王 寧，袁美麗，安瑞云

(1.河南科技大學(xué)林學(xué)院，河南 洛陽 471023；2.洛陽市隋唐城遺址植物園，河南 洛陽 471002)

低溫是影響植物區(qū)域性分布的重要限制因素[1-3]。輕度低溫脅迫會影響植物葉、莖等形態(tài)指標以及生物量的變化，而嚴重低溫會引起植物新陳代謝紊亂甚至導(dǎo)致植株死亡[4-5]。光合作用是植物生長發(fā)育的基礎(chǔ)，也是植物對低溫較為敏感的生理過程之一。葉綠素?zé)晒饽芴綔y植物葉片的光合能力及熱耗散情況，因此環(huán)境變化對植物光合過程的影響可通過葉綠素?zé)晒馓匦詠矸从砙6]。與常見植物抗逆性研究中利用的電導(dǎo)法、組織褐變法和氯化三苯基四氮唑(triphenyl tetrazolium chloride, TTC)還原法相比，葉綠素?zé)晒夥治黾夹g(shù)不僅具有快速、靈敏的特性，更重要的是可無損傷的探測逆境條件下完整植株的光合作用情況，因此被廣泛應(yīng)用于植物光合結(jié)構(gòu)功能及其對環(huán)境脅迫適應(yīng)性的評價研究[7]。

樟[Cinnamomumcamphora(L.) J. Presl]是珍貴的經(jīng)濟樹種,根據(jù)其樟油化學(xué)成分不同，可分本樟(camphor-type)(含樟腦為主)，芳樟(linalool-type)(含芳樟醇為主)和油樟(terpineol-type)(含松油醇為主)3個類型。我國北方地區(qū)的常綠闊葉樹種相對匱乏，開展樟屬植物抗寒性研究，可為樟樹耐寒品種選育及北方地區(qū)常綠闊葉樹種的引種應(yīng)用提供參考。目前，已有從葉片解剖結(jié)構(gòu)[8-9]及SOD等生理生化指標方面[10]對多種樟樹的抗寒性進行了研究，并對自然降溫過程中猴樟(C.bodinieriLévl)和芳樟[C.camphora(linalool-type)]的葉綠素?zé)晒鈪?shù)變化進行了探討[11]，但通過人工設(shè)置低溫結(jié)合葉綠素?zé)晒夥治黾夹g(shù)進行不同種樟樹的抗寒性研究尚未見有報道。為此，通過人工模擬低溫環(huán)境，從葉綠素、抗氧化酶系統(tǒng)、滲透調(diào)節(jié)物質(zhì)以及葉綠素?zé)晒鈪?shù)等方面，比較芳樟和油樟[C.camphora(terpineol-type)]抗寒性強弱，旨在為耐寒樟樹品種選育提供參考。

1 材料與方法

1.1 材料

供試材料為1 年生實生油樟和芳樟幼苗，種子均來源于湖南省長沙縣跳馬鎮(zhèn)。試驗地位于河南省鄭州市河南農(nóng)業(yè)大學(xué)第三生活區(qū)，北緯34°16′，東經(jīng)112°42′，屬北溫帶大陸性季風(fēng)氣候，年均氣溫15.6 ℃，1月份最冷，月平均氣溫2.15 ℃，年均降雨量649.9 mm。2018年8月，選擇生長健康的植株移栽至花盆內(nèi)(盆口直徑25 cm，高30 cm)，1株 · 盆-1，盆土為沙壤土。緩苗1周后進行常規(guī)日常管理。

1.2 研究方法

1.2.1 低溫脅迫 2018年8月15日，選擇長勢良好、大小相近的2種樟樹幼苗各60盆，移入人工氣候室(浙江大學(xué)電器設(shè)備廠)，于20 ℃、光照12 h· d-1的條件下培養(yǎng)5 d。之后，設(shè)置降溫速度為2 ℃· h-1，分別降溫到0、6、12 ℃，并低溫脅迫0(CK)、2、4、6 d進行抗寒指標的測定。

1.2.2 指標測定 利用便攜式調(diào)制葉綠素?zé)晒鈨xMini-PAM(德國Walz公司)進行葉綠素?zé)晒鈪?shù)的測定。每盆選取植株下部成熟葉2片，每處理測定5株。首先，用暗適應(yīng)葉夾處理待測葉片，暗適應(yīng)30 min，獲取初始熒光(F0)、最大熒光(Fm)。并求出光系統(tǒng)Ⅱ(photosystem Ⅱ，PSⅡ)最大光化學(xué)效率(Fv/Fm)，F(xiàn)v/Fm=(Fm-F0)/Fm。

每處理隨機選取3盆植株，每株選取3片健康成熟的功能葉片進行生理指標的測定。采用質(zhì)量分數(shù)為95%乙醇法測定葉綠素(chlorophyll，Chl)含量；酸性茚三酮法測定脯氨酸(proline，Pro)含量；氮藍四唑光還原法測超氧化物歧化酶(superoxide dismutase，SOD)活性；硫代巴比妥酸法測定丙二醛(malondialdehyde，MDA)含量；電導(dǎo)法測定相對電導(dǎo)率(relative conductivity，REC)[12]。

1.2.3 耐寒性評價 利用模糊隸屬函數(shù)法[13-15]對2種樟樹葉綠素?zé)晒鈪?shù)及生理指標進行分析，計算每項指標的隸屬值，公式如下:

f(xi)=(Xi-Xmin)/(Xmax-Xmin)

(1)

f(xi)=1-(Xi-Xmin)/(Xmax-Xmin)

(2)

式中：Xi為指標測定值，Xmax、Xmin分別為該指標的最大值和最小值。若某一指標性狀與抗寒性呈正相關(guān)，選用公式(1)，若呈負相關(guān)則用公式(2)。根據(jù)上述公式計算每一指標在不同低溫脅迫下的隸屬值，最后把同一樹種各項耐寒指標隸屬函數(shù)值累加，取平均值為綜合評價值(D)，D值越大，耐寒性越強。

1.3 數(shù)據(jù)處理與分析

使用SPSS 18.0對數(shù)據(jù)進行統(tǒng)計分析。

2 結(jié)果與分析

2.1 低溫脅迫對2種樟樹抗寒生理指標的影響

2.1.1 葉綠素含量 隨脅迫時間的延長，不同低溫處理下油樟和芳樟的葉綠素含量整體均呈下降的趨勢(表1)。其中，6和12 ℃條件下，處理2、4和6 d，2種樟樹的葉綠素含量與CK相比差異均不顯著；0 ℃條件下6 d時，油樟和芳樟的葉綠素含量分別較CK下降了17.38%和33.33%，其中，油樟的葉綠素含量與CK差異不顯著，而芳樟則與CK差異達到顯著水平(P<0.05)。由此說明，0 ℃條件下連續(xù)6 d的低溫脅迫已對芳樟的葉綠素合成及降解或葉綠體結(jié)構(gòu)造成了一定的負面影響。

表1 低溫脅迫對2種樟樹葉綠素含量的影響Table 1 Effect of low temperature on chlorophyll content in the leaves of the two camphor species

2.1.2 超氧化物歧化酶活性 從表2可看出，不同低溫處理下，2種樟樹的SOD活性均隨脅迫時間的延長呈持續(xù)增加的趨勢，表明2種樟樹的SOD活性均參與了其低溫脅迫的響應(yīng)過程。與CK相比，至第6天時，6和12 ℃條件下2種樟樹的SOD活性增加均未達到顯著水平；0 ℃條件下至第6天時，油樟的SOD活性與CK差異顯著(P<0.05)，而芳樟則未達到差異顯著水平，此外，至第6天時，油樟SOD活性的增幅為38.10%，明顯大于芳樟的30.35%。由此表明，油樟通過增加SOD活性清除由于低溫脅迫所產(chǎn)生活性氧自由基的能力大于芳樟。

表2 低溫脅迫對2種樟樹SOD活性的影響Table 2 Effect of low temperature on SOD activity in the leaves of the two camphor species

2.1.3 丙二醛含量 不同低溫處理下，2種樟樹的MDA含量均隨脅迫時間的延長而呈持續(xù)增加的趨勢(表3)。其中，6和12 ℃條件下，2、4和6 d時，2種樟樹的MDA含量與CK相比差異均不顯著；0 ℃條件下至第6天時，油樟和芳樟的MDA含量分別較CK增加了26.06%和63.03%，其中，芳樟MDA含量與CK差異達到顯著水平(P<0.05)，而油樟的MDA含量與CK差異不顯著。由此表明，連續(xù)6 d的0 ℃低溫脅迫已一定程度地造成了芳樟葉片細胞膜質(zhì)過氧化損傷。

2.1.4 相對電導(dǎo)率 隨脅迫時間的延長，不同低溫處理下2種樟樹的相對電導(dǎo)率均呈逐漸增加的趨勢(表4)。其中，12 ℃條件下，2、4和6 d時，油樟和芳樟的相對電導(dǎo)率與CK差異均不顯著；6 ℃條件下，2、4和6 d時，油樟相對電導(dǎo)率與CK差異不顯著，而第6天芳樟則達到差異顯著水平(P<0.05)；0 ℃條件下，油樟在脅迫至第6天時與CK差異顯著，而芳樟則在第4天時與CK差異達到顯著水平(P<0.05)。結(jié)果表明，低溫對2種樟樹葉片細胞膜透性造成了一定影響，隨處理溫度的下降及脅迫時間的延長，電解質(zhì)的外滲呈逐漸增加的變化，但2種樟樹間又存在一定的差異，這可能與它們的低溫適應(yīng)能力不同有關(guān)。

表3 低溫脅迫對2種樟樹MDA含量的影響Table 3 Effect of low temperature on MDA content in the leaves of the two camphor species

表4 低溫脅迫對2種樟樹相對電導(dǎo)率的影響Table 4 Effect of low temperature on relative conductivity in the leaves of the two camphor species

2.1.5 脯氨酸含量 隨脅迫時間的延長，不同低溫處理下油樟和芳樟葉片內(nèi)脯氨酸含量均呈持續(xù)增加的趨勢(表5)。但直至脅迫6 d時，0、6及12 ℃處理下2種樟樹脯氨酸含量與CK差異均未達到顯著水平。其中，0 ℃條件下脅迫至6 d時，油樟脯氨酸含量較CK增加了22.65%，高于芳樟的22.18%。

表5 低溫脅迫對2種樟樹脯氨酸含量的影響Table 5 Effect of low temperature on proline content in the leaves of the two camphor species

2.2 低溫脅迫對2種樟樹葉綠素?zé)晒鈪?shù)的影響

2.2.1 初始熒光(F0) 從表6可看出，12 ℃條件下，2種樟樹的F0均呈先降后升的趨勢，而0和6 ℃條件下，則均呈持續(xù)增加的變化。其中，12 ℃條件下至第6天時，油樟和芳樟的F0與CK差異均不顯著；6 ℃條件下，油樟F0在第6天與CK差異不顯著，而芳樟則是在脅迫的第6天與CK差異達到顯著水平(P<0.05)；0 ℃條件下，油樟和芳樟F0分別在脅迫的第6天及第4天時與CK差異達到顯著水平(P<0.05)，至第6天時，分別較CK增加了29.69%、59.60%。由此表明，12 ℃條件下短時間的低溫脅迫并未對2種樟樹PSⅡ反映中心造成傷害，F(xiàn)0的降低可能是PSⅡ的熱耗散增加所致，之后，隨著脅迫溫度下降及時間延長，F(xiàn)0均呈持續(xù)增加的變化，表明低溫脅迫已對PSⅡ反映中心造成了一定的傷害。

2.2.2 最大光化學(xué)效率(Fv/Fm) 隨脅迫時間的延長，不同低溫處理下2種樟樹Fv/Fm呈持續(xù)下降的趨勢(表7)。其中，6和12 ℃條件下至第6天時，油樟和芳樟的Fv/Fm與CK差異均不顯著；0 ℃條件下至第6天時，油樟的Fv/Fm與CK差異不顯著，而芳樟則達到差異顯著水平(P<0.05)。

表6 低溫脅迫對2種樟樹初始熒光(F0)的影響Table 6 Effect of low temperature on initial fluorescence in the leaves of the two camphor species

表7 低溫脅迫對2種樟樹最大光化學(xué)效率(Fv/Fm)的影響Table 7 Effect of low temperature on maximum photochemical efficiency of PSⅡ in the leaves of the two camphor species

2.3 耐寒性綜合評價

利用隸屬函數(shù)法求出油樟和芳樟葉綠素含量、相對電導(dǎo)率、脯氨酸、MDA含量以及Fv/Fm等7個指標的隸屬值，累加后得出每種樟樹的平均隸屬值，即綜合評價值(D)，D值越大則耐寒性越強。根據(jù)綜合評價值可知(表8)，油樟的耐寒性大于芳樟。

表8 低溫脅迫下2種樟樹個指標隸屬函數(shù)值、綜合評價值及排序Table 8 Subjective function value, comprehensive evaluation value(D), and order of the two camphor species under cold stress

3 討論與結(jié)論

低溫會導(dǎo)致葉綠體的降解，并抑制葉綠素的合成，因此葉綠素含量的穩(wěn)定性一定程度上反映了低溫脅迫對植物的傷害程度[16-18]。本研究中，隨脅迫時間的延長，不同低溫條件下2種樟樹的葉綠素含量呈逐漸下降的變化趨勢，表明低溫脅迫對其葉綠素的合成及降解產(chǎn)生了一定的影響。但僅在0 ℃條件下脅迫至第6天時，芳樟葉綠素含量較CK下降達到顯著水平(P<0.05)，由此表明，與芳樟相比，相同低溫條件下油樟依然可保持相對穩(wěn)定的葉綠素含量，從而有利于其光合作用，達到減輕低溫脅迫對其造成的傷害。

相對電導(dǎo)率的改變反映了細胞膜透性的變化，逆境條件下植物細胞膜透性增大，細胞內(nèi)電解質(zhì)外滲增加，造成電導(dǎo)率的增大[19-21]。MDA作為膜質(zhì)過氧化反應(yīng)的最終產(chǎn)物，其含量成為膜質(zhì)受傷害程度的重要反映指標。CAMPOSetal[22]認為MDA的含量反映了膜質(zhì)過氧化水平，以及細胞膜受損程度和植物逆境脅迫的抵御能力。而SOD作為植物體內(nèi)重要的活性氧自由基清除酶，其活性大小與植物的抗氧化脅迫能力呈正相關(guān)，因此MDA含量及SOD活性常被作為植物抗逆性的重要評價指標[23]。本研究中，2種樟樹的相對電導(dǎo)率隨脅迫溫度的下降及處理時間的延長均呈持續(xù)增加的變化，表明低溫脅迫導(dǎo)致了二者葉片細胞膜透性的逐漸增大。此外，6 ℃條件下至第6天時，芳樟相對電導(dǎo)率與CK差異顯著，而油樟差異不顯著；0 ℃條件下，油樟和芳樟分別在第6天及第4天時與CK差異達到顯著水平(P<0.05)。此外，2種樟樹的MDA含量及SOD活性均隨處理溫度降低及脅迫時間延長呈持續(xù)增加的變化。且0 ℃條件下至第6天時，芳樟的MDA含量較CK增加顯著(P<0.05)，且此脅迫條件下油樟的SOD活性較CK增加顯著(P<0.05)，而芳樟則不顯著，且油樟SOD活性大于芳樟。由此表明，芳樟SOD保護酶對低溫脅迫產(chǎn)生的活性氧自由基清除能力小于油樟，致使其膜質(zhì)過氧化水平大于油樟，從而造成其受低溫脅迫程度的增大。

逆境條件下，植物通過增加體內(nèi)脯氨酸等滲透調(diào)節(jié)物質(zhì)含量維持細胞的膨脹狀態(tài)，從而達到降低水勢和保持某些生物大分子活性以減輕植物細胞的脅迫損傷[24]。本研究中，低溫脅迫中油樟和芳樟的脯氨酸含量均呈持續(xù)增加的變化，表明2種樟樹均通過脯氨酸含量的增加抵御外界低溫的持續(xù)脅迫。與芳樟相比，相同條件下油樟脯氨酸含量增加更為明顯，這可能與其耐寒性較強有關(guān)。

初始熒光(F0)由PSⅡ捕光葉綠素蛋白復(fù)合物發(fā)出，一般情況下，數(shù)值保持穩(wěn)定，當(dāng)光合機構(gòu)受到破壞時則會升高[25]。Fv/Fm值的大小可反映PSⅡ原初光能轉(zhuǎn)換效率的高低，因此常被用于植物的抗逆性研究。Fv/Fm值降低表明植物受到光抑制，低溫脅迫下變化幅度越小表明植物耐低溫能力越強[26]。本研究中，12 ℃條件下油樟和芳樟的F0呈先升后降的變化，而Fv/Fm則均呈下降的變化，但至第6天時，F(xiàn)0和Fv/Fm與CK差異均不顯著，表明12 ℃的低溫雖然影響了2種樟樹的正常光合作用過程，使PSⅡ原初光能轉(zhuǎn)化效率短暫下降，但潛在活性中心并未受損。之后，油樟F0和Fv/Fm在0 ℃條件下至第6天時與CK差異達到顯著水平；而芳樟則分別在6 ℃條件下至第6天時及0 ℃條件下至第4天時與CK差異達到顯著水平。由此可知，相同條件下2種樟樹的PSⅡ反應(yīng)中心受低溫脅迫的損傷程度因其耐寒性不同而存在一定差異，其中又以油樟對同等低溫脅迫的適應(yīng)能力較強。

植物的抗寒性是受多因素共同影響的復(fù)雜生理過程，而隸屬函數(shù)分析則是在多指標測定基礎(chǔ)上，對植物耐寒性進行綜合評價的簡單且有效地方法，且可避免使用某單一指標進行評價而造成的片面性，因此，隸屬函數(shù)法作為有效的評價方法被廣泛應(yīng)用于如核桃[27]、板栗[28]等植物的抗寒性評價研究。本研究依據(jù)隸屬函數(shù)法計算了與樟樹耐寒性關(guān)系密切的SOD、MDA以及F0、Fv/Fm等7個指標的平均隸屬度，對2種樟樹耐寒性進行了綜合評價分析，表明油樟的耐寒性大于芳樟。本研究僅在室內(nèi)條件下，從不同低溫及持續(xù)時間兩方面，結(jié)合生理生化指標的測定證實了油樟耐寒性大于芳樟，而北方地區(qū)的冬季低溫不僅有極端最低溫，還包括驟然降溫及升溫等多種情況，因此不同種樟樹在北方地區(qū)的引種應(yīng)用還需更深一步的研究。