孫天穎，程紅，張明站，任健*

(1.齊齊哈爾大學(xué) 食品與生物工程學(xué)院，黑龍江 齊齊哈爾 161006；2.黑龍江省玉米主食工業(yè)化工程技術(shù)研究中心，黑龍江 齊齊哈爾 161006；3.黑龍江省玉米深加工理論與技術(shù)重點實驗室，黑龍江 齊齊哈爾 161006)

近年來，食品工業(yè)對蛋白水解物的關(guān)注日益增加，蛋白質(zhì)被分解成小分子量的低聚肽，可被腸道黏膜直接吸收，并且其吸收速度略快于氨基酸[1]。蛋白水解物除具有營養(yǎng)作用外，還可發(fā)揮蛋白質(zhì)整體結(jié)構(gòu)所不具有或不明顯的特殊功能，如抗氧化、免疫調(diào)節(jié)、美容護膚、血壓和血脂調(diào)節(jié)、護肝等[2]。此外，蛋白水解還能夠進一步改善蛋白的溶解性、起泡性等功能性質(zhì)，功能蛋白水解物可作為食品添加劑、食品質(zhì)地改良劑和藥物添加劑，被廣泛應(yīng)用于食品或制藥行業(yè)。

玉米蛋白主要存在于玉米淀粉濕法加工的副產(chǎn)物玉米蛋白粉、玉米胚芽和玉米漿中，每加工萬噸的玉米就會產(chǎn)生300～350噸的玉米漿、350噸的胚芽餅以及600噸的玉米蛋白粉，蛋白資源豐富，并且開發(fā)利用前景廣闊。因為玉米蛋白的水溶性較差，限制了其在食品工業(yè)中的應(yīng)用。但與其他谷物蛋白相比，由于玉米蛋白特殊的氨基酸組成和序列，是研究開發(fā)生物活性肽的良好原料[3]。目前研究和報道的有玉米蛋白水解物的抗氧化、解酒護肝、降血壓、增強免疫力等功能[4-8]，并有相關(guān)產(chǎn)品已實現(xiàn)產(chǎn)業(yè)化生產(chǎn)。本文主要采用超濾、凝膠層析對玉米胚芽脫脂粕水解物中具有抗氧化活性的肽進行初步分離，篩選抗氧化活性較強的組分，同時，檢測玉米胚芽脫脂粕水解物的體外抗氧化活性作用，為玉米胚芽脫脂粕的研究前景以及相關(guān)功能性產(chǎn)品的開發(fā)提供了理論依據(jù)。

1 材料和方法

1.1 實驗材料與試劑

玉米胚芽脫脂粕：蛋白含量24.15%，自制；Alcalase堿性蛋白酶：無錫杰能生物工程公司；Flavourzyme風(fēng)味蛋白酶：丹麥Novo Nordisk公司；牛血清白蛋白：GE公司；Sephadex G-15：Pharmacia公司；焦性沒食子酸、鄰二氮菲等其他試劑：均為分析純。

1.2 主要設(shè)備儀器

DL-360E型智能超聲波清洗器 上海之信儀器有限公司；HH.S21-1型電熱恒溫水浴鍋 上海躍進醫(yī)療器械有限公司；B324型凱氏定氮儀 日立公司；PB-10型pH計 上海精密科學(xué)儀器有限公司；DU800型紫外可見分光光度計 貝克曼公司。

1.3 實驗方法

1.3.1 玉米胚芽脫脂粕水解物的制備

玉米胚芽脫脂粕→過篩(過100目篩)→超聲波處理(超聲功率214 W，超聲時間30 min，超聲溫度55 ℃)→堿性蛋白酶水解(加酶量5%，W/W)，水解溫度45 ℃，pH值10.5，時間180 min)→調(diào)pH值→風(fēng)味蛋白酶水解(加酶量3%，W/W)，水解溫度50 ℃，pH值6.2，時間240 min)→離心取上清液→濃縮凍干。

1.3.2 玉米胚芽脫脂粕水解液的分離及抗氧化性質(zhì)研究

1.3.2.1 超濾

在10000 r/min條件下離心脫脂后的玉米胚芽酶解液20 min，采用10 kDa、6～10 kDa以及6 kDa截斷分子量的超濾膜逐級超濾上清液，每超濾一級，檢測其溶液抗氧化活性，直至檢測至最后一次超濾后的上清液活性。

1.3.2.2 凝膠層析

采用Sephadex G-15凝膠層析對樣品進行分子量分級，參考Amersham Pharmacia凝膠層析原理與手冊的方法(2002年)。選取規(guī)格為2.6 cm×80 cm的雙蒸水平衡柱作為層析柱，用雙蒸水溶解已被超濾的樣品，采取100000 r/min的條件離心上述溶液10 min，提取上清液。再將上述上清液加入凝膠柱中，用雙蒸水以0.5 mL/min的流速進行洗脫，同時以4 mL/管的收集器自動收集，檢測每管收集器里收集液的抗氧化活性(214 nm處測定吸光值)，選取活性最高的樣品組分進行凍干。

1.3.2.3 清除超氧陰離子自由基活性的測定

測定采用改進的鄰苯三酚自氧化法[9]。

1.3.2.4 清除羥自由基活性的測定

采用鄰二氮菲-Fe2+氧化法。

1.3.2.5 玉米胚芽粕水解物清除DPPH自由基的測定

配制成不同濃度的水解液，分別取1 mL與3 mL 0.2 mmol/L DPPH·溶液均勻混合，反應(yīng)30 min后在517 nm處測定其吸光度Ai，同法測定3 mL 0.2 mmol/L DPPH·溶液與1 mL蒸餾水混合后的吸光度Ac以及供試液本身的吸光度Aj，按下式計算清除率Y。

清除率Y=1-(Ai-Aj)/Ac。

式中：Y為DPPH·自由基清除率；Ac為不加供試液的吸光度；Ai為加入供試液后的吸光度；Aj為供試液本身的吸光度。

1.3.2.6 玉米胚芽粕水解物對油脂氧化的抑制作用

取一定量的大豆色拉油(0.5%，W/W)置于燒杯中，加入玉米胚芽粕水解物(已被逐級超濾和凝膠層析作用過的樣品)，每組做3次平行，然后放入(65±1)℃恒溫培養(yǎng)箱中反應(yīng)，每隔24 h攪拌一次樣品并測量樣品的過氧化值(POV值)。本實驗按照GB/T 5009.37-2003標準操作，采用油脂的氧化速度(POV值)表示油脂抗氧化能力。

1.3.2.7 玉米胚芽粕水解物還原力的測定

在試管中依次加入pH值為6.6的0.2 mol/L磷酸鹽緩沖溶液、1%六氰合鐵酸鉀和各種不同濃度梯度的玉米胚芽粕水解液，每種試劑加入試管的體積均為0.75 mL。將混合溶液于50 ℃水浴20 min，然后加入0.75 mL的10%三氯乙酸，以4 ℃、3000 r/min的條件下離心上述溶液10 min，提取出1.5 mL上清液，再分別加入1.5 mL的蒸餾水和0.1%的FeC13，快速搖勻，室溫靜置反應(yīng)10 min后，以蒸餾水調(diào)零，在吸光度為700 nm處測定上述樣品的吸光值。

2 結(jié)果與討論

2.1 超濾分離結(jié)果分析

超濾是介于微濾和納濾之間的一種膜過濾。為從玉米胚芽粕酶解液中得到不同分子量的多肽，本方法采用截斷分子量為10 kDa、6～10 kDa和6 kDa的超濾膜按照順序逐步分離玉米胚芽粕酶解液，結(jié)果見表1。

表1 樣品超濾的結(jié)果分析Table 1 The analysis result of hydrolysates by ultrafiltration

由表1可知，超濾分級后分子量小于6 kDa的組分抗氧化活性最高。外液(<6000 Da)的抗氧化活性高達481.76 U/mL，是內(nèi)液II(10000～6000 Da)的3倍以上，是內(nèi)液I(>10000 Da)的8倍以上，證明抗氧化活性肽多聚集在<6 kDa區(qū)段，并且小分子量的玉米胚芽粕多肽更易被吸收利用。

2.2 Sephadex G-15凝膠層析分離

對經(jīng)過超濾的抗氧化活性肽進一步進行凝膠層析分離，實驗結(jié)果見圖1。

圖1 Sephadex G-15管數(shù)凝膠層析的洗脫曲線Fig.1 The elution curve of Sephadex G-15 gel chromatography

經(jīng)Sephadex G-15凝膠層析后得到G1、G2、G3、G4 4個組分，測定其抗氧化活性依次為57.19，287.43，149.28，27.37 U/mL。由圖1可知，G2組分的抗氧化活性最高。

2.3 玉米胚芽粕水解物對超氧陰離子自由基的清除作用

將原玉米胚芽粕水解物溶液配制成濃度梯度為0.5，1，2，3，4，5 mg/mL的樣品，各濃度梯度的樣品對O2-·的清除效果見圖2。

圖2 玉米胚芽粕水解物對超氧陰離子自由基的清除作用Fig.2 The scavenging effect of corn germ meal hydrolysates on superoxide anion free radical

由圖2可知，玉米胚芽粕水解物對O2-·的清除作用具有顯著影響，且隨樣品濃度的增大而增強。濃度在0.5～4 mg/mL之間的樣品的O2-·清除作用由181.80 U/mL大幅度增加到526.92 U/mL，但當樣品濃度從4 mg/mL持續(xù)增大到5 mg/mL，樣品的O2-·的清除作用基本不發(fā)生變化，由此可得濃度為4 mg/mL的玉米胚芽粕水解物對O2-·的清除作用最強。

2.4 玉米胚芽粕水解物對羥自由基的清除作用

將原玉米胚芽粕水解物溶液配制成濃度梯度為0.5，1，2，3，4，5，6 mg/mL的溶液，各濃度梯度的樣品對·OH的清除作用見圖3。

圖3 玉米胚芽粕水解物對·OH的清除作用Fig.3 The scavenging effect of corn germ meal hydrolysate on · OH

由圖3可知，玉米胚芽粕水解物對·OH 的清除作用具有顯著影響，并且隨著水解物濃度的增大而增強。當濃度為0.5 mg/mL時，·OH的清除率僅為14.70%；當濃度為6 mg/mL時，·OH的清除率可達94.52%。玉米胚芽粕水解物和清除率之間的關(guān)系大致為：y=0.8475x2+8.9518x+11.725，R2=0.9905。

樣品濃度從0.5 mg/mL持續(xù)增長到6 mg/mL時，樣品對·OH的清除率從14.70%極速增長到94.52%，這期間的清除率均呈現(xiàn)逐漸上升的趨勢。樣品和清除率之間的關(guān)系大致為：y=0.8475x2+8.9518x+11.725，R2=0.9905，清除能力(EC50)為3.27 mg/mL。由此可得，濃度為6 mg/mL的玉米胚芽粕水解物對·OH的清除作用最強。

2.5 玉米胚芽粕水解物對DPPH·的清除作用

將原玉米胚芽粕水解物溶液配制成濃度梯度為0.5，1，2，3，4，5 mg/mL的樣品，各濃度梯度的樣品對DPPH·的抑制作用見圖4。

圖4 玉米胚芽粕水解物對DPPH·的清除作用Fig.4 The scavenging effect of corn germ meal hydrolysate on DPPH·

由圖4可知，玉米胚芽粕水解物對DPPH·具有抑制作用，濃度越大抑制作用越強。當樣品濃度從0.5 mg/mL升至5 mg/mL時，玉米胚芽粕水解物對DPPH·的抑制率呈現(xiàn)正比上升關(guān)系，從只有5.84%高速增長至近90%，尤其濃度大于2 mg/mL后，上升趨勢更加明顯。樣品與DPPH·抑制率的關(guān)系大致為：y=-1.6094x2+29.048x-9.7791，R2=0.9913，50%清除能力(EC50)為 2.37 mg/mL。

2.6 玉米胚芽粕水解物對油脂氧化的抑制作用

本實驗以加入的玉米胚芽粕水解物作為樣品對照組，以不加水解物做空白對照組，檢測樣品對油脂氧化的作用，結(jié)果見圖5。

圖5 玉米胚芽粕水解物對油脂氧化的抑制作用Fig.5 Inhibition of corn germ meal hydrolysates on oil oxidation

由圖5可知，隨著時間的增加，油脂的POV值均呈現(xiàn)上升的趨勢，而POV值越高，表明油脂被氧化的作用越強。雖然添加了玉米胚芽粕水解物的樣品組隨時間增加，POV值也不斷增加，但是與空白對照組的上升趨勢相比相對平緩一些。綜上所述，玉米胚芽粕水解物具有抗油脂氧化作用。

2.7 玉米胚芽粕水解物還原力大小

將原玉米胚芽粕水解物溶液配制成濃度梯度為0.1，0.2，0.4，0.6，0.8，1 mg/mL的樣品，并檢測不同濃度下的還原力大小，結(jié)果見圖6。

圖6 玉米胚芽粕水解物的還原作用 Fig.6 The reduction activity of corn germ meal hydrolysates

由圖6可知，當樣品濃度從0.1 mg/mL增長至0.6 mg/mL時，樣品的吸光度呈上升趨勢，表明濃度越大，玉米胚芽粕水解物的還原力越強；當濃度從0.6 mg/mL提高到1 mg/mL時，樣品吸光度逐漸趨于平緩，但并沒有下降的趨勢，表明玉米胚芽粕水解物具有很強的Fe3+還原力。

3 結(jié)論

本文旨在以脫脂玉米胚芽粕水解物為主要研究對象，經(jīng)超濾膜分級，分別篩選出分子量>10 kDa、10～6 kDa及<6 kDa的組分，并探討其抗氧化能力。結(jié)果表明，分子量<6 kDa的脫脂玉米胚芽粕水解物的抗氧能力最強。并且該組分經(jīng)凝膠層析分離進一步制備抗氧化活性肽，篩選得到4個活性組分G1、G2、G3、G4，其中G2組分的抗氧化活性最高。研究表明：玉米胚芽脫脂粕水解物具有較強的O2-·、·OH和DPPH·的清除能力以及抗油脂氧化能力和還原力。