馮梅艷，羅 敏，何 婷，徐時杰，汪輝娟，陳榮祥，3?

(1.遵義醫(yī)科大學 基礎醫(yī)學院，遵義 563000; 2.遵義醫(yī)科大學 藥學院，遵義56300;3.遵義市理化分析測試工程技術研究中心，遵義 563000)

氨甲環(huán)酸又稱凝血酸或止血環(huán)酸，具有止血、美白等作用，廣泛運用于醫(yī)療衛(wèi)生和美容行業(yè)，臨床上可用于全髖關節(jié)、全膝關節(jié)置換以及黃褐斑的診療[1-2]。氨甲環(huán)酸在臨床上有明確的用量規(guī)定，但如果過量服用，就會造成非常嚴重的后果。因此，氨甲環(huán)酸的添加量須控制在一個安全的范圍內。調查發(fā)現(xiàn)，市場上有部分治療牙齦出血功效的牙膏使用了氨甲環(huán)酸，且牙膏的專利也將氨甲環(huán)酸的添加作為技術的創(chuàng)新點[3]。但是，目前國內還沒有關于日用品中氨甲環(huán)酸限量的相關規(guī)定。因此，建立一種高效便捷的測定日用品中氨甲環(huán)酸含量的方法，對日用品中氨甲環(huán)酸添加量的監(jiān)測及相關規(guī)定的制定都是極有意義的。

氨甲環(huán)酸的測定方法主要有分光光度法[4]、氣相色譜-質譜法(GC-MS)[5]、高效液相色譜法(HPLC)[6-8]、超高效液相色譜-串聯(lián)質譜法(UPLCMS/MS)[9]等。相對于其他方法，HPLC 和UPLCMS/MS具有出色的分離性能、快速的分析時間和較高的靈敏度等特點，應用非常廣泛。但是，HPLC常用的紫外檢測器(UVD)的檢測靈敏度較低，在氨甲環(huán)酸的檢測波長(220 nm)附近，干擾較為嚴重。氨甲環(huán)酸屬于氨基酸，因此可采用衍生化的方式提高UVD 對其的檢測靈敏度，而適用于氨基酸的衍生試劑有很多，文獻[10-11]采用丹磺酰氯衍生試劑進行柱前衍生，用UVD 對牙膏和化妝品等樣品中的氨甲環(huán)酸含量進行了測定，檢出限可達0.3～2.0 mg·kg－1，極大提高了HPLC 的檢測靈敏度;鄰苯二甲醛(OPA)常聯(lián)合巰基乙醇、巰基丙酸、N-乙酰-L-半胱氨酸、亞硫酸鈉等巰基化合物(用作還原劑)來對氨基酸進行衍生[12-13]，前3種巰基化合物的衍生物常用UVD 或熒光檢測器(FLD)檢測，而亞硫酸鈉會影響目標物衍生物的吸光度，因此常用電化學檢測器(ECD)檢測[13-14]。和光學檢測器相比，ECD 具有較高的靈敏度和選擇性，近年來在生命科學、藥物、食品分析中的應用較多[15-17]。ECD的檢測池一般分為安培檢測池和庫侖檢測池，安培檢測池可通過調節(jié)工作電極與對電極之間的距離來調節(jié)檢測靈敏度，但長時使用時，電極表面容易受污染，電極響應下降，因此在分析基質復雜的樣品時，其日間精密度較差，需要定期進行電極維護;庫侖檢測池以多孔石墨電極作為工作電極，和安培檢測池相比，多孔石墨電極的表面積更大，抗污染能力更強，且可實現(xiàn)目標物在電極表面接近完全氧化，響應更高[14]。

本工作采用OPA-亞硫酸鈉對氨甲環(huán)酸進行柱前衍生，采用UPLC 分離，采用ECD 檢測，建立了一種快速、靈敏地測定牙膏中氨甲環(huán)酸含量的方法，以期為牙膏等日化產品中氨甲環(huán)酸的監(jiān)測提供技術參考。

1 試驗部分

1.1 儀器與試劑

Thermo Ultimate 3000 Bio-RS 型超高效液相色譜儀，配ECD-3000RS 型電化學檢測器，檢測池為6011型庫侖檢測池;5B-5200DT 型超聲波清洗機;ME104/2型電子天平;FE 28型p H 計;PURELAB Chorus 2型純水及超純水系統(tǒng)。

氨甲環(huán)酸儲備溶液:稱取氨甲環(huán)酸標準品10 mg，用水溶解并定容，配制成0.99 g·L－1的溶液，其他所需質量濃度均由此溶液稀釋制得。

衍生試劑溶液:稱取OPA 15 mg，用0.5 mL甲醇溶解;同時稱取亞硫酸鈉0.13 g，用0.5 mL 水溶解;將上述兩種溶液混合，加入0.1 mol·L－1硼砂緩沖溶液(pH 10.0)9 mL，混合均勻，作為儲備溶液備用，于4 ℃避光保存，使用有效期為3 d。使用時用0.1 mol·L－1硼砂緩沖溶液(pH 10.0)將儲備溶液稀釋定容至100.0 mL(其中OPA 和亞硫酸鈉的質量濃度分別為150 mg·L－1和1.3 g·L－1)，該溶液即為衍生試劑溶液，現(xiàn)用現(xiàn)配。

氨甲環(huán)酸標準品的純度不小于99%;OPA 的純度不小于99%;甲醇、乙腈、乙酸銨均為色譜純，亞硫酸鈉、氫氧化鈉、硼砂均為分析純;試驗用水為超純水;牙膏購自本地超市，共6種，其中一種標注有氨甲環(huán)酸的添加。

1.2 儀器工作條件

Waters ACQUITY UPLC BEH C18色譜柱(100 mm×2.1 mm，1.7μm)，柱溫為40 ℃;檢測電壓為500 mV;流量為0.4 mL·min－1;流動相為體積比為2∶8的乙腈-30 mmol·L－1乙酸銨緩沖溶液(pH 3.6)，等度洗脫;進樣體積為1μL。

1.3 試驗方法

稱取牙膏樣品約1 g，加入水50 mL，超聲萃取30 min，以12 000 r·min－1轉速離心10 min，在上清液中加入和上清液等體積的衍生試劑溶液，在室溫、標準大氣壓條件下反應5 min，按照儀器工作條件進樣測定。

2 結果與討論

2.1 色譜行為

按照儀器工作條件對衍生后的氨甲環(huán)酸標準溶液進行測定，色譜圖見圖1。

圖1 氨甲環(huán)酸衍生物色譜圖Fig.1 Chromatogram of the derivative of aminocyclic acid

2.2 流動相條件的優(yōu)化

2.2.1 乙酸銨緩沖溶液酸度

當用色譜分離氨甲環(huán)酸的衍生物時，流動相的酸度對氨甲環(huán)酸衍生物的保留時間影響很大。試驗考察了乙酸銨緩沖溶液的酸度對衍生物保留時間的影響。結果發(fā)現(xiàn):pH 7.0時，衍生物以離子化形式存在，在C18色譜柱中幾乎無保留;酸度繼續(xù)增加，衍生物的保留時間增加;當pH 為3.6時，氨甲環(huán)酸衍生物的分離度好，峰形對稱，且容量因子適中。因此，試驗選擇乙酸銨緩沖溶液的pH 為3.6。

2.2.2 乙酸銨緩沖溶液濃度

為了消除衍生反應中較高濃度堿性緩沖溶液[0.1 mol·L－1硼砂緩沖溶液(pH 10.0)]對流動相酸度的干擾，試驗考察了乙酸銨緩沖溶液濃度分別為15，30 mmol·L－1時對氨甲環(huán)酸衍生物峰形的影響。結果發(fā)現(xiàn):當采用15 mmol·L－1乙酸銨緩沖溶液時，氨甲環(huán)酸衍生物峰形不對稱，色譜峰拖尾;繼續(xù)增加乙酸銨緩沖溶液的濃度，當乙酸銨緩沖溶液濃度為30 mmol·L－1時，峰形得到明顯的改善，滿足試驗要求。因此，試驗選擇乙酸銨緩沖溶液的濃度為30 mmol·L－1。

2.3 檢測電壓的優(yōu)化

試驗考察了檢測電壓在600 mV 以內時對目標衍生物峰面積的影響，結果見圖2。

圖2 檢測電壓對峰面積的影響Fig.2 Effect of detect potential on peak area

由圖2可以看出:當檢測電壓在250 mV 以內時，衍生物的信號幾乎為0;當檢測電壓大于300 mV 時，衍生物的峰面積值隨著檢測電壓的升高而增大;當檢測電壓為475 mV 時，峰面積接近最大值;當檢測電壓為475～550 mV 時，峰面積基本保持穩(wěn)定;當檢測電壓大于550 mV 時，峰面積降低。綜合考慮，試驗選擇檢測電壓為500 mV。

2.4 OPA質量濃度的優(yōu)化

試驗考察了衍生試劑溶液中OPA 的質量濃度分別為0，15，30，75，150，300 mg·L－1時對目標衍生物峰面積的影響，結果見圖3。

圖3 OPA 質量濃度對峰面積的影響Fig.3 Effect of the mass concentration of OPA on the peak area

由圖3可以看出:當OPA 質量濃度為30 mg·L－1時，衍生物峰面積接近最大值;繼續(xù)增加OPA的質量濃度，峰面積保持穩(wěn)定。由于實際樣品中氨甲環(huán)酸的添加量不確定，為保證高添加量樣品的檢測準確度，試驗采用OPA的質量濃度為150 mg·L－1。

2.5 標準曲線和檢出限

按照儀器工作條件對衍生化后的0.495，0.990，1.980，4.950，9.900，19.800 mg·L－1氨甲環(huán)酸標準溶液系列進行測定。以氨甲環(huán)酸的質量濃度為橫坐標，其對應的峰面積為縱坐標繪制標準曲線。結果表明:氨甲環(huán)酸標準曲線的線性范圍為0.495～19.800 mg·L－1，相關系數(shù)為0.999 7，線性回歸方程為y＝4.615x＋1.230。

以3倍信噪比(S/N)計算檢出限(3S/N)，得到氨甲環(huán)酸的檢出限為0.003 6 mg·L－1，換算到實際樣品，得到的檢出限為0.18μg·g－1。

2.6 精密度和回收試驗

按照試驗方法對添加了氨甲環(huán)酸的牙膏樣品進行加標回收試驗，加標水平為0.297 mg·g－1，平行制備6份進行測定，計算測定值的相對標準偏差(RSD)和回收率，得到回收率為98.6%，RSD 為2.4%。表明該方法的精密度較好，準確度較高。

2.7 重復性試驗

按照試驗方法平行制備6份樣品溶液，按優(yōu)化后的色譜條件進樣測定，計算得衍生產物峰面積RSD 為3.3%。表明該方法的重復性良好。

2.8 衍生產物穩(wěn)定性試驗

采用OPA 和硫醇對氨基酸衍生化得到的衍生產物通常不穩(wěn)定，采用亞硫酸鈉代替硫醇類試劑可以提高衍生產物的穩(wěn)定性[14]。為了考察氨甲環(huán)酸衍生產物的穩(wěn)定性，將衍生化后的樣品溶液在4 ℃條件下儲存，每隔2 h進樣測定，結果顯示:12 h內，衍生產物保持穩(wěn)定，峰面積下降了不到5%。

2.9 專屬性試驗

OPA 衍生試劑常用來衍生伯胺，為了確認其他氨基酸是否對氨甲環(huán)酸的測定存在干擾，分別對空白牙膏樣品(不含氨基環(huán)酸)、加標牙膏樣品、氨甲環(huán)酸標準溶液按照試驗方法進行測定，結果顯示，雜質峰對氨甲環(huán)酸峰均無干擾。因為牙膏中常見的氨基酸類添加劑為精氨酸和茶氨酸，二者的衍生物均在氨甲環(huán)酸衍生物之前出峰，不會干擾氨甲環(huán)酸的測定。

2.10 樣品分析

按照試驗方法分析了6份牙膏樣品，只在添加了氨甲環(huán)酸的牙膏樣品中檢出了氨甲環(huán)酸，添加量為0.23 mg·g－1。實際樣品的色譜圖見圖4。

圖4 牙膏樣品色譜圖Fig.4 Chromatogram of the toothpaste sample

2.11 方法比對

將本方法與文獻中氨甲環(huán)酸的測定方法進行了比對，結果見表1。

表1 本方法同文獻中方法結果的比較Tab.1 Comparison of results between this method and other methods in the literature

由表1可知:與其他方法相比，本方法的靈敏度更高，有助于更低添加水平的氨甲環(huán)酸含量的測定;另外，牙膏中含有的大量表面活性劑，會造成色譜柱的較大損傷，而本方法可對樣品進行大比例稀釋，進而減少表面活性劑的進樣量，延長色譜柱的壽命。

本工作建立了柱前衍生-UPLC-ECD 測定牙膏中氨甲環(huán)酸含量的方法，該方法準確度、精密度、重復性、穩(wěn)定性、專屬性均較好，適用于牙膏中氨甲環(huán)酸含量的測定。