丁丹丹，馬婷玉，陳士林，冷梁，黃盛群，謝剛，向麗*

1.中國中醫(yī)科學院 中藥研究所/北京市中藥鑒定與安全性檢測評估重點實驗室，北京 100700；2.廣西仙草堂制藥有限責任公司，廣西 柳州 545400

青蒿素是治療間日瘧、惡性瘧和抗氯喹瘧疾的首選藥物[1]，近幾年全球青蒿素年用量在180 t左右[2]，雖然早有研究可通過人工合成的方法合成青蒿素[3-4]，但由于成本和效率等問題難以大規(guī)模生產(chǎn)[5]，目前主要依靠從黃花蒿植物中提取的方法。除了我國少部分地區(qū)外，全球大部分區(qū)域的黃花蒿中青蒿素含量都在0.2%以下，不具有提取價值[6-7]。相關研究[8-10]發(fā)現(xiàn)，黃花蒿在我國海南、湖南、廣西等地適宜生長；重慶、四川等地和低海拔地區(qū)黃花蒿抗瘧效果較好；海南省降水充沛、光熱量足，與黃花蒿高溫喜濕的生物學特性一致[8]，野生資源青蒿素含量較高。目前，黃花蒿主要依靠人工栽培，但是不同產(chǎn)地、不同品種黃花蒿中青蒿素含量存在顯著差異，生產(chǎn)栽培技術不夠規(guī)范導致栽培的黃花蒿質量良莠不齊。青蒿酸、雙氫青蒿酸、青蒿乙素均是青蒿素生物合成的前體物質[11-12]。課題組經(jīng)過多年混合選育，獲得青蒿素含量高達2.11%的新品種“研青一號”(YQ1)，并對青蒿素及其前體物質進行了含量測定，基于重測序篩選其Indel分子標記，采用藥用植物全球產(chǎn)地生態(tài)適宜性信息系統(tǒng)(GMPGIS)預測了其適宜種植范圍，并總結了規(guī)范化栽培技術體系，為降低原料成本、獲得高品質青蒿素原料提供保障。

1 材料與方法

1.1 “研青一號”植株形態(tài)特征

試驗材料包括YQ1以及來自海南栽培種(HQ1)、湖南的栽培種(HUN)以及海南的2個野生種(HN1、HN3)。在采收期(8月中上旬)測量其株高、冠幅、地上莖粗、分枝數(shù)、分枝角度、葉片面積及單株干葉質量。葉片面積使用Image J軟件對黃花蒿植株一級分枝上葉片進行面積計算，每個品種測量30株。

在種子成熟期，對每個品種隨機抽取30粒用于形態(tài)觀察。首先將種子置于平底玻璃片(5 cm×10 cm)上，在TOUPCAM顯微鏡4倍視野下觀察，使用Toup View軟件量取30粒種子的最長、最寬數(shù)據(jù)并記錄；選用體式顯微鏡拍照觀察并描述其形態(tài)與差異，見圖1。選擇百粒法測定黃花蒿種子千粒質量。每個批次隨機抽測100粒種子，使用十萬分之一天平稱定質量，進行6個重復。按公式(1)(2)對不同品種黃花蒿種子的發(fā)芽率、發(fā)芽勢進行測定，將100粒黃花蒿種子均勻灑在實驗濾紙上，使之保持濕潤，每批樣品3次重復。發(fā)芽條件：溫度20 ℃，相對濕度40%，20%光照8 h。胚根與種子等長或稍長，2片子葉展開者視為正常發(fā)芽并統(tǒng)計。連續(xù)3 d不發(fā)芽視為發(fā)芽結束。

發(fā)芽率=發(fā)芽種子總數(shù)/供試種子總數(shù)×100%

(1)

發(fā)芽勢=前5 d發(fā)芽種子總數(shù)/供試種子總數(shù)×100%

(2)

1.2 青蒿素類化合物含量測定

在黃花蒿采收期，對5個品種進行青蒿素、青蒿乙素、青蒿酸和雙氫青蒿酸含量測定，每個品種測定30個單株。

采用超高效液相色譜-串聯(lián)質譜檢測法(UPLC-QQQ-MS)進行青蒿素類化合物含量測定。青蒿素(批號：CFS201801，純度≥99%)、雙氫青蒿酸(批號CFS201801，純度≥98%)、青蒿酸(批號：CFS201702，純度≥99%)、青蒿乙素(批號：CFN98807，純度≥98.0%)均購于武漢天植生物技術有限公司；甲醇、乙腈為色譜純 (美國Fisher公司)；乙酸(分析純，北京化工廠)；甲酸、甲酸銨(色譜純，上海阿拉丁生化科技股份有限公司)；娃哈哈純凈水(杭州娃哈哈集團有限公司)。Eclipse Plus C18(2.1 mm×50 mm，1.8 μm)色譜柱，美國Agilent UPLC-MS系統(tǒng)[1290系列超高效液相色譜儀、6470 型三重四極桿質譜儀(安捷倫科技有限公司)]；XS105型十萬分之一電子分析天平(METTLER TOLEDO公司)；舒美KQ-500DE型數(shù)控超聲波清洗器(功率100 W，昆山市超聲儀器有限公司)；BS210S型萬分之一電子分析天平(德國賽多利斯公司)。

取青蒿素、青蒿乙素、雙氫青蒿酸、青蒿酸對照品適量，分別精密稱定，加甲醇制成對照品溶液。取植物樣品適量，粉碎，精密稱取0.1 g，置于50 mL離心管中，加入甲醇10 mL。超聲提取30 min，放冷后吸取適量溶液稀釋1000倍，濾過，即得樣品溶液。

注：A.HUN；B.HN1；C.HQ1；D.HN3；E.YQ1。圖1 不同來源黃花蒿種子于體視顯微鏡下的形態(tài)

青蒿素、青蒿乙素流動相：0.1%甲酸10 mmol·L-1-甲酸銨水溶液(A)-乙腈(B)；梯度洗脫(0～5 min，5%～100%B；5～7 min，100%B)，后運行2 min。柱溫：30 ℃，進樣量：1 μL，流速：0.3 mL·min-1。離子源：電噴霧離子源(ESI)，掃描方式：正離子模式，MRM模式進行檢測。外標法計算濃度。青蒿素母離子：283.2，子離子：265.1、247.1，電壓：135 V，能量：5；青蒿乙素母離子：249.1，子離子：189.1，能量：9，子離子：143.1，能量：24，電壓：130 V。

青蒿酸、雙氫青蒿酸流動相：0.05%乙酸水溶液(A)-甲醇(B)；等度洗脫(0～3 min，85%B)，后運行2 min。柱溫：30 ℃，進樣量：1 μL，流速：0.3 ml·min-1。離子源：電噴霧離子源(ESI)，掃描方式：負離子模式，SIM模式進行檢測。青蒿酸母離子：233.2，電壓：140 V；雙氫青蒿酸母離子：235.2，電壓：140 V。

以峰面積積分值為縱坐標(Y)，對照品進樣濃度(ng·mL-1)為橫坐標(X)，繪制標準曲線，青蒿素：Y=729.95X+10 575，r=0.999 9；青蒿乙素：Y=2 327.8X+421.24，r=1；青蒿酸：Y=16 362X+23.033，r=0.999 6；雙氫青蒿酸：Y=4 907.8X-7 124.6，r=0.999 8。線性關系良好，精密度、重復性、穩(wěn)定性試驗合格。

1.3 基于重測序的InDel分子標記篩選

1.3.1InDel標記的鑒定及引物設計 使用Burrows-Wheeler Alignmet(BWA)將15個品系比對到基因組上(每個品系2～3個重復，共34個重測序樣本)，然后使用GATK流程在比對后的重測序樣本中注釋出每個品系特異的缺失突變(InDel)。選擇YQ1品系的3個重復樣本RS4、RS17以及RS30的特異缺失突變，取InDel 位點兩翼各500 bp堿基長度，共1000 bp片段長度使用Primer 5.0進行引物設計。上游設計在1～500 bp，下游設計在500～1000 bp，篩選YQ1特征性的缺失突變位點。

1.3.2PCR擴增和電泳 材料來自于7份常規(guī)栽培及野生黃花蒿種質資源，包括YQ1、HQ1、HN1、HN3、HUN、GZ(貴州)、XZ(西藏林芝米林縣)，2018年種植于北京懷柔實驗基地。采取幼苗期葉片，采用基因組DNA提取試劑盒(TIANGEN Hi-DNAsecure Plant Kit DP350)。PCR 反應體系為25 μL，其中DNA 模板(15 ng·μL-1) 2 μL，2×TaqMix酶(2.5 U·μL-1) 8.5 μL，上游引物(10 μmol·L-1) 1·μL，下游引物(10 μmol·L-1) 1 μL，ddH2O 12.5 μL。PCR 反應程序：94 ℃ 5 min；94 ℃ 30 s，56 ℃ 30 s，72 ℃ 1 min，35個循環(huán)；72 ℃ 10 min；4 ℃保存。6%聚丙烯酰胺凝膠電泳，電壓120 V，電泳時間20 min。顯色后照相保存。

1.4 “研青一號”全球產(chǎn)地適宜性分析

運用GMPGIS系統(tǒng)對“研青一號”全球適宜生產(chǎn)區(qū)域進行預測。根據(jù)“研青一號”多點多年試驗結果，將海南省、重慶市、四川省、廣西省、湖南省等132個試驗點經(jīng)緯度導入GMPGIS系統(tǒng)，生成shape文件，在基礎地理信息數(shù)據(jù)庫、氣候因子數(shù)據(jù)庫等相關數(shù)據(jù)庫的支持下，進行“研青一號”的生態(tài)因子值分析及全球產(chǎn)地適宜性分析。

2 結果與分析

2.1 選育過程

2013年通過收集比較全國黃花蒿野生及栽培種質資源523份，發(fā)現(xiàn)來自廣西融安縣的1份種質資源青蒿素含量較高，>2.0%，同時采用高光照射和組織培養(yǎng)方法，對該品系的植株緊湊、矮化的株系進行保留、擴繁并單獨留種。經(jīng)過3年多技術混合選育，獲得平均青蒿素含量達2.11%的新品種“研青一號”，并于2017、2018年在四川省宜賓市、重慶市酉陽縣、海南省?？谑?、廣西省融安縣、湖南省祁陽縣、北京市懷柔縣、江蘇省無錫市進行了多點試驗。

2.2 植株形態(tài)特征

“研青一號”植株整體表型較為一致，主要呈圓塔形生長，平均株高為(124.0±25.5) cm，較其他種質資源黃花蒿矮，生育期240～250 d；其株型緊湊，平均冠幅為(93.4±14.0) cm。葉色正綠色，葉片普遍稍大，平均葉片面積為(11.2±3.2) cm2。植株腺毛密度高，氣味濃郁，平均單株葉片干質量為(211.9±48.1) g。種子表面圓潤，有淺棕色溝紋，基部漸尖，長寬比為2.0±0.1，千粒質量(35.0±1.7) mg?！把星嘁惶枴痹诘?和第4天開始發(fā)芽，主要集中于第4天至第6天，第7天和第8天后發(fā)芽率開始降低，發(fā)芽率為(79.0±10.5)%。因此，“研青一號”植株呈圓塔型，矮小、緊湊、葉片較大，生育期長，能與其他品種進行明顯區(qū)分(見表1)。

表1 “研青一號”植性狀特征及青蒿素含量

2.3 青蒿素類化合物含量測定

由圖2可知，與4個對照比較，YQ1青蒿素含量最高，平均為(2.11±0.38)%，最高達2.70%；同時雙氫青蒿酸含量也最高，平均為(0.33±0.07)%，最高達0.53%；青蒿乙素和青蒿酸含量卻是5個品種中最低的。對照品種內4種化合物含量變化趨勢基本一致，青蒿素和雙氫青蒿酸含量較高，青蒿酸和青蒿乙素含量較低，青蒿素含量比重最大。HN1青蒿乙素和青蒿酸含量最高，分別為(0.06±0.03)%和(0.02±0.01)%，最高為0.06%。

注：A.青蒿素;B.青蒿乙素;C.雙氫青蒿酸;D.青蒿酸。圖2 不同黃花蒿中青蒿素、青蒿乙素、青蒿酸、雙氫青蒿酸含量測定結果

將植株性狀與青蒿素類化合物含量進行相關性分析，青蒿素含量與雙氫青蒿酸含量正相關，r=0.625 7。青蒿酸和青蒿乙素含量顯著正相關，r=0.834 8。青蒿素、雙氫青蒿酸含量與植株的葉面積呈正相關，與株高、冠幅、地上莖粗、分枝數(shù)、分枝角度負相關，但相關系數(shù)并不顯著。植株主要性狀與葉片產(chǎn)量相關性分析結果表明，植株產(chǎn)量與株高、冠幅、地上莖粗、分枝數(shù)、分枝角度、葉片數(shù)皆呈正相關，其中冠幅與產(chǎn)量的相關性最高，r=0.613 5。結合青蒿素含量及植株產(chǎn)量分析，人工培育新品種時可選擇植株緊湊，冠幅適中，二級分支數(shù)多，葉面積較大的株系。

2.4 特異性、一致性、穩(wěn)定性分析

特異性：“研青一號”與4個栽培和野生優(yōu)良品系比較，特異性明顯，植株呈圓塔型，植株緊湊、矮小，一級分支和二級分支夾角小，生育期長；青蒿素和雙氫青蒿酸含量最高，平均值分別為(2.11±0.38)%和(0.33±0.07)%。

一致性：對“研青一號”主要性狀指標變異系數(shù)進行分析，其植株形態(tài)、葉色、花色、種子顏色全部一致，株高、冠幅、葉面積、一級分支角度、二級分支角度、種子長寬比、種子千粒質量、青蒿素含量、雙氫青蒿酸含量等指標的變異系數(shù)都符合一致性要求。

穩(wěn)定性：“研青一號”于2017、2018年在四川省宜賓市、重慶市酉陽縣、海南省?？谑?、廣西省融安縣、湖南省祁陽縣、北京市懷柔縣、江蘇省無錫市進行了多點試驗。除北京市懷柔縣基地的樣品青蒿素含量有降低外，其余基地植株性狀表現(xiàn)較穩(wěn)定，青蒿素含量均在2.0%以上，穩(wěn)定性較好。

2.5 基于基因組重測序的 Indel分子標記篩選

重測序及序列比對結果表明，黃花蒿每個品系的缺失突變數(shù)量為 76 971～114 174個?！把星嘁惶枴?個重復樣品RS4、RS17以及RS30的特異缺失突變分別為91 288、96 812、99 827個。隨機篩選出InDel標記45條，其中有16條序列的Indel片段>590 bp，對這16條序列進行引物設計，共設計引物32對。以7份黃花蒿材料基因組DNA為模板，用PCR方法檢測32對引物有效性。其中AaIn101(AaIn101F：GACTATGTTTAGCGCGGAGC，AaIn101R：TGGCACTACTTTATCATATCAAATC)和AaIn110(AaIn110F1：GTTCTAGACTCGGGCCTTAGC，AaIn110R1：CTGGC-TGTGCCATGTTTCTG)可以在“研青一號”中出現(xiàn)特異條帶，而在其他6份材料中無條帶(見圖3)，可作為“研青一號”的特異分子標記，用于區(qū)分“研青一號”和其他產(chǎn)地黃花蒿種質。

注：A.AaIn110；B.AaIn101；1.YQ1；2.GZ；3.XZ；4.HUN；5.HQ1；6.HN1；7.HN3。圖3 引物 AaIn101 和AaIn110對7份黃花蒿種質資源的擴增結果

2.6 “研青一號”全球產(chǎn)地適宜性分析

通過對“研青一號”基點的GMPGIS分析，得出“研青一號”主要分布區(qū)域的生態(tài)因子值范圍：最冷季均溫4.5～18.9 ℃，最熱季均溫24.4～28.6 ℃，年均溫14.9～24.3 ℃，年均相對濕度68.61%～77.35%，年均降水量987～1688 mm，年均日照124.96～145.47 W·m-2，土壤類型以強淋溶土、高活性強酸土、暗色土、人為土、黑鈣土、鐵鋁土等為最多。

根據(jù)以上分析所得到的生態(tài)因子值范圍，利用加權歐式距離法計算得到“研青一號”的最大生態(tài)相似度區(qū)域(指相似度99.9%～100%的區(qū)域分布圖，見圖4)?！把星嘁惶枴痹趤喼薜倪m宜生長區(qū)域面積分布較大，多處于亞熱帶季風和季風性濕潤氣候。其中，中國適宜性分布區(qū)域面積最大，達1 020 446.59 km2、越南占38 609.57 km2、巴西占8 006.91 km2、日本占3 247.25 km2.。

“研青一號”在中國的最大生態(tài)相似度區(qū)域，主要分布在我國東南部，具體包括廣西壯族自治區(qū)、湖南、江西、廣東、湖北、浙江、福建、四川、貴州、重慶、海南等。其中面積最大的為廣西壯族自治區(qū)，適宜性分布區(qū)域面積達211 656.27 km2。根據(jù)GMPGIS分析結果可得，在我國東南部地區(qū)較適宜“研青一號”生長。

注：審圖號為GS(2020)2680號。圖4 “研青一號” 99.9%～100%最大生態(tài)相似度區(qū)域分布

3 “研青一號”無公害規(guī)范化栽培技術

3.1 種子繁殖

3.1.1選地與整地 “研青一號”生活能力較強，喜溫，根據(jù)多點試驗及GMPGIS分析結果，選擇我國東南部海拔在800 m以下林緣、荒地，氣候潮濕向陽，排水良好，疏松肥沃的沙壤土，未連作地塊來進行種植較好。

播種前，對苗床進行精細耕作，使土地平整，土壤疏松，然后澆水使土壤潤透，制作寬1.2 m、高20 cm的壟面，排水溝寬30 cm。

3.1.2播種時間 海南最佳育苗時間為11—12月；其余地區(qū)在1—2月播種較好。

3.1.3播種方法 播種前將種子與沙土拌勻，每1 g種子用4000～5000 g干細泥沙，然后均勻灑向床面，播種完成后，在苗床表面加播一層薄薄的草木灰，以遮住種子為度，再在苗床上覆蓋一層地膜，以保持溫度，便于種子萌發(fā)。每1 g種子可播15 m2，可種2664～3996 m2。

3.1.4苗床管理 播種7 d后，要勤時揭膜，觀察苗床情況，通過揭膜通風和及時灑水使之保持合適的溫濕度。種苗長到5 cm左右時可將地膜去掉，從苗床兩端先撤，通過煉苗提高種苗的生長適應能力。

煉苗期間視情況而定，可用1.5 L水配50 g尿素加150 g復合肥配成的尿素水或者經(jīng)30%稀釋的農(nóng)家肥催苗，施水肥后需用清水補淋1次，苗高10～15 cm主莖變硬時即可進行大田移栽。

3.2 移栽定植

3.2.1移栽時間 3—4月。

3.2.2選地整地 選擇氣候溫暖向陽，排水良好，疏松肥沃的沙壤土地，土地翻耕后，起廂寬1.2 m，起壟寬0.6 m、高0.3 m，溝寬0.4～0.5 m。坡地耕后可直接種植，但注意不能種在起溝起槽的凹地處。每株移栽前在距根部4.5～6 cm間施100 g有機肥和30～40粒復合肥(硫酸鉀型15+15+15)混合作底肥。

3.2.3拔苗移栽 當苗長到10～15 cm時，選擇在晴天下午或陰天按1 m×0.9 m間距移栽。若苗床干結，用清水淋濕后再拔苗，當天種完。種植深度3～5 cm，種植后及時澆透定根水，保證成活率。

3.3 田間管理

種苗存活后，可在40、70 d左右生長期中進行第2次、第3次施加專用復合肥，每666 m2施加2 kg，沿植株冠幅邊緣垂直線挖穴、放肥、蓋土3～4 cm，避免肥料揮發(fā)流失及燒苗。移栽后及時檢查種苗的存活情況并補苗，移栽初期及時清理雜草，后期由于植株生長旺盛，可不用考慮除草問題。“研青一號”在排水不良的潮濕地帶生長較差，干旱時期要及時澆水，雨季則注意清溝、防漬排澇。

3.4 病蟲害防治

“研青一號”病蟲害并不嚴重，但在栽培過程中，由于連作[13]、氣候變化、通風差[14-15]等原因可能會出現(xiàn)部分病蟲害，主要病蟲害為莖腐病、白粉病、黃萎病、蚜蟲、小地老虎等。

3.4.1病害防治 莖腐病在高溫多雨時節(jié)較易發(fā)生，根皮部及莖內木質部發(fā)黑、脫落，在發(fā)病初期可以噴淋1%硫酸亞鐵溶液、70%甲基托布津500倍液，隔7～10 d噴1次防治，防治2～3次。

白粉病主要發(fā)病期在6—7月，白粉遍布全株，由老葉向新葉發(fā)展，可用可濕性粉銹靈兌水500～800倍進行噴霧防治。

黃萎病主要發(fā)病期在6—7月雨后高溫天氣時，染病植株從下部一些葉片開始黃化，逐漸向上擴展，最終導致整個植株黃萎病死。發(fā)病初期施用50%多菌靈可濕性粉劑450倍液，隔7～10 d噴1次防治，防治2～3次。

3.4.2蟲害防治 蚜蟲常大量附著在嫩葉、莖尖部位，可用20%速滅丁或蚜虱凈等噴霧防治；小地老虎會將苗床內或剛移栽至大田的幼苗近地面莖部咬斷，造成整株病死，每666 m2可用90%敵百蟲30倍水溶液150 mL拌5 kg菜葉、鮮草制成毒草進行誘殺。

3.5 采收與儲藏

“研青一號”大量采收時，選擇晴天早上將全株從基部割倒，在曬場或屋檐下晾曬或陰干，待葉變?yōu)楹稚屹|地呈焦脆狀時，可用棒敲或老式打谷機將葉子打下來，挑去小枝梗和雜質，打包裝袋，于避光通風處保存。

4 討論與展望

青蒿素作為抗瘧一線藥物，屬于我國戰(zhàn)略資源[16]?！把星嘁惶枴苯?jīng)長期選育，在栽培過程中表型漸為穩(wěn)定，株型緊湊，青蒿素含量平均值較高。采用分子標記可以快速輔助藥用植物品種選育[17-19]。參考黃花蒿全基因組信息[20]，基于34份重測序分析，篩選獲得2對特異性 InDel引物，可區(qū)分 “研青一號”與其他產(chǎn)地的黃花蒿種質資源。由于黃花蒿為異花授粉植物，且野外存在大量黃花蒿資源，因此在栽培過程中容易發(fā)生退化，雖然現(xiàn)在黃花蒿品種青蒿素含量已經(jīng)較前期(0.8%)提高了2～3倍，但后期需要進行持續(xù)優(yōu)化，保持品種的穩(wěn)定性和優(yōu)良性，并通過規(guī)范化種植，保持我國在青蒿素原料方面的優(yōu)勢地位。