孫思琦 甕岳太 邸雪穎 劉志華 楊 光

(東北林業(yè)大學林學院 森林生態(tài)系統(tǒng)可持續(xù)經營教育部重點實驗室 哈爾濱 150040)

森林地表可燃物的自然分解過程緩慢，導致林內物質積累，氣候干燥時造成森林火災風險(Nakayamaetal., 2001)，使森林防火難度增大。纖維素是森林可燃物的主要組分，在很大程度上控制著森林可燃物的分解過程(Steffenetal., 2007； Yueetal., 2016)。溫帶森林地表可燃物的分解主要受真菌活動影響(Watlingetal., 1998； Hattenschwileretal., 2005)。真菌可通過自身分泌的酶將其他微生物不能分解的纖維素等高分子化合物分解為簡單的小分子化合物，因而能加速森林地表可燃物分解過程(Kj?lleretal., 1982； Djarwantoetal., 2009)。篩選并應用纖維素高效降解真菌，使其分解地表可燃物中不易分解的纖維素組分，減少森林可燃物載量，可達到降低森林火險等級的目的。然而，能完全降解森林地表可燃物等含纖維素類物質的高活性菌株十分缺乏，且具有高纖維素酶活性的菌株對枯枝落葉的分解能力不一定強(Kwonetal., 1996)。因此，為了采取生物防火措施在一定程度上降低森林可燃物載量，分離篩選能有效降解地表可燃物中纖維素的菌種十分必要。

Djarwanto等(2009)在印度尼西亞南蘇門答臘島的相思樹(Acaciamangium)人工林內，采集真菌的子實體和有菌絲附著的地表可燃物，從中分離篩選出6株真菌，然后以相思樹木屑為分解基質進行了基于木質素和綜纖維素質量分數的降解試驗，根據試驗結果篩選出層菌綱(Hymenoycetes)非褶菌目(Polyporales)Polyporussp.為降解相思樹木屑中木質素和綜纖維素的最有效菌種； Boberg等(2011)從針葉林地表可燃物中分離得到9株真菌，測試了其降解歐洲赤松(Pinussylvestris)針葉的能力，其中盤菌綱(Discomycetes)柔膜菌目(Helotiales)的Chalaralongipes及其他3個菌株、擔子菌綱(Basidiomycetes)的鎖瑚菌屬(Clavulina)/肉片齒菌屬(Sistotrema)可降解纖維素，松針散斑殼(Lophodermiumpinastri)[斑痣盤菌目(Rhytismatales)]極易分解纖維素，并可造成木質素的大量損失。

帽兒山地區(qū)地處中溫帶，溫度濕度較低，森林地表可燃物的分解受到很大制約。本研究篩選帽兒山地區(qū)闊葉與針葉人工林地表可燃物中的纖維素高效降解真菌，進行了可燃物樣品降解試驗并分析其降解效果，可為制定森林可燃物合理管理策略提供科學依據，并為應用生物降解方法降低森林地表可燃物載量提供新技術。

1 材料與方法

1.1 試驗材料

1.1.1 樣品 室內降解可燃物樣品采自帽兒山實驗林場尖砬溝森林培育實驗站的興安落葉松(Larixgemelinii)、胡桃楸(Juglansmandshurica)、水曲柳(Fraxinusmandshurica)、紅皮云杉(Piceakoraiensis)林內的未分解層(L層，Litter)、半分解層(F層，Fermentative layer)和全分解層(H層，Humus horizon)(Cookeetal., 1984)。野外降解可燃物樣品為采自胡桃楸、興安落葉松以及胡桃楸×興安落葉松混交林內的凋落葉。

1.1.2 培養(yǎng)基 孟加拉紅培養(yǎng)基(購自北京索萊寶科技有限公司)、羧甲基纖維素鈉(CMC-Na)瓊脂培養(yǎng)基(黃秀梨，1999)、馬鈴薯葡萄糖瓊脂(PDA)培養(yǎng)基和麥芽浸粉液體培養(yǎng)基： 麥芽浸粉20 g，吐溫800.5 g。

1.2 試驗方法

1.2.1 纖維素降解菌的分離與篩選 將各層樣品分別置于盛有無菌水的三角瓶內，于200 r·min-1的搖床上振蕩20 min混勻，將母液按10、20、30倍稀釋成系列濃度梯度，用移液槍吸取0.2 mL涂布到孟加拉紅培養(yǎng)基平板上，每個濃度梯度設3個重復，置于28 ℃恒溫培養(yǎng)箱中倒置培養(yǎng)7天。之后分別挑取各菌落邊緣的菌絲至PDA培養(yǎng)基平板上，反復接種進行分離純化，直至獲得純菌株。

采用剛果紅染色法在CMC-Na培養(yǎng)基上篩選纖維素降解菌(Dingetal., 1999)。將已純化的菌株呈品字形接種于CMC-Na培養(yǎng)基上，每個菌株做3個重復，于28 ℃恒溫培養(yǎng)箱中倒置培養(yǎng)。待菌種在平板上長出可見菌落后，向培養(yǎng)基中加入0.2%的剛果紅試劑2 mL進行染色，輕輕搖動，使試劑鋪滿整個平板，放置15 min后，將剛果紅試劑倒去。再加入0.5%的NaCl溶液2 mL進行脫色，輕輕搖動，使NaCl溶液鋪滿培養(yǎng)基表面，放置15 min，再將NaCl溶液倒去。若菌落周圍出現透明水解圈則該菌株可產生纖維素酶，水解圈越大則產生的纖維素酶活性越強，用游標卡尺測量水解圈與菌落直徑大小，用以下公式計算各菌株的纖維素分解指數，通過比較得到高活性纖維素酶菌株：

1.2.2 纖維素降解菌的鑒定 將按上述步驟篩選出的高活性纖維素酶菌株接種到PDA培養(yǎng)基上，于28 ℃恒溫培養(yǎng)數天，直至獲得大量成熟孢子。首先，挑取有孢子的菌塊于蓋玻片上，放在載玻片上進行鏡檢，根據產孢結構、孢子形狀特征進行形態(tài)學鑒定； 其次，對其ITS序列進行DNA測序，通過將測序得到的ITS序列與GeneBank數據庫中已知真菌ITS序列進行比較，從而獲得種屬信息，利用MEGA 5.1軟件構建系統(tǒng)發(fā)育樹。

1.2.3 地表可燃物室內降解試驗 將1.1.1中于興安落葉松與胡桃楸林內未分解層收集的針葉可燃物裁成2 cm大小片段，闊葉可燃物裁成1 cm×1cm碎塊，65 ℃條件下烘干至恒重。放入裝有10 mL已滅菌的麥芽浸汁液體培養(yǎng)基的50 mL三角瓶內，每瓶放0.8 g可燃物作為分解基質，該分解基質分為3種類型，即針葉分解基質(每瓶0.8 g針葉可燃物)、闊葉分解基質(每瓶0.8 g闊葉可燃物)和針闊葉混合分解基質(每瓶0.4 g針葉可燃物和0.4 g闊葉可燃物)。

在無菌操作臺內打開純培養(yǎng)的高活性纖維素酶菌株平板，用已滅菌的打孔器(外徑6 mm)在菌絲生長旺盛區(qū)域制取菌餅20個，將菌餅接入裝有100 mL滅菌水的三角瓶，于28 ℃、160 r·min-1下恒溫振蕩培養(yǎng)7天，于4 000 r·min-1下離心10 min，上清液即為高活性纖維素酶菌株的菌懸液。將不同菌株的菌懸液分別接入裝有3類分解基質的三角瓶，每瓶接種量均為300 μL，置于人工培養(yǎng)箱內(溫度25 ℃、濕度80%、無光照)。于裝有3類分解基質的三角瓶中加入300 μL滅菌水作為對照處理，其他培養(yǎng)條件同前。降解試驗持續(xù)80天，每隔20天取樣1次，共取樣4次，每次每種處理每種基質取樣3瓶，共288瓶。

用鑷子將經降解后的可燃物小心取出，置于滅菌后的培養(yǎng)皿中，往培養(yǎng)皿中加入無菌水，多次漂洗可燃物，并用鑷子將菌絲與調落物分離。處理后的可燃物樣品放入65 ℃烘箱中烘干至恒質量，粉碎，過40目篩備用。

1.2.4 野外降解樣地設置 在帽兒山實驗林場的胡桃楸、興安落葉松以及胡桃楸×興安落葉松混交林內，各設置3個20 m×20 m的標準地，每個標準地內隨機設置9個1 m×1m的小樣方，作為降解試驗點。

1.2.5 地表可燃物野外降解試驗 準確稱取采回的凋落葉10 g，裝進大小為15 cm×10 cm、孔徑90目的尼龍凋落物袋中，3種林型各裝540袋，共1 620袋，并用記號筆在凋落物袋上標記林型與樣品號，稱重并記錄每袋樣品初始質量。在設置好的每個小樣方內各放置對應林型的18袋可燃物，另將不作任何處理的對照凋落物袋按林型隨機放置在不同小樣方內。

選取經1.2.3篩選出的2株纖維素高效降解真菌A4[緊密帚枝霉(Sarocladiumstrictum)]與A2[肉色隔孢伏革菌(Peniophoraintranata)]作為野外降解試驗供試菌種。在無菌操作臺內打開純培養(yǎng)的供試菌株平板，用已滅菌的打孔器(外徑6 mm)在菌絲生長旺盛區(qū)域制取菌餅，將40個菌餅接入裝有400 mL添加了吐溫80的麥芽浸粉培養(yǎng)基(Leeetal., 2015)的1 000 mL三角瓶中，于28 ℃、180 r·min-1下恒溫振蕩培養(yǎng)5天，用滅菌的8層紗布過濾，得到2種供試菌種的菌懸液，設置低、中、高3種劑量分別為50、200和400 mL。混合菌劑為2種菌懸液等體積混合，劑量同上。為方便描述，菌株A2、菌株A4以及2菌株混合制得菌劑分別記為菌劑A、菌劑B、菌劑C。將制備好的3種降解劑分別裝瓶備用。3種不同劑型(菌劑A、菌劑B、菌劑C)、3種劑量(低、中、高)將不同菌劑對應噴灑到設置好的9個小樣方內裝有可燃物的凋落物袋上，噴灑需盡量均勻，使袋內可燃物均能接觸到菌劑。3種林型的每塊標準地均作相同處理。

于噴灑后每月分別采集經菌劑處理和未作處理(對照)的凋落物袋，帶回實驗室，于80 ℃烘箱中烘干至恒質量，稱質量后將可燃物粉碎，過40目篩備用。

1.2.6 綜纖維素(纖維素與半纖維素)含量測定 采用纖維測定儀，根據Van Soest(1963)的方法，測定綜纖維素質量分數。精確稱取1 g(記為m)樣品，放入裝有灰化后的硅藻土的坩堝(40～100 μm)中。用中性洗滌劑(3%十二烷基硫酸鈉溶液)在消煮管中加熱消煮60 min。經消煮后，殘渣由半纖維素、纖維素、木質素和硅酸鹽組成，干燥后稱質量記為A。樣品再用酸性洗滌劑(2%十六烷基三甲基溴化銨溶液)消煮60 min，剩余物為纖維素、木質素和硅酸鹽。樣品在室溫下用12 mol·L-1硫酸消解，剩余物干燥后稱質量記為B，為木質素和硅酸鹽。隨后于550 ℃馬弗爐中灰化2 h。冷卻至室溫后，剩余物稱質量記為C，即硅酸鹽的質量。

(1)

綜纖維素降解率=(C0-Ct)/C0×100%。

(2)

式中：C0為初始綜纖維素質量分數；Ct為降解后綜纖維素質量分數。

1.2.7 掃描電鏡觀察 借助掃描電鏡，觀察地表可燃物不同降解階段的真菌生長情況。隨機選取經高活性纖維素酶菌株培養(yǎng)后的可燃物葉片，自然干燥后用解剖刀片取小塊，并切開葉片露出縱切面，將其粘在掃描電鏡樣品盤上。采用離子濺射儀對樣品表層進行噴金處理，利用日本電子JSM-7500F掃描電鏡對葉片樣品進行觀察和分析。

1.2.8 數據處理 采用Microsoft Excel 2016和Origin 2018軟件對數據進行計算與作圖； 利用單因素方差分析Student-Newman-Keuls(SNK)多重比較法分析闊葉、針葉及混交基質經不同菌株處理后綜纖維素質量分數以及綜纖維素降解率的差異顯著性。

2 結果與分析

2.1 纖維素降解菌的分離與篩選

孟加拉紅培養(yǎng)基中含有氯霉素，對細菌生長具有抑制作用。根據不同的菌落形態(tài)，用孟加拉紅培養(yǎng)基分離出約15個菌株。其中，來自云杉人工林4株、水曲柳6株、興安落葉松2株以及胡桃楸3株，分別記為A1、A2、A3、A4、B1、B2、B3、B4、B5、B6、C1、C2、D1、D2和D3。

15株真菌均在CMC-Na培養(yǎng)基上培養(yǎng)，經染色和脫色后，菌落周圍水解圈的大小因菌種而異。8個菌株的水解圈比較明顯(圖1)，分別為A2、A3、A4、B2、B4、B6、D2和D3。表1列出了菌落直徑與水解圈直徑的測量結果，水解圈直徑在5.24～13.43 mm之間。水解圈顯示了這些真菌產生的纖維素酶的活性并且表明真菌本身能夠降解纖維素。8個菌株的纖維素分解指數在1.89～3.19之間。其中，菌株B2的纖維素分解指數顯著高于其他供試菌株(P<0.05)，說明菌株B2產酶潛力最大。以上8個分離株用于進一步的篩選。

圖1 真菌菌落和水解圈在CMC-Na培養(yǎng)基上的生長情況

表1 菌落和水解圈直徑測量結果①

2.2 纖維素降解菌的鑒定

將8株菌的ITS序列與Genbank中的模式菌株及親緣關系較近的菌株進行序列比對，用非加權組平均法(UPGMA法)構建系統(tǒng)發(fā)育樹(圖2)，結合形態(tài)學特征將B2、A4、A3、A2、D2、B4、C2、D3分別鑒定為枝細枝孢、緊密帚枝霉、Pleosporales sp.、肉色隔孢伏革菌、Fungal sp.、臭曲霉、Dothideomycetes sp.和灰黃青霉。

2.3 地表可燃物室內降解

由圖3可知，在整個室內降解試驗期間，分解基質中綜纖維素質量分數隨天數增加呈下降趨勢。闊葉基質初始綜纖維素質量分數為30.4%。降解試驗持續(xù)20天后，綜纖維素質量分數根據菌種的不同下降到28.0%～29.5%，與對照相比下降了0～4.6%，差異不顯著(圖3)。降解試驗持續(xù)80天后，綜纖維素質量分數下降到18.2～22.4%。經菌種A4、A2、B4、D2、C2與D3菌液處理后的闊葉基質綜纖維素質量分數均顯著低于對照(P<0.05)。從整體上看，菌株A4降解綜纖維素的能力最強(80天后與對照相比下降25.7%)，其次是菌株A2(與對照相比下降24.4%)，而菌株A3的降解能力最弱(與對照相比僅下降8.6%)。然而，上文提到菌株B2的纖維素分解指數為最高(表1)，經SNK檢驗卻與對照無顯著差異。這說明纖維素酶活性最強的菌株分解地表可燃物中天然纖維素的能力不一定最強。此外，在降解過程中，綜纖維素質量分數出現一定波動，這表明水溶性化合物的分解導致自身濃度降低，使纖維素相對濃度有所增加。

圖2 纖維素降解菌的rDNA-ITS序列系統(tǒng)發(fā)育樹

針葉基質和針闊混交基質的初始綜纖維素質量分數分別為37.0%和33.4%。20天后，在8菌株的培養(yǎng)下，2種基質綜纖維素質量分數下降到25.9%～29.5%和26.1%～29.0%，與對照相比均無顯著差異(圖3)。在此期間，菌株A3對針葉可燃物、菌株A2對針闊混交可燃物中綜纖維素的分解能力最強，菌株D3和B4最弱。80天后，針葉基質與混交基質綜纖維素質量分數分別下降到21.8%～26.3%和19.9%～25.6%。除B2外，經其他菌種處理后的針葉基質綜纖維素質量分數均與對照有顯著差異(P<0.05)。A4為對2種可燃物綜纖維素降解效果最好的菌株(與對照相比分別下降30.3%和27.1%)。這說明在其他菌種對纖維素的降解率增幅減小時，A4的降解能力突顯。對于綜纖維素的降解，擔子菌為最有效的降解者，因為許多擔子菌生長在富含纖維素的枯木或落葉上，利用一組通常由內切葡聚糖酶、纖維二糖水解酶和β-葡萄糖苷酶組成的水解酶系降解纖維素(Baldrianetal., 2008)。以上結果表明，從云杉人工林中篩選出的菌株A4對3種基質的降解效果均較好，適于林地可燃物降解。

圖3 降解試驗不同階段不同菌株培養(yǎng)后闊葉、針葉及混交基質綜纖維素質量分數變化

2.4 超微結構觀察

菌株A4與其他菌株相比表現出更強的降解綜纖維素的能力。借助掃描電鏡觀察其菌絲附著在葉片表面并侵入葉片組織的生長情況。降解試驗持續(xù)20天后，葉片表面菌絲數量較少且形態(tài)簡單(圖4a)，可見由氣生菌絲產生的瓶梗，葉片表面可見經其釋放出的分生孢子(圖4d)，形似一串串葡萄狀； 降解持續(xù)80天后，菌絲布滿整個葉片，形成稠密的網狀(圖4b)，菌絲側端有指狀分枝沿葉片表面延伸，菌絲體發(fā)達，較粗，有大量孢子附著(圖4e)； 對照組葉片表面無任何菌絲附著(圖4c與4f)。

經降解20天后，葉片縱切面未見明顯菌絲和孢子(圖5a與5d)； 降解80天后，在葉片縱切面細胞組織間，有少量菌絲開始侵入及少量孢子附著(圖5e)，與對照組潔凈的葉片縱切面對比鮮明(圖5f)。菌株A4是1株高效綜纖維素降解菌，具有侵入葉片組織和降解葉片中綜纖維素的能力。

2.5 地表可燃物野外降解如圖6可知，野外降解持續(xù)6個月后，經小劑量A、B和C菌劑處理后的胡桃楸基質綜纖維素降解率均高于對照，分別達15.15%、13.96%和17.85%，分別比對照高11.75%、10.56%和14.45%，無顯著差異； 經中劑量3種不同處理后，綜纖維素降解率分別為19.58%、18.90%和19.97%，比對照高15.05%、14.37%和15.44%，且差異顯著(P<0.05)； 經大劑量A、B和C菌劑降解6個月后，闊葉基質中綜纖維素降解率分別增大到18.91%、19.01%和25.87%，較對照高15.51%、15.61%和22.47%，其中經菌劑C培養(yǎng)后的基質綜纖維素降解率達對照組的7.6倍，差異顯著(P<0.05)。

至降解試驗結束，經小劑量的3種菌劑處理后的落葉松基質綜纖維素降解率為12.84%～14.71%，與對照組差值為7.82%～9.69%，降解程度整體小于胡桃楸基質； 中劑量菌劑處理后針葉基質綜纖維素降解率為15.78%～18.37%，與對照組差值為10.76%～13.35%； 大劑量菌劑處理后的針葉基質綜纖維素降解率為19.14%～21.68%，比對照組高14.12%～16.66%，降解效果較闊葉基質差。

降解試驗結束時，混交可燃物基質經小劑量3種菌劑處理后綜纖維素降解率從大到小順序為菌劑C、菌劑B、菌劑A，分別比對照高13.24%、12.37%和11.77%； 混交基質經中劑量A、B、C菌劑降解6個月后，其綜纖維素降解率均顯著高于對照，分別比對照高15.05%(P<0.05)、14.37%(P<0.05)和15.44%(P<0.05)； 經大劑量菌劑處理后，基質綜纖維素降解率為菌劑C(22.16%)>菌劑B(20.32%)>菌劑A(19.51%)。

圖4 經A4菌液培養(yǎng)后胡桃楸葉片表面菌株生長電鏡觀察

圖5 經A4菌液培養(yǎng)后的胡桃楸葉片縱切面菌株生長電鏡觀察

圖6 不同菌劑處理后闊葉、針葉及混交基質綜纖維素降解率變化

3 討論

纖維素是森林地表可燃物的主要組分，其降解在森林可燃物分解過程中至關重要。帽兒山地區(qū)由于地處中溫帶，地表可燃物的分解受到很大程度的制約，其堆積造成森林火災隱患。加快森林地表可燃物的分解是降低森林火險等級的重要途徑之一(國家林業(yè)局森林防火辦公室， 2003)。纖維素降解菌能通過自身酶系統(tǒng)的作用逐步將地表可燃物中復雜的纖維素大分子分解為簡單的葡萄糖小分子，從而降解可燃物。本研究篩選出8株高活性纖維素酶菌株，對可燃物基質均發(fā)生不同程度的降解，但降解能力強弱與纖維素分解指數大小并不順序相符，分解指數最大的菌種的降解能力并非最強。推測不同菌株達到最大酶活力所需的時間不同，菌株在CMC-Na培養(yǎng)基上產生的水解圈大小與其產生的纖維素降解酶活力之間的相關性不是很強，說明采用此方法只能為定性判斷菌株是否具有降解纖維素的能力提供參考。本研究中，A4為降解地表可燃物中纖維素能力最強的菌株，但是單一菌株無法產生完整的纖維素降解酶系。若提高纖維素降解效果，還需多種酶之間的協(xié)同作用。另外，由于室內降解試驗條件的可控性強，所得結果有一定局限性，野外環(huán)境影響因素較多，由室內試驗篩選出的菌株是否在野外仍有較強降解能力，還需進一步驗證。因此，本研究在室內試驗基礎上進行了野外降解試驗，選用由室內試驗篩選出的高效降解菌制成單一菌劑，同時用2株纖維素降解菌構建成混合菌劑，分別對地表可燃物樣品進行噴灑。結果表明，單一菌劑與混合菌劑均對野外地表可燃物有降解效果，且后者降解效果優(yōu)于前者，充分體現了2株菌在綜纖維素降解過程中的協(xié)同作用。后續(xù)研究可混合培養(yǎng)多個纖維素降解菌株，摸索其最佳產酶條件，構建纖維素降解復合菌系，還可加入對纖維素降解菌不具拮抗作用的木質素降解菌，協(xié)同降解森林地表可燃物。

4 結論

本研究共分離出15株真菌并從中篩選出了8株高活性纖維素酶菌株。室內降解試驗表明，菌株A4(緊密帚枝霉)為本研究篩選出的纖維素高效降解真菌，菌株A2(肉色隔孢伏革菌)次之。野外降解試驗表明，施加菌劑的3種基質綜纖維素降解效果均優(yōu)于對照組，對于施加同種劑型的可燃物，不同劑量使可燃物基質綜纖維素降解率排序為大劑量>中劑量>小劑量>對照； 3種可燃物基質綜纖維素呈現出相同的降解規(guī)律，綜纖維素降解率表現為菌劑C(A4+A2) >菌劑B(A4)>菌劑A(A2)>對照，即混合菌劑降解效果優(yōu)于由菌株A4及A2制得的單一菌劑。綜上所述，菌株A4在自然條件下對地表可燃物中綜纖維素也表現出較強降解能力，且與其他纖維素降解菌種構建的混合菌劑對可燃物中綜纖維素降解效果更佳，可在后續(xù)試驗中探討最佳產酶條件，進一步提高復合菌系的降解能力。