溫脅迫后中華地鱉8齡雌若蟲體內(nèi)蛋白質(zhì)含量顯著降低(F3,7=9.190，P=0.008)。3個高溫處理組間蛋白質(zhì)含量無顯著差異(圖1)。

圖1 短時高溫脅迫對中華地鱉體內(nèi)蛋白質(zhì)含量的影響Fig.1 Effects of short term high temperature stress on protein content of Eupolyphaga sinensis注：柱子上方的不同字母表示基于LSD方法的平均值±標(biāo)準(zhǔn)誤間的差異顯著(P≤0.05)。下圖同。Note: Letters above the bars represent statistically significant differences (P≤0.05) of mean ± SE by LSD test.The same below.

2.2 短時高溫脅迫對中華地鱉體內(nèi)氨基酸含量的影響

2.2.1短時高溫脅迫對中華地鱉體內(nèi)總氨基酸含量的影響

經(jīng)29℃高溫處理2 h后，中華地鱉8齡雌若蟲體內(nèi)氨基酸含量升高，明顯高于(F3,6=6.214，P=0.029)對照組和另外2個高溫處理組；33℃和37℃高溫處理與對照組8齡雌若蟲體內(nèi)氨基酸含量無明顯差異(圖2)。

圖2 短時高溫脅迫對中華地鱉體內(nèi)總氨基酸含量的影響Fig.2 Effect of short term high temperature stress on amino acid content of Eupolyphaga sinensis

2.2.2短時高溫脅迫對中華地鱉體內(nèi)游離氨基酸含量的影響

通過實驗測得中華地鱉體內(nèi)各種游離氨基酸含量，并對其體內(nèi)含有的人體必需的7種游離氨基酸進(jìn)行比較。結(jié)果顯示，29℃處理下中華地鱉體內(nèi)蘇氨酸(Thr)、甲硫氨酸(Met)、異亮氨酸(Ile)、亮氨酸(Leu)、苯丙氨酸(Phe)、賴氨酸(Lys)明顯高于對照(29℃)和更高溫度處理組(33℃、37℃)，纈氨酸(Val)各組差異不顯著；在中華地鱉體內(nèi)未檢測到色氨酸(Trp)(表1)。

3 結(jié)論與討論

高溫對昆蟲正常的生命活動有重要的影響(杜堯等，2007)，甚至?xí)绊懤ハx的存活率。二化螟Chilosuppressalis幼蟲經(jīng)36℃高溫脅迫4 h，發(fā)育時間比在24℃下明顯延長(羅舉等, 2005)；而在33℃下處理8 h，麥長管蚜Metopolophiumdirhodum的死亡率達(dá)90%(Maetal., 2004b)。高溫對昆蟲的影響，主要表現(xiàn)為導(dǎo)致昆蟲體內(nèi)失水、改變細(xì)胞內(nèi)離子濃度、破壞細(xì)胞骨架、使神經(jīng)傳導(dǎo)紊亂和造成蛋白質(zhì)、DNA等生物大分子結(jié)構(gòu)和功能改變(杜堯等，2007)。關(guān)于高溫對昆蟲的影響的研究主要集中于農(nóng)林業(yè)害蟲，在藥用昆蟲中鮮有報道。

本研究表明，短時高溫脅迫(29℃、33℃、37℃)對中華地鱉8齡雌若蟲存活率無明顯影響，但對中華地鱉體內(nèi)總氮量、蛋白質(zhì)、氨基酸含量有顯著影響。具體表現(xiàn)為，29℃、33℃和37℃短時高溫處理后，中華地鱉體內(nèi)總氮量和蛋白質(zhì)含量與對照(25℃)相比均明顯下降；29℃短時高溫處理后中華地鱉氨基酸含量較對照和33℃、37℃高溫處理組均顯著升高。中華地鱉富含蛋白質(zhì)和氨基酸，氨基酸組分直接參與蛋白質(zhì)、酶的合成，是中華地鱉具有藥用價值的主要活性成分(王鳳霞和吉愛國，2009)。因此，高溫對中華地鱉體內(nèi)蛋白質(zhì)和氨基酸有影響，直接影響中華地鱉的藥用價值。周彥鋼和任玉翠(1998)研究表明，人體必需的8種氨基酸占總氨基酸含量的34.5%，以甘氨酸、谷氨酸、天冬氨酸、酪氨酸、精氨酸和賴氨酸含量最高。另一研究報道，中華地鱉中含有的人體必需的8種氨基酸占總氨基酸含量的45.9%，含量最高的前8種氨基酸依次是丙氨酸、亮氨酸、纈氨酸、天冬氨酸、谷氨酸、賴氨酸、蘇氨酸和絲氨酸(檀華蓉，1997)。本研究表明，中華地鱉8齡雌若蟲中含量最高的8種氨基酸為谷氨酸、酪氨酸、甘氨酸、天冬氨酸、丙氨酸、纈氨酸、亮氨酸、精氨酸，這與前人結(jié)果(張勤，1998；周彥鋼和任玉翠，1998)不是完全一致。本研究中，在中華地鱉種體內(nèi)未檢測到色氨酸，這與前人研究結(jié)果相符，可能是中華地鱉體內(nèi)不含色氨酸，亦或是其含量較低超出了所采用的檢測方法的檢測限。此外，研究發(fā)現(xiàn)，29℃短時高溫處理后多種游離氨基酸含量較其他高溫處理組及對照組均有顯著升高。類似的結(jié)果在甜菜夜蛾Spodopteraexigua中也有報道(Cohenaetal., 1982)。因此，在中華地鱉人工飼養(yǎng)過程中，適當(dāng)進(jìn)行短時臨界高溫處理可以提高其藥用價值。然而，為何氨基酸含量在29℃短時處理后有明顯升高，但在更高溫度(33℃和37℃)脅迫后有無明顯升高，有待在后續(xù)研究中探討。

本研究對短時高溫脅迫下8齡雌若蟲總氮量、蛋白質(zhì)和氨基酸含量進(jìn)行了測定。高溫脅迫是否對雄蟲、其他生長發(fā)育階段的雌蟲的總氮量、蛋白質(zhì)和氨基酸含量也有類似影響，有待進(jìn)一步研究。

昆蟲對高溫脅迫的響應(yīng)，可以表現(xiàn)為提高熱適應(yīng)性(或耐熱性)，其主要的途徑為誘導(dǎo)熱激蛋白的產(chǎn)生(杜堯等，2007)。昆蟲體內(nèi)熱激蛋白表達(dá)量與耐熱性呈正相關(guān)，即熱激蛋白表達(dá)量越高昆蟲耐熱性越強，這在多種昆蟲中得到了證實(Leetal., 2011; Chenetal., 2014; Hondetal., 2016; Yangetal., 2016)。因此，短時高溫脅迫是否對中華地鱉熱激蛋白合成，以及對與熱激蛋白合成通路上相關(guān)蛋白合成與代謝產(chǎn)生影響有待后續(xù)進(jìn)一步研究。

本研究結(jié)果表明，短時高溫(29℃、33℃、37℃)脅迫降低了中華地鱉總氮量和蛋白質(zhì)含量，29℃短時脅迫提高了中華地鱉總氨基酸含量和蘇氨酸(Thr)、甲硫氨酸(Met)、異亮氨酸(Ile)、亮氨酸(Leu)、苯丙氨酸(Phe)、賴氨酸(Lys)等6種人體必需游離氨基酸含量。研究結(jié)果將為進(jìn)一步明確高溫對中華地鱉的藥用價值的影響，以及為中華地鱉人工養(yǎng)殖條件的提供理論依據(jù)，豐富和加深人們對氣候變暖對昆蟲影響的認(rèn)識。