劉 行,陳嘉鑫,馮建國,賈 靜,王曉斌

(西南醫(yī)科大學(xué)附屬醫(yī)院麻醉科,瀘州 646000;*通訊作者,E-mail:wangxiaobin67@163.com)

生理情況下,神經(jīng)系統(tǒng)的正常氧化應(yīng)激水平對維持生理功能具有重要作用,氧化應(yīng)激失衡將導(dǎo)致神經(jīng)系統(tǒng)功能紊亂,引起抑郁癥、阿爾茲海默癥等疾病[1,2]。星形膠質(zhì)細(xì)胞是神經(jīng)系統(tǒng)的重要組成部分,在神經(jīng)系統(tǒng)中參與維持氧化應(yīng)激穩(wěn)定[3],其功能的改變將導(dǎo)致抑郁癥等疾病的發(fā)生[4]。氯胺酮是一種常用的麻醉藥物,可以增加抗氧化應(yīng)激能力[5],在臨床麻醉、鎮(zhèn)痛及快速抗抑郁領(lǐng)域有重要作用[6,7],但是其在星形膠質(zhì)細(xì)胞是否具有抗氧化應(yīng)激的作用及其作用機(jī)制不清楚。本研究檢測氯胺酮對與氧化應(yīng)激有關(guān)的蛋白乙?；?、KAT6B以及經(jīng)典氧化應(yīng)激通路Nrf2(nuclear factor erythroid 2-related factor 2)等的作用,以闡釋氯胺酮提高星形膠質(zhì)細(xì)胞抗氧化應(yīng)激能力的機(jī)制。

1 材料與方法

1.1 主要試劑

谷胱甘肽過氧化物酶測定試劑盒、過氧化氫酶測定試劑盒及總超氧化物歧化酶測定試劑盒購自中國南京建成生物工程研究所;DMEM細(xì)胞培養(yǎng)基、胎牛血清、青霉素、鏈霉素、胰蛋白酶消化液及BCA蛋白定量試劑盒購自中國碧云天公司;β-actin、Nrf2抗體、羊抗鼠二抗及羊抗兔二抗購自中國Proteintech公司;KAT6B購自英國Abcam公司;Western blot乙?；贵w購自中國景杰生物科技公司;免疫熒光乙?；贵w購自美國Santa Cruz公司;TRNzol總RNA提取液、FastQuant cDNA第一鏈合成試劑盒(去基因組)購自中國天根生化公司;QuantiNova SYBR Green PCR Kit購自德國QIAGEN公司;RT-qPCR引物購自中國深圳華大基因公司;KAT6B siRNA和空白對照片段購自中國吉瑪制藥公司;Lipofectamine 3000轉(zhuǎn)染試劑購自美國Invitrogen公司。

1.2 細(xì)胞培養(yǎng)

人星形膠質(zhì)細(xì)胞株HA1800購自武漢博士德生物公司,培養(yǎng)條件為高糖DMEM培養(yǎng)基+10%胎牛血清+100 U/ml青霉素+100 μg鏈霉素,37 ℃和5%CO2。

1.3 氧化應(yīng)激相關(guān)酶活力測定

HA1800細(xì)胞經(jīng)50 μmol/L氯胺酮處理12 h,細(xì)胞刮掛取細(xì)胞,于4 ℃ 3 000 r/min離心10 min后取上清液。按照試劑盒說明書進(jìn)行,采用比色法測定GSH-Px活力,WST-1法測定T-SOD活力,鉬酸胺法測定CAT活力。

1.4 Western blot檢測Nrf2、乙酰化及KAT6B蛋白表達(dá)

50 μmol/L氯胺酮處理HA1800細(xì)胞3,6,12,24 h,刮取細(xì)胞,用裂解液RIPA于冰上裂解30 min,在4 ℃下12 000 r/min離心15 min后取上清液,BCA法測定蛋白濃度,蛋白樣品加入上樣緩沖液,100 ℃蛋白變性,行SDS-PAGE電泳。以每孔20 μg上樣,蛋白電泳結(jié)束后,采用濕轉(zhuǎn)法將蛋白至NC膜,于含有5%脫脂奶粉的TBST緩沖液中室溫封閉1 h,加入一抗(稀釋比例分別為:β-actin 1 ∶5 000,Nrf2 1 ∶1 000,KAT6B 1 ∶1 000,乙酰化1 ∶1 000)4 ℃孵育過夜,TBST洗膜后室溫孵育相應(yīng)二抗(稀釋比例分別為:羊抗鼠二抗1 ∶2 500,羊抗兔二抗1 ∶5 000)1 h,ECL化學(xué)發(fā)光法進(jìn)行蛋白條帶顯影。將所得蛋白條帶用Image J進(jìn)行灰度值數(shù)據(jù)分析。

1.5 免疫熒光染色檢測乙?；癗rf2蛋白表達(dá)

免疫熒光染色用于檢測乙?；谋磉_(dá)情況及Nrf2蛋白的亞細(xì)胞定位。細(xì)胞經(jīng)氯胺酮處理12 h,經(jīng)4%多聚甲醛固定30 min,0.2% Triton X-100破膜處理15 min,1%BSA室溫封閉30 min,加入一抗4 ℃孵育過夜,PBS洗3次后室溫避光孵育二抗1 h,DAPI染核5 min,經(jīng)PBS洗3次后加入抗猝滅劑,熒光顯微鏡下觀察并拍照記錄。

1.6 實(shí)時熒光定量PCR檢測KAT6B mRNA及circRNA表達(dá)

經(jīng)氯胺酮(50 μmol/L)處理12 h的HA1800細(xì)胞,采用TRNzol試劑提取總RNA,FastQuant cDNA第一鏈合成試劑盒將RNA反轉(zhuǎn)錄成cDNA,使用QuantiNovaTMSYBR?Green PCR Kit(QIAGEN)試劑進(jìn)行實(shí)時熒光定量PCR。反應(yīng)條件:95 ℃預(yù)變性600 s;95 ℃ 15 s變性,60 ℃ 40 s退火,95℃ 10 s延伸,重復(fù)40個循環(huán);最后在72 ℃條件下延時5 min。KAT6B mRNA的引物序列:正義5′-ACAACAACAGGGGGACACAA-3′,反義5′-CCGCATGGCAGATTCTCTCT-3′;KAT6B circRNA的引物序列:正義5′-TGGGAGGTTACTGAAAGACGG-3′,反義5′-AGGCAATGTTGATGGTTGTCTTA-3′;以GAPDH為內(nèi)參基因,引物序列:正義5′-GGAGCGAGATCCCTCCAAAAT-3′,反義5′-GGCTGTTGTCATACTTCTCATGG-3′。結(jié)果采用2-ΔΔCt法進(jìn)行KAT6B mRNA及circRNA含量的相對定量計(jì)算。

1.7 siRNA抑制KAT6B mRNA的表達(dá)

HA1800細(xì)胞接種于6孔板中,培養(yǎng)至融合度達(dá)到70%左右進(jìn)行細(xì)胞轉(zhuǎn)染,按照轉(zhuǎn)染試劑盒說明書進(jìn)行,更換Opti-MEM培養(yǎng)基,加入siRNA9.4 μl,混勻,加入Lipofectamine 3000轉(zhuǎn)染試劑3.75 μl,加入混合好的轉(zhuǎn)染復(fù)合物,搖勻,常溫下作用15 min,繼續(xù)培養(yǎng),4 h后更換為完全培養(yǎng)基。轉(zhuǎn)染后24 h,使用Western blot檢測干擾效果,使用轉(zhuǎn)染后的細(xì)胞進(jìn)行相關(guān)實(shí)驗(yàn)。共設(shè)4組:對照組(siRNA-NC組,即NC組)、氯胺酮處理組(siRNA-NC+50 μmol/L氯胺酮處理12 h組,即NC+K組)、KAT6B基因轉(zhuǎn)染組(siRNA-KAT6B組,即S組)和KAT6B基因轉(zhuǎn)染+氯胺酮處理組(siRNA-KAT6B+50 μmol/L氯胺酮處理12 h組,即S+K組)。處理后分別按照方法1.3和1.4步驟測定Nrf2和乙?；鞍椎谋磉_(dá)情況,并測定T-SOD和CAT活力的變化。

1.8 統(tǒng)計(jì)學(xué)分析

實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)以均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差表示,采用Graphpad Prism軟件進(jìn)行數(shù)據(jù)處理,兩組比較采用t檢驗(yàn),多組比較采用單因素方差分析(One-way ANOVA),兩兩比較采用LSD-t檢驗(yàn),P<0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。所有實(shí)驗(yàn)均至少重復(fù)3次。

2 結(jié)果

2.1 氯胺酮對星形膠質(zhì)細(xì)胞氧化應(yīng)激水平的影響

HA1800細(xì)胞經(jīng)過50 μmol/L氯胺酮處理12 h后,GSH-Px(P=0.022 3)、T-SOD(P=0.020 0)和CAT(P=0.045 3)活力明顯升高(見圖1)。

2.2 氯胺酮對星形膠質(zhì)細(xì)胞Nrf2、KAT6B及乙?；磉_(dá)水平的影響

50 μmol/L氯胺酮處理HA1800細(xì)胞后,結(jié)果顯示Nrf2、KAT6B和乙酰化水平均顯著提高(Nrf2:F(4,10)=93.53,P<0.000 1;KAT6B:F(4,10)=43.79,P<0.000 1;乙?；?F(4,10)=40.51,P<0.000 1,見圖2)。免疫熒光結(jié)果分析也發(fā)現(xiàn)與0 μmol/L比較,50 μmol/L氯胺酮處理星形膠質(zhì)細(xì)胞12 h,乙?；磉_(dá)明顯增加(P=0.032 0,見圖3);使用50 μmol/L氯胺酮處理HA1800細(xì)胞12 h,Nrf2蛋白聚集于細(xì)胞核周圍(見圖4),提示該蛋白出現(xiàn)核轉(zhuǎn)移現(xiàn)象。

與0 μmol/L比較,*P<0.05圖1 氯胺酮對HA800細(xì)胞抗氧化應(yīng)激酶活力的影響Figure 1 Effects of ketamine treatment on antioxidant activities of HA1800 cells

與0 μmol/L比較,*P<0.05,**P<0.01圖5 氯胺酮對HA1800細(xì)胞KAT6B mRNA及circRNA含量的影響Figure 5 Effects of ketamine treatment on KAT6B mRNA and circRNA in HA1800 cells.

與0 h比較,*P<0.05,***P<0.001,****P<0.000 1圖2 50 μmol/L氯胺酮作用不同時間對HA1800細(xì)胞Nrf2、KAT6B及乙?；鞍妆磉_(dá)的影響Figure 2 The effects of 50 μmol/L ketamine on the expression of Nrf2, KAT6B and acetylation protein inHA1800 cells

圖3 免疫熒光染色顯示氯胺酮對HA1800細(xì)胞乙?；磉_(dá)的影響Figure 3 Effect of ketamine on the expression of acetylation inHA1800 cells by immunofluorescence

圖4 氯胺酮調(diào)節(jié)Nrf2蛋白在HA1800細(xì)胞中的亞細(xì)胞定位Figure 4 Eeffect of ketamine on subcellular location of Nrf2 in HA1800 cells

2.3 氯胺酮對HA1800細(xì)胞內(nèi)KAT6B mRNA及circRNA含量的影響

50 μmol/L氯胺酮處理12 h,HA1800細(xì)胞內(nèi)KAT6B mRNA含量明顯增加(P=0.002),KAT6B circRNA含量明顯降低(P=0.016 4,見圖5)。

2.4 沉默KAT6B基因降低氯胺酮對星形膠質(zhì)細(xì)胞的抗氧化應(yīng)激能力的作用

抑制KAT6B基因表達(dá)(F(3,8)=135.62,P<0.000 1)之后,HA1800細(xì)胞內(nèi)Nrf2(F(3,8)=51.78,P<0.000 1);乙酰化(F(3,8)=102.52,P<0.000 1)的含量及抗氧化應(yīng)激相關(guān)酶(T-SOD:F(3,8)=195.62,P<0.000 1;CAT:F(3,8)=106.49,P<0.000 1)的活力明顯變化(見圖6,7)。與NC+K組比較,S+K組Nrf2(P<0.000 1)、乙?；?P=0.033)的含量及T-SOD(P=0.005 5)、CAT(P<0.000 1)的活力均明顯降低(見圖6,7)。

NC組:siRNA-NC組;NC+K組:氯胺酮處理組;S組:KAT6B基因轉(zhuǎn)染組;S+K組:KAT6B基因轉(zhuǎn)染+氯胺酮處理組;與NC組比較,***P<0.001,****P<0.000 1;與NC+K組比較,#P<0.05,####P<0.000 1圖6 氯胺酮對KAT6B基因沉默后HA1800細(xì)胞KAT6B、Nrf2及乙?；鞍椎挠绊慒igure 6 Effects of ketamine treatment on KAT6B, Nrf2 and acetylation protein expression after silencing KAT6B gene in HA1800 cells

NC組:siRNA-NC組;NC+K組:氯胺酮處理組;S組:KAT6B基因轉(zhuǎn)染組;S+K組:KAT6B基因轉(zhuǎn)染+氯胺酮處理組;與NC組比較,**P<0.01,****P<0.000 1;與NC+K組比較,##P<0.01,####P<0.000 1圖7 氯胺酮對KAT6B基因沉默后HA1800細(xì)胞抗氧化應(yīng)激酶活力的影響Figure 7 Effects of ketamine treatment on antioxidant activities after KAT6B gene silencing in HA1800 cells

3 討論

目前臨床常用的抗抑郁藥物存在起效慢、抗抑郁效果不穩(wěn)定等不足,迫切需要新的快速起效的抗抑郁藥物[8],氯胺酮因其快速而明顯的抗抑郁作用受到越來越多的關(guān)注[9]。但具體通過什么途徑發(fā)揮抗抑郁作用仍不清楚,闡明相關(guān)信號通路,對于開發(fā)新的快速起效的抗抑郁新藥具有重要指導(dǎo)作用。

星形膠質(zhì)細(xì)胞對中樞神經(jīng)系統(tǒng)的發(fā)育和相關(guān)功能具有密切聯(lián)系,可通過離子通道、能量代謝、神經(jīng)細(xì)胞營養(yǎng)支持等途徑參與抑郁癥的發(fā)生和發(fā)展[10,11]。胡海嵐等[12]的研究表明,抑郁癥大鼠模型的外側(cè)僵核的星形膠質(zhì)細(xì)胞鉀通道(Kir4.1)被上調(diào),可能作為治療抑郁癥的靶點(diǎn)。此外,Cotter等[11]的研究顯示,星形膠質(zhì)細(xì)胞供給能量不足時,會減少神經(jīng)細(xì)胞樹突分枝,增加神經(jīng)元的易損性及對抑郁癥的易感性。此外,氧化應(yīng)激水平增加對抑郁癥的發(fā)生有促進(jìn)作用[13]。在抑郁大鼠模型體內(nèi)SOD、CAT活力降低,且在使用S-氯胺酮之后,SOD、CAT的活力增加[5]。并且抑郁癥患者在接受抗抑郁藥物治療前,血清內(nèi)丙二醛(MDA)含量增加[14]。研究結(jié)果表明50 μmol/L氯胺酮明顯增加了人星形膠質(zhì)細(xì)胞內(nèi)抗氧化應(yīng)激酶GSH-Px、SOD和CAT的活力,證實(shí)氯胺酮可增加抗氧化應(yīng)激酶的活力,但具體機(jī)制需進(jìn)一步探討。

已有研究證實(shí),Nrf2在阿爾茨海默氏癥、帕金森病等神經(jīng)退行性疾病中被激活,而在體外培養(yǎng)的神經(jīng)元中,Nrf2活性被抑制,只有培養(yǎng)的星形膠質(zhì)細(xì)胞對Nrf2激活劑產(chǎn)生反應(yīng)[15],提示Nrf2與星形膠質(zhì)細(xì)胞具有密切的聯(lián)系。Nrf2蛋白可結(jié)合DNA上游調(diào)節(jié)區(qū)的抗氧化反應(yīng)元件,是機(jī)體抗氧化應(yīng)激水平的重要調(diào)節(jié)因子[16]。本實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明,氯胺酮處理星形膠質(zhì)細(xì)胞后,抗氧化應(yīng)激酶的活力和Nrf2蛋白的表達(dá)增加,但氯胺酮引起Nrf2蛋白表達(dá)增加的具體機(jī)制尚不明確。

研究表明,乙?；胶蚇rf2表達(dá)密切相關(guān)[17]。通過p300/CBP途徑使Nrf2的乙?；皆黾幽軌虼龠M(jìn)抗氧化應(yīng)激反應(yīng)中Nrf2序列的啟動子結(jié)合,從而誘導(dǎo)機(jī)體的抗氧化應(yīng)激水平增加[18]。此外,組蛋白去乙?；种苿┍焖峥梢酝ㄟ^恢復(fù)組蛋白乙?；?改善Nrf2介導(dǎo)的抗氧化防御機(jī)制破壞所導(dǎo)致的抑郁癥[17]。本研究結(jié)果表明氯胺酮可明顯提高星形膠質(zhì)細(xì)胞乙?；?。但氯胺酮通過什么途徑影響乙?；竭€不清楚。

KAT6B基因的表達(dá)產(chǎn)物是一種乙?；D(zhuǎn)移酶,其表達(dá)水平可調(diào)節(jié)機(jī)體乙酰化水平。最近研究顯示,環(huán)狀RNA的形成機(jī)制主要為RNA反向剪切,在前體RNA形成環(huán)狀RNA的過程中,可導(dǎo)致編碼蛋白質(zhì)的線狀RNA減少,即環(huán)狀RNA與線狀RNA的產(chǎn)生存在著競爭關(guān)系[19]。前期研究結(jié)果表明[20],氯胺酮處理后,大鼠海馬組織內(nèi)rno-circRNA-005442表達(dá)降低,且該環(huán)狀RNA與KAT6B基因同源。檢測氯胺酮處理后KAT6B基因表達(dá)的結(jié)果發(fā)現(xiàn),線狀RNA含量明顯降低,環(huán)狀RNA含量明顯增加,且沉默KAT6B基因的表達(dá)后,Nrf2、乙?；鞍妆磉_(dá)降低,T-SOD和CAT活性降低。實(shí)驗(yàn)結(jié)果證實(shí)氯胺酮致KAT6B表達(dá)增加與氯胺酮減少環(huán)狀KAT6B形成相關(guān)。

綜上所述,氯胺酮可通過調(diào)節(jié)KAT6B基因的表達(dá),提高乙?；?促進(jìn)Nrf2表達(dá),增加抗氧化應(yīng)激酶的活力,最終提高星形膠質(zhì)細(xì)胞抗氧化應(yīng)激能力。