陳嘉慧 - 吳雪輝 -

(華南農(nóng)業(yè)大學(xué)，廣東 廣州 510000)

金花茶(CamellianitidissimaChi)是山茶科山茶屬金花茶組植物，主要分布于中國廣西、廣東和越南北部，是茶花家族中唯一花瓣為金黃色的珍稀物種[1]，2010年被批準(zhǔn)為國家新資源食品[2]。

金花茶葉富含皂苷、黃酮、多酚、多糖、氨基酸等多種生物活性成分，具有提高免疫力、降血脂血糖、抗癌防癌等重要保健功能[3]。廣西壯族民間有飲用金花茶葉片習(xí)慣[4]，當(dāng)?shù)卦S多資料亦有記載“金花茶葉為壯族民間藥，具有清熱解毒，降低膽固醇、預(yù)防腫瘤等功效”[5-6]。目前，對(duì)金花茶葉中黃酮、多酚、多糖的提取及抗氧化作用研究較多[7-9]，但未見對(duì)皂苷的提取和抑制脂肪酶的效果研究報(bào)道。據(jù)前人[10]研究報(bào)道，植物皂苷能有效抑制脂肪酶的活性，可以升高血清中高密度脂蛋白含量，降低膽固醇、甘油三酯以及低密度脂蛋白含量，對(duì)高血脂癥、心腦血管疾病以及動(dòng)脈粥樣硬化的治療具有明顯效果。研究擬采用乙醇提取金花茶中的皂苷，探討其對(duì)胰脂肪酶的抑制作用，以期為金花茶葉資源的開發(fā)利用提供理論依據(jù)和參考數(shù)據(jù)。

1 材料與方法

1.1 材料與儀器

1.1.1 材料與試劑

金花茶葉：摘自廣東省佛山市林業(yè)科學(xué)研究所金花茶示范林，經(jīng)佛山市林業(yè)科學(xué)研究所薛克娜教授級(jí)高級(jí)工程師鑒定為山茶科山茶屬植物金花茶的葉，選取無病蟲害，無腐爛、枯萎的金花茶葉于50 ℃烘干48 h后粉碎備用；

月桂酸4-硝基苯酯：>98.0%，上海麥克林生化科技有限公司；

人參皂苷Rg1：>98.0%，北京索萊寶科技有限公司；

豬胰脂肪酶：CAS#9001-62-1，上海源葉生物科技有限公司；

醋酸鈉、磷酸二氫鈉、磷酸氫二鈉、香草醛：分析純，天津大茂化學(xué)試劑廠；

硫酸：分析純，廣州化學(xué)試劑廠；

乙醇、冰醋酸：分析純，天津市富宇精細(xì)化工有限公司。

1.1.2 主要儀器設(shè)備

多功能粉碎機(jī)：BJ-150型，德清拜杰電器有限公司；

分析天平：CPA225D型，德國賽多利斯集團(tuán)；

循環(huán)式真空泵：SHB-Ⅲ型，鄭州世紀(jì)雙科實(shí)驗(yàn)儀器有限公司；

旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀：RE-52AA型，上海榮亞生化儀器廠；

紫外可見分光光度計(jì)：UV-5200型，上海元析儀器有限公司；

電熱鼓風(fēng)干燥箱：101-2A型，天津市泰斯特儀器有限公司。

1.2 方法

1.2.1 金花茶葉皂苷的提取單因素試驗(yàn)設(shè)計(jì) 稱取一定量的金花茶葉粉末，加入適量的乙醇溶液，在適宜的溫度下提取一定的時(shí)間，經(jīng)過濾或離心分離，收集提取液，測定其皂苷含量。

(1) 乙醇體積分?jǐn)?shù)：適宜的金花茶葉粉末，分別用體積分?jǐn)?shù)0%，20%，40%，60%，80%，100%的乙醇溶液，按照料液比1∶50 (g/mL)，于70 ℃提取100 min。

(2) 料液比：在提取溫度70 ℃下，用體積分?jǐn)?shù)60%的乙醇溶液分別按照料液比1∶20，1∶30，1∶40，1∶50，1∶60 (g/mL)提取100 min。

(3) 提取溫度：金花茶葉粉末用體積分?jǐn)?shù)60%的乙醇溶液，在料液比1∶40 (g/mL)下，分別于50，60，70，80，90 ℃提取100 min。

(4) 提取時(shí)間：一定量的金花茶葉粉末按照料液比1∶40 (g/mL)加入體積分?jǐn)?shù)60%的乙醇溶液，在70 ℃下分別提取60，80，100，120，140 min。

1.2.2 響應(yīng)面設(shè)計(jì) 在單因素試驗(yàn)的基礎(chǔ)上，選取乙醇體積分?jǐn)?shù)、料液比、提取溫度以及提取時(shí)間，以皂苷得率為評(píng)價(jià)指標(biāo)進(jìn)行四因素三水平中心組合試驗(yàn)。

1.2.3 皂苷得率的測定 采用香草醛—硫酸分光光度法[11]，以人參皂苷Rg1為標(biāo)樣進(jìn)行測定。準(zhǔn)確稱取0.005 4 g 人參皂苷Rg1標(biāo)準(zhǔn)品，溶解于純凈水中，配制成質(zhì)量分?jǐn)?shù)為0.216 mg/mL的標(biāo)準(zhǔn)溶液，精確移取0.0，0.1，0.2，0.4，0.5，0.7 mL標(biāo)準(zhǔn)溶液于比色管中，蒸干后加入8%香草醛—冰醋酸溶液0.5 mL、72%硫酸溶液5 mL，充分搖勻后于60 ℃恒溫水浴10 min，隨后立即用冰水冷卻10 min，搖勻，于540 nm處測吸光度。以人參皂苷Rg1吸光度為縱坐標(biāo)(Y)，標(biāo)準(zhǔn)品質(zhì)量為橫坐標(biāo)(X，mg)繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線如圖1，用最小二乘法作線性回歸，得到的方程為：Y=6.7X+0.006 2，相關(guān)系數(shù)R2=0.999。提取的金花茶葉皂苷溶液按照標(biāo)準(zhǔn)曲線的制作方法，測定吸光度，由回歸方程計(jì)算出皂苷含量，并按式(1)計(jì)算金花茶葉皂苷得率。

(1)

式中：

R——皂苷得率，%；

m——提取液中皂苷含量，mg；

M——樣品質(zhì)量，g。

1.2.4 胰脂肪酶活性抑制率的測定 參照趙瑜等[12-14]的方法。取3 mL磷酸鹽緩沖溶液和0.08%月桂酸4-硝基苯酯溶液、1.0 mg/mL胰脂肪酶溶液、金花茶葉皂苷溶液各0.5 mL混合均勻，在適宜溫度下恒溫水浴一定時(shí)間后于410 nm處測吸光度為A。同時(shí)以不加皂苷溶液在410 nm處的吸光值為A1，加皂苷溶液，不加胰脂肪酶溶液在410 nm處的吸光值為A0。按式(2)計(jì)算胰脂肪酶抑制率。

(2)

式中：

C——抑制率，%；

A——樣品組吸光度值；

A1——空白組吸光度值；

A0——對(duì)照組吸光度值。

1.2.5 緩沖液pH對(duì)金花茶葉皂苷抑制胰脂肪酶能力的影響 按1.2.4的方法，分別取pH 6.0，6.5，7.0，7.5，8.0磷酸鹽緩沖溶液與1 mg/mL胰脂肪酶溶液、0.08%月桂酸4-硝基苯酯溶液和2 mg/mL金花茶葉皂苷溶液混合均勻，于37 ℃水浴30 min，測定胰脂肪酶的抑制率。

1.2.6 反應(yīng)溫度對(duì)金花茶葉皂苷抑制胰脂肪酶能力的影響 按1.2.4的方法，取pH 7.5的磷酸鹽緩沖溶液與1 mg/mL 胰脂肪酶溶液、0.08%月桂酸4-硝基苯酯溶液和2 mg/mL金花茶葉皂苷溶液混合，分別于27，32，37，42，47 ℃水浴30 min，測定胰脂肪酶的抑制率。

1.2.7 反應(yīng)時(shí)間對(duì)金花茶葉皂苷抑制胰脂肪酶能力的影響 按1.2.4的方法，取pH 7.5的磷酸鹽緩沖溶液與1 mg/mL 胰脂肪酶溶液、0.08%月桂酸4-硝基苯酯溶液和4 mg/mL金花茶葉皂苷溶液混合，分別于37 ℃水浴20，30，40，50，60 min，測定胰脂肪酶的抑制率。

1.2.8 金花茶葉皂苷濃度對(duì)胰脂肪酶抑制率的影響 按1.2.4的方法，分別取1，2，3，4，5，6 mg/mL金花茶葉皂苷溶液與pH 7.5的磷酸鹽緩沖溶液、1 mg/mL胰脂肪酶溶液、0.08%月桂酸4-硝基苯酯溶液混合，于37 ℃水浴30 min，測定胰脂肪酶的抑制率。

2 結(jié)果與討論

2.1 單因素試驗(yàn)

2.1.1 乙醇體積分?jǐn)?shù)對(duì)金花茶葉皂苷得率的影響 由圖2 可以看出，隨著乙醇體積分?jǐn)?shù)的變大，皂苷得率呈先上升后下降趨勢，當(dāng)體積分?jǐn)?shù)為60%時(shí)，皂苷得率最大。這是因?yàn)橐掖紳舛冗^小時(shí)，體系中的溶劑極性較小利于親水性的蛋白質(zhì)、多糖等物質(zhì)溶出，直到溶劑極性與皂苷極性相似時(shí)達(dá)到最大得率，而乙醇濃度過大時(shí)，乙醇會(huì)使蛋白質(zhì)變性凝固，阻止溶劑進(jìn)入金花茶葉細(xì)胞內(nèi)，影響皂苷的溶出[15]27-28。因此選擇60%為最佳乙醇體積分?jǐn)?shù)。

圖2 乙醇體積分?jǐn)?shù)對(duì)金花茶葉皂苷得率的影響

2.1.2 料液比對(duì)金花茶葉皂苷得率的影響 如圖3所示，隨著料液比的增加得率呈先上升后下降趨勢，當(dāng)料液比在1∶40 (g/mL)時(shí)得率達(dá)到最大值。金花茶葉皂苷的提取屬于固液提取，濃度差是提取動(dòng)力，因?yàn)殡S著原料與乙醇溶液的接觸面積增大，金花茶葉粉末與溶劑充分接觸，物料與溶劑間濃度差增大，皂苷的傳質(zhì)速率加快，促進(jìn)皂苷的溶出，但料液比大于1∶40 (g/mL)時(shí)，溶劑的量太大，不利于溶劑與溶質(zhì)之間充分循環(huán)交換[15]26-27?？紤]原料的充分利用、生產(chǎn)成本和能耗，料液比選1∶40 (g/mL)為適宜。

圖3 料液比對(duì)金花茶葉皂苷得率的影響

2.1.3 提取溫度對(duì)金花茶葉皂苷得率的影響 由圖4可知，隨著溫度的升高，得率先上升后下降，提取溫度在70 ℃時(shí)，金花茶葉皂苷得率達(dá)到最大值，因?yàn)殡S著溫度升高，分子擴(kuò)散運(yùn)動(dòng)加快，有助于皂苷的溶出。但是溫度超過70 ℃時(shí)，溫度過高，蒸氣壓上升[15]25-26，乙醇蒸發(fā)加快而冷凝不充分，導(dǎo)致提取瓶中乙醇濃度減少；甚至皂苷結(jié)構(gòu)上含有—COOH和—OH，其在溶液中呈自然弱酸性，在溫度較高和含有醇溶液條件下會(huì)發(fā)生催化水解反應(yīng)，水解后生成的皂苷元極性低，只可以溶于低極性溶劑，從而導(dǎo)致皂苷得率降低，這一結(jié)果與張正茂等[16]報(bào)道相似。因此70 ℃為最佳提取溫度。

圖4 取溫度對(duì)金花茶葉皂苷得率的影響

2.1.4 提取時(shí)間對(duì)金花茶葉皂苷得率的影響 由圖5可以看出，隨著時(shí)間的延長皂苷得率先增加再下降，超過120 min后皂苷得率下降。因?yàn)殡S著時(shí)間的延長，皂苷的溶出率增加，但到達(dá)一定程度后，隨著提取時(shí)間的延長，雜質(zhì)溶出，導(dǎo)致擴(kuò)散系數(shù)降低，增大傳質(zhì)阻力，阻止皂苷的溶出[17-18]，影響金花茶葉皂苷得率，所以選取提取時(shí)間為120 min為適宜。

圖5 提取時(shí)間對(duì)金花茶葉皂苷得率的影響

2.2 響應(yīng)面優(yōu)化與分析

2.2.1 響應(yīng)面優(yōu)化 以乙醇體積分?jǐn)?shù)、料液比、提取溫度和提取時(shí)間為影響因素(見表1)，根據(jù)Box-Behnken原理設(shè)計(jì)四因素三水平中心組合試驗(yàn)，試驗(yàn)結(jié)果見表2。

表2 響應(yīng)面試驗(yàn)設(shè)計(jì)結(jié)果

表1 響應(yīng)面試驗(yàn)因素與水平表

采用Design-Expert 8.0.6軟件對(duì)響應(yīng)面試驗(yàn)結(jié)果進(jìn)行回歸擬合分析，從模型中刪除不顯著變量，優(yōu)化得到響應(yīng)面方程為：

Y=4.61+0.17B-0.25C+0.27BC-1.03A2-0.31B2-0.18D2。

(3)

由表3可知，回歸模型顯著(P<0.000 1)，失擬項(xiàng)不顯著(P>0.05)，R2=0.928 6，CV=5.6%，說明置信度較好，表明該回歸模型值與試驗(yàn)值擬合較好，誤差較小，能較好地反映影響因素與皂苷得率之間的關(guān)系，可解釋92.86%的響應(yīng)值，因此可以用該模型對(duì)金花茶葉皂苷的得率進(jìn)行分析和預(yù)測。各因素對(duì)皂苷得率的影響大小為提取溫度>料液比>乙醇體積分?jǐn)?shù)>提取時(shí)間。一次項(xiàng)C及二次項(xiàng)A2、B2對(duì)皂苷得率影響極顯著(P<0.01)，一次項(xiàng)B、交互項(xiàng)BC與二次項(xiàng)D2對(duì)皂苷得率影響顯著(P<0.05)。

表3 回歸模型方差分析和系數(shù)顯著性檢驗(yàn)?

2.2.2 響應(yīng)面分析 各個(gè)因變量之間的交互作用對(duì)響應(yīng)值——皂苷得率的響應(yīng)面三維圖見圖6，其中料液比和提取溫度的交互作用響應(yīng)面曲面坡度陡峭，說明對(duì)金花茶葉皂苷得率影響顯著。利用已建立的數(shù)學(xué)模型優(yōu)化出最優(yōu)條件為乙醇體積分?jǐn)?shù)58.71%、料液比1∶38.69 (g/mL)、提取溫度60 ℃、提取時(shí)間123.94 min，考慮實(shí)際操作，修正工藝條件為乙醇體積分?jǐn)?shù)59%、料液比1∶39 (g/mL)、提取溫度60 ℃、提取時(shí)間124 min，此條件下的金花茶葉皂苷含量為4.82%，與理論預(yù)測值4.838%相差較小，說明該模型可行，優(yōu)化結(jié)果可靠。

圖6 各因素對(duì)皂苷得率的交互作用

2.3 金花茶葉皂苷體外抑制胰脂肪酶能力

2.3.1 緩沖液pH對(duì)金花茶葉皂苷抑制胰脂肪酶能力的影響 從圖7可以直觀看出，隨著pH的增大，金花茶葉皂苷對(duì)胰脂肪酶抑制率先增加后趨于平緩；在緩沖液pH為7.5時(shí)對(duì)胰脂肪酶抑制率有最佳效果，為52.44%。因?yàn)閜H可以改變胰脂肪酶分子結(jié)構(gòu)，在最適pH條件下，胰脂肪酶分子活性基團(tuán)部位與最適底物結(jié)合，發(fā)揮出胰脂肪酶的最佳催化效果，pH偏高或偏低環(huán)境下，會(huì)改變胰脂肪酶分子的二級(jí)、三級(jí)構(gòu)象，影響酶與底物結(jié)合效率，從而影響胰脂肪酶的活性，改變胰脂肪酶的抑制率[19]，所以選取pH 7.5為胰脂肪酶的最適pH。

圖7 緩沖液pH對(duì)胰脂肪酶抑制率的影響

2.3.2 反應(yīng)溫度對(duì)金花茶葉皂苷抑制胰脂肪酶能力的影響 由圖8可知，抑制率隨著溫度的升高先上升后下降，當(dāng)溫度為37 ℃時(shí)對(duì)胰脂肪酶有最佳抑制作用，抑制率為51.28%。動(dòng)物來源的酶的最適溫度一般為35～40 ℃，溫度若高于最適溫度，會(huì)破壞酶分子的構(gòu)象[20]，此時(shí)酶的整體三維結(jié)構(gòu)受到破壞，次級(jí)鍵崩解，酶失去活性，從而降低胰脂肪酶的抑制率。因此選取溫度37 ℃為胰脂肪酶最佳反應(yīng)溫度。

圖8 反應(yīng)溫度對(duì)胰脂肪酶抑制率的影響

2.3.3 反應(yīng)時(shí)間對(duì)金花茶皂苷抑制胰脂肪酶能力的影響

從圖9可以看出，反應(yīng)時(shí)間為20～40 min時(shí)，胰脂肪酶的抑制率隨著時(shí)間的遞增先上升后趨于平緩；40 min 后，胰脂肪酶的抑制率隨著時(shí)間的遞增呈下降趨勢。當(dāng)皂苷與胰脂肪酶剛混合時(shí)，由于兩者結(jié)合不充分，抑制率較低，隨著時(shí)間的增加，二者結(jié)合逐漸充分，有效接觸增多，抑制率上升，反應(yīng)時(shí)間>30 min時(shí)，金花茶葉皂苷與胰脂肪酶之間有效基團(tuán)已充分接觸反應(yīng)，相互作用趨于飽和，導(dǎo)致兩者的濃度減小，二者結(jié)合速率降低，反應(yīng)時(shí)間進(jìn)一步延長，胰脂肪酶的抑制率呈下降趨勢[21]，所以30 min為胰脂肪酶的最佳反應(yīng)時(shí)間。

圖9 反應(yīng)時(shí)間對(duì)胰脂肪酶抑制率的影響

2.3.4 金花茶葉皂苷濃度對(duì)胰脂肪酶抑制率的影響 由圖10可知，金花茶葉皂苷濃度為1～6 mg/mL時(shí)，胰脂肪酶的抑制率隨著金花茶葉皂苷濃度的增加呈兩個(gè)階段上升趨勢；1～4 mg/mL時(shí)，胰脂肪酶結(jié)合位點(diǎn)未飽和，胰脂肪酶的抑制率急劇升高；4～6 mg/mL時(shí)，胰脂肪酶和金花茶葉皂苷兩者充分相互接觸，結(jié)合位點(diǎn)達(dá)到飽和，故抑制率增加緩慢。皂苷濃度為6 mg/mL時(shí)，對(duì)胰脂肪酶的抑制率達(dá)到最大值為84.76%。

圖10 皂苷濃度對(duì)胰脂肪酶抑制率的影響

3 結(jié)論

通過單因素試驗(yàn)，選擇適合的因素水平進(jìn)行響應(yīng)面優(yōu)化，研究了金花茶葉提取皂苷的最佳工藝條件，并對(duì)金花茶葉提取的皂苷進(jìn)行抑制脂肪酶活性研究。試驗(yàn)結(jié)果表明，金花茶葉皂苷最佳提取條件為乙醇體積分?jǐn)?shù)59%、料液比1∶39 (g/mL)、提取溫度60 ℃、提取時(shí)間124 min，此條件下的金花茶葉皂苷得率為4.82%；金花茶葉提取的皂苷對(duì)胰脂肪酶的抑制試驗(yàn)表明，皂苷提取物在37 ℃、質(zhì)量濃度在6 mg/mL、pH 7.5、反應(yīng)30 min下，脂肪酶抑制率達(dá)到84.76%；并且金花茶葉皂苷濃度與胰脂肪酶的抑制作用呈劑量效應(yīng)，濃度越高，抑制效果越佳，說明金花茶葉皂苷是一種良好的胰脂肪酶抑制劑，具有較好的降血脂應(yīng)用前景。后續(xù)可以利用現(xiàn)代分析方法深入研究金花茶葉皂苷對(duì)胰脂肪酶的抑制機(jī)理。