文│張小香 張士海（北京市昌平區(qū)畜牧水產(chǎn)技術(shù)推廣站）

朱寬峰（北京田園奧瑞生物科技有限公司）

精液質(zhì)量分析系統(tǒng)測(cè)定精子密度方法：在固定顯微鏡放大倍數(shù)和攝像頭的情況下，攝像機(jī)的視野大小固定，以米尼圖分析系統(tǒng)為例，20倍物鏡下攝像頭視野大小為563微米×563微米。此時(shí)采用厚度為20微米的精子計(jì)數(shù)板，則視野中精液體積為（0.563×0.563×0.02）毫米3＝6.34×10-6（毫升），計(jì)數(shù)多個(gè)全視野精子數(shù)求平均值x，則可計(jì)算出檢測(cè)樣品精子密度＝0.158x×106/毫升，再乘以稀釋倍數(shù)則可計(jì)算出原始樣品精子密度。

血球計(jì)數(shù)板法：計(jì)數(shù)5個(gè)面積為0.2毫米×0.2毫米，厚度為0.1毫米（中方格尺寸）區(qū)域的精子數(shù)x，然后可計(jì)算出精子密度＝x/（0.2×0.2×0.1×5）＝5x×104，再乘以稀釋倍數(shù)即得到原始樣品精子密度（圖1）。

綜上所述，以上兩種方法的物理原理一樣，都是通過(guò)固定計(jì)數(shù)范圍和特定厚度計(jì)數(shù)室來(lái)規(guī)定抽樣樣品的體積，然后對(duì)規(guī)定范圍內(nèi)的精子進(jìn)行計(jì)數(shù)，根據(jù)計(jì)數(shù)結(jié)果計(jì)算出單位體積的精子數(shù)，即精子密度。

這兩種方法主要的不同之處在于，血球計(jì)數(shù)板法一般是由人工計(jì)數(shù)，而精液質(zhì)量分析系統(tǒng)是由計(jì)算機(jī)計(jì)數(shù)。受限于人工計(jì)數(shù)能力，5個(gè)中方格精子數(shù)超過(guò)200就很難數(shù)了，這就要求更大的稀釋倍數(shù)，并且只能檢測(cè)不動(dòng)的精子。而計(jì)算機(jī)計(jì)數(shù)一個(gè)視野幾百個(gè)很正常，幾個(gè)視野下來(lái)累計(jì)計(jì)數(shù)1000個(gè)以上很容易，并且能和精子活力同時(shí)檢測(cè)，并且不用高倍稀釋。計(jì)數(shù)數(shù)量小和高倍稀釋會(huì)導(dǎo)致血球計(jì)數(shù)板法抽樣誤差更大，計(jì)算機(jī)檢測(cè)相反。根據(jù)不重復(fù)抽樣誤差公式，從一支牛凍精約0.25億總精子數(shù)中計(jì)數(shù)200個(gè)精子的抽樣誤差為u血＝Sx×［（1-200/2.5億）/200］0.5＝0.071Sx，而計(jì)數(shù)1000個(gè)的抽樣誤差為u機(jī)＝Sx×［（1-1000/2.5億）/1000］0.5＝0.032Sx，其中Sx表示樣本標(biāo)準(zhǔn)差?？梢?jiàn)計(jì)算機(jī)計(jì)數(shù)的抽樣誤差僅為血球計(jì)數(shù)板法的1/4～1/2。

◎圖1 血球計(jì)數(shù)板計(jì)數(shù)室示意圖

人工計(jì)數(shù)準(zhǔn)確性更高，計(jì)算機(jī)計(jì)數(shù)要低一些，文獻(xiàn)和實(shí)際經(jīng)驗(yàn)顯示，計(jì)算機(jī)識(shí)別準(zhǔn)確率可達(dá)95%以上。

血球計(jì)數(shù)板法計(jì)數(shù)是在事先劃好線(xiàn)的方格內(nèi)，精液質(zhì)量分析系統(tǒng)的計(jì)數(shù)范圍是整個(gè)攝像頭視野。由于邊緣精子會(huì)導(dǎo)致精子無(wú)法被計(jì)算機(jī)識(shí)別，存在邊緣精子識(shí)別誤差。以米尼圖分析系統(tǒng)為例，按精子一半落在視野外就不被識(shí)別計(jì)算，豬精子的頭部長(zhǎng)度為8微米，一半即為4微米，邊緣區(qū)面積占視野總面積比例為（563×4×4-4×4×4）/5632=2.82%，精子落在此范圍內(nèi)的概率即為2.82%，即邊緣精子識(shí)別導(dǎo)致的誤差為2.82%。由于精子取向不同，上述情況只是誤差最大的情形，因此是最大誤差。最小誤差情形是精子一半寬度在邊緣外，豬精子寬約4微米此時(shí)誤差為（563×2×2-2×2×4）/5632＝0.71%。即邊緣誤差在0.71%～2.82%，平均為1.76%。實(shí)際誤差和精子與視野相對(duì)大小有關(guān)，精子越小，視野越大則邊緣誤差越小。

血球計(jì)數(shù)板計(jì)數(shù)室厚度為100微米，加工誤差為1微米的情況下由厚度導(dǎo)致的誤差為1%，而20微米的計(jì)數(shù)板則為5%，10微米的計(jì)數(shù)板則達(dá)到了10%。因此，在相同誤差要求的情況下，計(jì)數(shù)室厚度越小，對(duì)加工精度要求越高，一次性的精子計(jì)數(shù)板均難以達(dá)到1微米的精度，據(jù)筆者經(jīng)驗(yàn)，有的標(biāo)稱(chēng)20微米的計(jì)數(shù)板實(shí)際可能只有16微米，誤差達(dá)到20%。

由以上分析可知，血球計(jì)數(shù)板法主要的誤差來(lái)自抽樣誤差，而精液質(zhì)量分析系統(tǒng)的誤差主要來(lái)自計(jì)數(shù)板加工精度和精子識(shí)別準(zhǔn)確率。