王 昱, 時(shí)文強(qiáng), 郭亞敏, 盧世國(guó), 劉娟娟

(1. 蘭州理工大學(xué) 能源與動(dòng)力工程學(xué)院, 甘肅 蘭州 730050; 2. 蘭州理工大學(xué) 甘肅省生物質(zhì)能與太陽(yáng)能互補(bǔ)供能系統(tǒng)重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室, 甘肅 蘭州 730050)

隨著我國(guó)農(nóng)村城鎮(zhèn)化建設(shè)的快速發(fā)展，人民生活質(zhì)量顯著提升，村鎮(zhèn)居民人均用水量在不斷增加，致使村鎮(zhèn)污水排放量也逐年增大[1-2].然而，由于村鎮(zhèn)污水收集系統(tǒng)和無害化處理設(shè)施嚴(yán)重匱乏，大量未經(jīng)處理的污水無序亂流或直接排放，已經(jīng)造成眾多村鎮(zhèn)環(huán)境污染嚴(yán)重，加劇了我國(guó)水資源匱乏的危機(jī)，嚴(yán)重制約了村鎮(zhèn)和農(nóng)村經(jīng)濟(jì)的可持續(xù)發(fā)展.因此，生活污水凈化處理已經(jīng)成為我國(guó)農(nóng)村城鎮(zhèn)化發(fā)展亟需解決的難題之一[3].

微藻是大自然中廣泛存在的自養(yǎng)型微生物，其在生長(zhǎng)過程中，以CO2和碳酸鹽為碳源，以水體中的氮素為氮源，同時(shí)能夠以多種無機(jī)磷酸鹽為磷源，通過藻類細(xì)胞中的葉綠素進(jìn)行光能自養(yǎng)，完成細(xì)胞增殖并釋放氧[4].自20世紀(jì)50年代Oswald等提出利用藻類凈化污水以來[5]，國(guó)內(nèi)外對(duì)利用藻類凈化污水的研究也越來越多，并取得了較大進(jìn)展[6-8].研究表明，微藻在污水中生長(zhǎng)受到環(huán)境條件的約束，如生活污水中的氮磷濃度、環(huán)境溫度和光照條件等都會(huì)影響微藻的生長(zhǎng)速度和培養(yǎng)效率[9-11].由于我國(guó)北方地區(qū)氣溫年較差大，晝夜溫差大，限制了村鎮(zhèn)規(guī)?；囵B(yǎng)微藻深度凈化處理污水技術(shù)的發(fā)展.因此，本文基于生活污水培養(yǎng)小球藻的實(shí)驗(yàn)，探究環(huán)境因子(初始污水濃度、環(huán)境溫度、光照強(qiáng)度和光照時(shí)間)對(duì)小球藻的生長(zhǎng)影響，確定污水培養(yǎng)小球藻的最優(yōu)環(huán)境條件，為我國(guó)北方地區(qū)利用微藻高效深度凈化村鎮(zhèn)生活污水技術(shù)的發(fā)展奠定基礎(chǔ).

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1實(shí)驗(yàn)藻種

實(shí)驗(yàn)所用藻種是由甘肅省科學(xué)院生物研究所提供的小球藻(Chlorella)，藻種采用BG-11培養(yǎng)基[12]進(jìn)行傳代培養(yǎng)，保藏于4 ℃冰箱.

1.1.2培養(yǎng)液

1.2 實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì)

實(shí)驗(yàn)采用裝有300 mL生活污水培養(yǎng)基的錐形瓶(500 mL)，接種時(shí)，將活化至對(duì)數(shù)期的藻種，于無菌條件下接種到錐形瓶，使其初始OD680為0.2左右.針對(duì)我國(guó)北方地區(qū)晝夜溫差大，光照充足的特點(diǎn)，自制恒溫控光微藻培養(yǎng)裝置，控制培養(yǎng)環(huán)境的光溫條件.連續(xù)培養(yǎng)8 d，每天定時(shí)搖動(dòng)3～4次.每天定時(shí)取樣，測(cè)定小球藻液的光密度值.培養(yǎng)結(jié)束后，測(cè)定小球藻的干重.

1.3 實(shí)驗(yàn)方法

1.3.1藻細(xì)胞生長(zhǎng)測(cè)定

自接種日起，每24 h取樣一次，利用756s型號(hào)的紫外可見分光光度計(jì)，測(cè)定小球藻液在波長(zhǎng)為680 nm波長(zhǎng)處的吸光值，用OD680變化表征細(xì)胞的生長(zhǎng)情況.

1.3.2干重測(cè)定

小球藻的干重采用重量法測(cè)定[13]，20 mL小球藻液經(jīng)預(yù)稱重(W1)的微孔濾膜(φ0.45 μm)過濾、洗滌，于105 ℃下烘干至恒重(W2)，不加小球藻的空白對(duì)照組干重為W0，小球藻干重DW(g·L-1)的計(jì)算公式用式(1)計(jì)算：

DW=(W2-W1-W0)/0.02

(1)

1.3.3生長(zhǎng)速度測(cè)定

用比生長(zhǎng)速率表示小球藻的生長(zhǎng)速度，即比生長(zhǎng)速率(Specific growth rate，SGR)根據(jù)普通生物學(xué)通用的計(jì)算公式[11]，用式(2)計(jì)算：

μ=(LnNT-LnNt)/(T-t)

(2)

式中:NT為T時(shí)間的小球藻液細(xì)胞密度；Nt為t時(shí)間的小球藻液細(xì)胞密度；t、T為生長(zhǎng)時(shí)間.μ表示小球藻生長(zhǎng)速度，計(jì)算小球藻快速生長(zhǎng)階段的生長(zhǎng)速度平均值，單位為d-1.

1.3.4數(shù)據(jù)分析

采用SPSS 20進(jìn)行數(shù)據(jù)處理，應(yīng)用Origin Pro 9.0進(jìn)行作圖分析，利用正交實(shí)驗(yàn)直觀分析[14]方法對(duì)實(shí)驗(yàn)結(jié)果進(jìn)行分析.

2 實(shí)驗(yàn)結(jié)果與分析

2.1 單因素條件下環(huán)境因子對(duì)污水培養(yǎng)小球藻的影響結(jié)果

1) 初始污水濃度對(duì)小球藻的生長(zhǎng)速度及干重的影響結(jié)果

在環(huán)境溫度25 ℃、光照強(qiáng)度10 000 Lux、光照時(shí)間12 h的條件下，研究生活污水初始濃度分別為原水、稀釋2、4、6、8倍時(shí)對(duì)小球藻生長(zhǎng)速度和干重的影響，設(shè)3組平行實(shí)驗(yàn)，結(jié)果如圖1所示.

從圖1可以看出，初始污水濃度在原水和稀釋2倍之間時(shí)，小球藻的生長(zhǎng)速度隨污水濃度降低而急劇增大；初始污水濃度在稀釋2倍和稀釋8倍時(shí)，隨著污水濃度逐漸降低，小球藻的生長(zhǎng)速度緩慢下降.當(dāng)污水稀釋2倍時(shí)，小球藻的比生長(zhǎng)速率μ最大為0.096 2 d-1.統(tǒng)計(jì)分析表明，不同初始濃度下的小球藻生長(zhǎng)速度具有顯著性差異.初始污水濃度在原水和稀釋4倍之間時(shí)，小球藻的干重隨污水濃度降低而增加；初始污水濃度在稀釋4倍和稀釋8倍時(shí)，小球藻的干重隨污水濃度的降低而急劇減少.當(dāng)污水稀釋4倍時(shí)小球藻的干重DW最大為0.118 3 g·L-1.統(tǒng)計(jì)分析表明，不同污水濃度下的小球藻干重具有顯著差異.由圖1可知，小球藻在各初始濃度的生活污水中均能生長(zhǎng)，說明該藻種具有一定的耐污能力.當(dāng)生活污水稀釋2、4、6倍時(shí)小球藻的生長(zhǎng)狀況較好，稀釋2倍時(shí)小球藻的生長(zhǎng)速度最快，培養(yǎng)效果最佳.

未經(jīng)稀釋的生活污水初始氮、磷濃度和濁度較高，導(dǎo)致光透過率降低，影響小球藻的光合作用，抑制小球藻在污水中的生長(zhǎng).生活污水濃度過低時(shí)，雖提升了小球藻的光合作用，提高培養(yǎng)前期的生長(zhǎng)速度，但由于污水濃度較小，富含的氮磷營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)含量減少，導(dǎo)致培養(yǎng)后期營(yíng)養(yǎng)供給不足，影響其代謝產(chǎn)物的積累，同時(shí)消耗大量的淡水資源，有悖于微藻凈化污水的目的[15].

2) 環(huán)境溫度對(duì)小球藻的生長(zhǎng)速度及干重的影響結(jié)果

在污水稀釋2倍，光照強(qiáng)度10 000 Lux，光照時(shí)間為12 h的條件下，研究環(huán)境溫度分別為20、25、30、35、40 ℃對(duì)小球藻生長(zhǎng)速度和干重的影響，設(shè)3組平行實(shí)驗(yàn)，結(jié)果如圖2所示.

從圖2可以看出，當(dāng)環(huán)境溫度在20～30 ℃時(shí)，小球藻的生長(zhǎng)速度和干重均隨環(huán)境溫度的升高增大；當(dāng)環(huán)境溫度為30～40 ℃時(shí)，小球藻的生長(zhǎng)速度和干重均隨環(huán)境溫度的升高而減小.當(dāng)環(huán)境溫度為30 ℃時(shí)，小球藻的比生長(zhǎng)速率μ和干重DW均最大，分別為0.074 0 d-1、 0.257 2 g·L-1.統(tǒng)計(jì)分析表明，環(huán)境溫度為30 ℃的生長(zhǎng)速度和35 ℃的生長(zhǎng)速度無顯著性差異，與其它環(huán)境溫度水平有顯著性差異.小球藻的干重在各環(huán)境溫度下均有顯著性差異.由圖2可知，當(dāng)環(huán)境溫度為25、30、35 ℃時(shí)小球藻在污水環(huán)境中生長(zhǎng)狀況較好，環(huán)境溫度為30 ℃時(shí)小球藻的生長(zhǎng)速度最快，培養(yǎng)效果最佳.

環(huán)境溫度控制藻細(xì)胞內(nèi)酶的活性，不僅影響藻類的光合作用和生長(zhǎng)活動(dòng)[16-17]，也影響藻類對(duì)營(yíng)養(yǎng)鹽的吸收效率[18].環(huán)境溫度較低時(shí)，藻細(xì)胞內(nèi)酶活性較低，生長(zhǎng)相對(duì)較慢.過高時(shí)，抑制藻的呼吸作用代謝減慢，不利于藻的生長(zhǎng)和物質(zhì)積累[19-20].

3) 光照強(qiáng)度對(duì)小球藻的生長(zhǎng)速度及干重的影響結(jié)果

在污水稀釋2倍，環(huán)境溫度為30 ℃，光照時(shí)間為12 h的條件下，研究光照強(qiáng)度分別為8 000、10 000、12 000、14 000、16 000 Lux對(duì)小球藻生長(zhǎng)速度和干重的影響.設(shè)3組平行實(shí)驗(yàn)，結(jié)果如圖3所示.

從圖3可以看出，當(dāng)光照強(qiáng)度在8 000～12 000 Lux時(shí)，隨著光照強(qiáng)度的加強(qiáng)，小球藻的生長(zhǎng)速度和干重逐漸增大，當(dāng)光照強(qiáng)度在12 000～16 000 Lux時(shí)，小球藻的生長(zhǎng)速度和干重隨光照強(qiáng)度的加強(qiáng)而減少.當(dāng)光照強(qiáng)度為12 000 Lux時(shí)，小球藻的比生長(zhǎng)速率μ最大為0.069 2 d-1，干重DW最大為0.351 9 g·L-1.統(tǒng)計(jì)分析表明，光強(qiáng)為12 000 Lux實(shí)驗(yàn)組的生長(zhǎng)速度與8 000、10 000、16 000 Lux實(shí)驗(yàn)組的生長(zhǎng)速度有顯著性差異，與14 000 Lux實(shí)驗(yàn)組的生長(zhǎng)速度無顯著性差異.小球藻在不同光照強(qiáng)度下的干重均有顯著性差異.由圖3可知，小球藻適宜生長(zhǎng)的光照強(qiáng)度范圍為10 000～14 000 Lux，當(dāng)光照強(qiáng)度為12 000 Lux時(shí)小球藻在污水中生長(zhǎng)效果最好，培養(yǎng)效率最佳.

光照強(qiáng)度是藻類進(jìn)行光合作用的重要能源，能夠影響藻類葉綠素a的合成[21]以及藻類酶的活性[18].藻類生長(zhǎng)所需的光照強(qiáng)度有一定的飽和點(diǎn).光強(qiáng)在光飽和點(diǎn)以下時(shí)，藻的光合作用隨著光照強(qiáng)度的增加而加強(qiáng)，促進(jìn)藻類的生長(zhǎng)[22]；超過光飽和點(diǎn)時(shí)，藻的光合速率不再增加，甚至減弱、停止[17].

4) 光照時(shí)間對(duì)小球藻的生長(zhǎng)速度及干重的影響結(jié)果

在污水稀釋2倍，環(huán)境溫度為 30 ℃，光照強(qiáng)度為12 000 Lux的條件下，研究光照時(shí)間分別為8、12、16、20、24 h時(shí)對(duì)小球藻生長(zhǎng)速度和干重的影響，設(shè)3組平行實(shí)驗(yàn)，結(jié)果如圖4所示.

從圖4可以看出，光照時(shí)間在8～20 h時(shí)，小球藻的生長(zhǎng)速度隨光照時(shí)間不斷加長(zhǎng)而增大.光照時(shí)間在20～24 h時(shí)，隨著光照時(shí)間的增加，小球藻的生長(zhǎng)速度緩慢減少.當(dāng)光照時(shí)間為20 h時(shí)，小球藻的比生長(zhǎng)速率μ最大為0.069 3 d-1.統(tǒng)計(jì)分析表明，光照時(shí)間為20 h的生長(zhǎng)速度與8、12、16 h的生長(zhǎng)速度有顯著性差異，與光照時(shí)間為24 h的無顯著性差異.當(dāng)光照時(shí)間在8～16 h時(shí)，小球藻的干重隨光照時(shí)間的加長(zhǎng)而增加；當(dāng)光照時(shí)間在16～24 h時(shí)，隨著光照時(shí)間的加長(zhǎng)，小球藻的干重逐漸降低.當(dāng)光照時(shí)間為16 h時(shí)，小球藻的干重DW最大為0.763 3 g·L-1.統(tǒng)計(jì)分析表明，光照時(shí)間為8 h的干重與16、20、24 h的干重有顯著性差異，與光照時(shí)間12 h的干重?zé)o顯著性差異.由圖4可知，當(dāng)光照時(shí)間為16、20、24 h時(shí)小球藻在污水環(huán)境中生長(zhǎng)較好，其中光照時(shí)間為20 h時(shí)小球藻的生長(zhǎng)速度最快，培養(yǎng)效果最佳.

光照時(shí)間能夠保證微藻光合作用產(chǎn)物的形成和體內(nèi)物質(zhì)代謝的正常運(yùn)行.在培養(yǎng)系統(tǒng)中適當(dāng)延長(zhǎng)光照時(shí)間可以補(bǔ)償光照強(qiáng)度的不足[23].在一定的光溫條件下，微藻生長(zhǎng)速度與光照時(shí)間成正比，而超過飽和光照期時(shí)生長(zhǎng)速度不再增加，反而受到抑制，甚至下降[10-11,17].

2.2 正交實(shí)驗(yàn)下環(huán)境因子組合對(duì)污水培養(yǎng)小球藻的影響結(jié)果

僅考慮單種環(huán)境因子對(duì)小球藻生長(zhǎng)的影響或?qū)我蛩貙?shí)驗(yàn)研究結(jié)果簡(jiǎn)單的疊加以獲得培養(yǎng)小球藻的最優(yōu)培養(yǎng)條件時(shí)，其實(shí)驗(yàn)結(jié)果可能與實(shí)際狀態(tài)差別很大[23].有必要將初始污水濃度、環(huán)境溫度、光照強(qiáng)度和光照時(shí)間組合在一起，通過正交實(shí)驗(yàn)探索生活污水培養(yǎng)小球藻的最優(yōu)環(huán)境因子組合.

1) 正交實(shí)驗(yàn)結(jié)果

結(jié)合上述單因素實(shí)驗(yàn)結(jié)果，利用適宜小球藻生長(zhǎng)的環(huán)境因子水平(初始污水濃度：稀釋2、4、6倍；環(huán)境溫度：25、30、35 ℃；光照強(qiáng)度：10 000、12 000、14 000 Lux；光照時(shí)間：16、20、24 h)設(shè)計(jì)正交實(shí)驗(yàn).正交實(shí)驗(yàn)L9(33)結(jié)果見表1所列.

從表1可以看出，污水濃度的極差值R最大為0.013 8，光照時(shí)間的極差值R為0.012 5，環(huán)境溫度和光照強(qiáng)度的極差值R相對(duì)較小，分別為0.008 0、0.006 7.表明生活污水培養(yǎng)小球藻過程中污水濃度是影響小球藻生長(zhǎng)的主控環(huán)境因子，光照時(shí)間為次要環(huán)境因子.環(huán)境因子對(duì)小球藻生長(zhǎng)的影響順序：污水濃度>光照時(shí)間>環(huán)境溫度>光照強(qiáng)度，說明各環(huán)境因子對(duì)小球藻的生長(zhǎng)影響程度存在一定差異.由表1可知，生活污水培養(yǎng)小球藻的最優(yōu)環(huán)境因子組合為A1D1B2C1，即污水濃度稀釋2倍，環(huán)境溫度為30 ℃，光照強(qiáng)度為10 000 Lux，光照時(shí)間為16 h.該結(jié)果與單因素實(shí)驗(yàn)最佳因子水平組合有差異，生活污水培養(yǎng)小球藻的最優(yōu)環(huán)境因子并非各環(huán)境因子最佳水平的簡(jiǎn)單疊加，而是受到環(huán)境因子間的交互、耦合作用.

表1 正交實(shí)驗(yàn)L9(33)結(jié)果

2) 對(duì)比實(shí)驗(yàn)

通過正交實(shí)驗(yàn)得到了生活污水高效培養(yǎng)小球藻的最優(yōu)環(huán)境因子組合，為驗(yàn)證該結(jié)果是否合理，將正交實(shí)驗(yàn)的最優(yōu)環(huán)境因子組合、單因素實(shí)驗(yàn)的最佳因子水平組合(初始污水濃度為將原污水稀釋2倍，環(huán)境溫度為30 ℃，光照強(qiáng)度為12 000 Lux、光照時(shí)間為20 h)和自然環(huán)境條件進(jìn)行對(duì)比實(shí)驗(yàn).

取生活污水水樣，在上述確定的三種環(huán)境條件下培養(yǎng)小球藻并監(jiān)測(cè)每天藻種的OD值(680 nm)，設(shè)置3個(gè)平行樣及空白平行，實(shí)驗(yàn)結(jié)果如圖5所示.

從圖5可以看出，小球藻在空白實(shí)驗(yàn)組中前兩天出現(xiàn)適應(yīng)期，幾乎沒有生長(zhǎng)，第3天后緩慢增長(zhǎng).在單因素方法最佳組合和正交最優(yōu)組合實(shí)驗(yàn)組中小球藻均沒有出現(xiàn)適應(yīng)期，直接呈爆發(fā)式增長(zhǎng)，但是正交實(shí)驗(yàn)的OD值增長(zhǎng)量顯著的高于單因素實(shí)驗(yàn)組合.結(jié)果表明，正交實(shí)驗(yàn)獲得的最優(yōu)環(huán)境因子組合對(duì)小球藻生長(zhǎng)的促進(jìn)效果更加顯著，進(jìn)一步驗(yàn)證了實(shí)驗(yàn)結(jié)果的可靠性.

3 結(jié)論

基于生活污水培養(yǎng)小球藻實(shí)驗(yàn)，通過單因素實(shí)驗(yàn)方法研究環(huán)境因子(初始污水濃度、環(huán)境溫度、光照強(qiáng)度和光照時(shí)間)對(duì)小球藻生長(zhǎng)速度和干重的影響，結(jié)果表明：初始污水濃度、環(huán)境溫度、光照強(qiáng)度和光照時(shí)間對(duì)污水培養(yǎng)小球藻具有顯著影響.在單因素條件下，小球藻生長(zhǎng)的最佳初始污水濃度為將原污水稀釋2倍，環(huán)境溫度為30 ℃，光照強(qiáng)度為12 000 Lux，光照時(shí)間為20 h.通過正交實(shí)驗(yàn)和驗(yàn)證實(shí)驗(yàn)表明：生活污水培養(yǎng)小球藻的最優(yōu)環(huán)境因子組合并非是單因素實(shí)驗(yàn)研究結(jié)果的簡(jiǎn)單疊加，而是受到環(huán)境因子間的交互耦合作用.污水培養(yǎng)小球藻的主控環(huán)境因子是初始污水濃度和光照時(shí)間，其最優(yōu)環(huán)境因子組合為將原污水稀釋2倍，環(huán)境溫度為30 ℃，光照強(qiáng)度為10 000 Lux，光照時(shí)間達(dá)16 h，該環(huán)境因子組合下小球藻的生長(zhǎng)速度較快，培養(yǎng)效率較高.