李麗梅，馮云霄，何近剛，錢 訓，張少軍，關軍鋒,*

（1.河北省農林科學院農產品質量安全研究中心，河北 石家莊 050051；2.河北省農林科學院遺傳生理研究所，河北 石家莊 050051）

梨酒以梨為原料，經酵母發(fā)酵而成。酵母是釀造果酒的關鍵因素之一，其發(fā)酵特性直接影響著果酒的品質[1-3]。當前我國果酒生產所用酵母大多為葡萄酒發(fā)酵專用酵母，主要針對葡萄酒釀造所選育[4-6]。梨酒發(fā)酵酵母的篩選[7-8]尚處于實驗室研究階段，沒有實現(xiàn)工業(yè)化生產。關于葡萄酒釀酒酵母對梨酒品質和抗氧化性能的影響目前報道較少，李麗梅等[9-11]研究確定了不同酵母發(fā)酵的不同品種梨、不同部位梨釀制梨酒中具有抗氧化功效的酚類物質，但未涉及其他成分測定；趙國群等[12]采用主成分分析法確定了影響梨酒品質的主要理化指標，但未涉及梨酒抗氧化性能評價。本實驗研究了不同酵母對發(fā)酵梨酒中還原糖、總酸、多酚、總黃酮含量以及DPPH自由基清除能力、羥自由基清除能力和鐵還原力的影響，并通過對相關指標進行因子分析，建立了梨酒綜合品質評價體系，并采用逐步回歸分析建立了評價梨酒綜合品質的理論模型，期望通過此模型，簡化梨酒的評價指標，同時為篩選適宜的釀酒酵母提供指導。

1 材料與方法

1.1 材料、菌株與試劑

新鮮‘雪花’梨于成熟期采摘于河北省趙縣范莊‘雪花’梨種植基地。

釀酒酵母LA-BA、F33、2323、LA-PE、LA-RA、X16、LA-MA、EC1118、KD、F15、BO213、LA-DE、R-HST、LA-EC、RC212 法國LAFFORT公司。

酒石酸鉀鈉 天津博迪化工股份有限公司；碳酸鈉、沒食子酸、無水葡萄糖 生工生物工程（上海）股份有限公司；硫酸銅、鐵氰化鉀、硫酸亞鐵 天津市永大化學試劑有限公司；氫氧化鈉 天津市大陸化學試劑廠；亞鐵氰化鉀 天津市北辰驊躍化學試劑有限公司；乙醇（色譜純）、4-甲基-2-戊醇（色譜純）天津市康科德科技有限公司；Folin-Ciocalteu試劑北京酷來搏科技有限公司；硝酸鋁 山東西亞化學工業(yè)有限公司；蘆丁、水楊酸 上海BBI生命科學有限公司；1,1-二苯基-2-三硝基苯肼（1,1-diphenyl-2-picrylhydrazyl，DPPH） 上海源葉生物科技有限公司；過氧化氫、三氯乙酸、亞硝酸鈉、亞甲基藍天津市大茂化學試劑廠；三氯化鐵 北京索萊寶科技有限公司。

1.2 儀器與設備

GC-2010氣相色譜儀、UV-2600紫外-可見分光光度計日本島津公司；ST 3100 pH計 美國奧豪斯公司。

1.3 方法

1.3.1 梨的前處理

‘雪花’梨采收后立即切分，去除果心后榨取果汁。加入蔗糖調整果汁糖度至22 °Brix，然后接種不同的市售商品化酵母，進行乙醇發(fā)酵，待糖度不再下降時結束發(fā)酵，經倒罐、靜置、自然澄清，得到不同的‘雪花’梨發(fā)酵酒。對成品酒進行各指標測定。

1.3.2 還原糖、總酸質量濃度、pH值的測定與糖酸比的計算

參照GB/T 15038—2006《葡萄酒、果酒通用分析方法》[13]，分別采用直接滴定法和電位滴定法測定梨酒的還原糖、總酸質量濃度。以還原糖含量/總酸含量計算得出糖酸比。采用ST 3100 pH計測定梨酒pH值。

1.3.3 總酚質量濃度的測定

參照鞠志國[14]的改進Folin-Ciocalteu法測定梨酒總酚質量濃度，以沒食子酸為標準物質，建立標準曲線，于765 nm波長處測定OD值，計算總酚質量濃度。

1.3.4 總黃酮質量濃度的測定

參照趙玉平等[15]的方法測定梨酒總黃酮質量濃度，以蘆丁為標準物質，建立標準曲線，于510 nm波長處測定OD值，計算總黃酮的質量濃度。

1.3.5 DPPH自由基清除率的測定

參考Takako等[16]的方法測定梨酒DPPH自由基清除率，按下式計算。

式中：A0為DPPH-甲醇溶液的吸光度；Ai為樣品溶液的吸光度。

1.3.6 羥自由基清除能力的測定

參照馬曉華等[17]的方法測定并計算梨酒羥自由基清除率。以不同濃度VC為對照，計算羥自由基清除率，得出標準曲線。利用羥自由基清除率，根據(jù)標準曲線得出每毫升梨酒相當VC的質量，以表征羥自由基清除能力（單位mg/mL）。

1.3.7 還原力的測定

采用鐵氰化鉀法[18]測定梨酒還原力。

1.3.8 乙醇體積分數(shù)的測定

參照GB 5009.225—2016《食品安全國家標準 酒中乙醇濃度的測定》[19]，采用氣相色譜法測定梨酒中乙醇體積分數(shù)。

1.4 數(shù)據(jù)處理與分析

采用SPSS統(tǒng)計分析軟件對數(shù)據(jù)進行Duncan法樣本間差異顯著性分析、Pearson相關性分析，同時進行因子分析、逐步回歸分析。

2 結果與分析

2.1 不同酵母釀制梨酒的品質

表 1 不同酵母釀制梨酒的還原糖、總酸、糖酸比和pH值比較Table 1 Comparison of reducing sugar, total acid, sugar/acid ratio and pH among pear wines fermented with different yeasts

如表1所示，不同梨酒的還原糖質量濃度差異較大，變異系數(shù)為33.9%。其中LA-BA梨酒的還原糖質量濃度最高，為2.95 g/L，LA-RA梨酒最低，為0.97 g/L。供試梨酒的還原糖質量濃度均低于4 g/L，說明本研究所選用酵母對梨的適應性較好，能夠比較完全地將糖分轉化為乙醇。不同梨酒的總酸質量濃度變異系數(shù)為26.1%，其中LA-BA梨酒的總酸含量最高，為7.43 g/L，LA-MA梨酒最低，為2.81 g/L。不同梨酒糖酸比的變異系數(shù)為18.9%，糖酸比最高的梨酒由F33酵母釀制，最低的由BO213酵母釀制。LA-BA梨酒相對于其他梨酒含有更多的糖和酸，但兩者比較平衡，糖酸比適中。除LA-BA梨酒的pH值最低（3.82）外，其余梨酒的pH值均大于4，其中RC212梨酒的pH值最高，為4.35。不同梨酒pH值差異很小，變異系數(shù)僅為3.1%。說明酵母雖然對梨酒的pH值有一定影響，但產生的差異較小。

2.2 不同酵母對梨酒乙醇含量的影響

如表2 所示， 不同梨酒的乙醇體積分數(shù)在12.36%～13.26%，變異系數(shù)僅為2.0%，KD梨酒的乙醇體積分數(shù)最高，為13.26%，LA-BA梨酒的乙醇體積分數(shù)最低，為12.36%，兩者的乙醇體積分數(shù)相差0.9%。本研究中梨酒的乙醇體積分數(shù)和市售葡萄酒相當，說明所選用酵母盡管是葡萄酒的釀酒酵母，但對梨的適應性好，發(fā)酵產酒能力均較強，適于釀制梨酒。

表 2 不同酵母釀制梨酒的乙醇含量Table 2 Alcohol contents in pear wines fermented with different yeasts

2.3 不同酵母釀制梨酒的抗氧化特性

表 3 不同酵母釀制梨酒的抗氧化能力比較Table 3 Comparison of antioxidant capacity among pear wines fermented with different yeasts

如表3所示，不同酵母釀制梨酒的多酚和總黃酮質量濃度不同，變異系數(shù)分別為10.3%和32.4%。其中LA-BA梨酒的多酚和總黃酮質量濃度均最高，分別為211 μg/mL和208 μg/mL，LA-EC梨酒的多酚質量濃度最低，為155 μg/mL；RC212梨酒的黃酮質量濃度最低，為67 μg/mL。不同梨酒的羥自由基清除能力差異較大，變異系數(shù)為47.5 %。F33梨酒的羥自由基清除能力最強，為0.899 mg/mL，LA-MA梨酒的羥自由基清除能力最弱，為0.196 mg/mL。不同梨酒的DPPH自由基清除率和鐵還原力的變異系數(shù)分別為23.0%和17.4%，其中LA-BA梨酒表現(xiàn)突出，DPPH自由基清除率和鐵還原力均最強，而RC212梨酒則表現(xiàn)最差，兩者均最弱。說明LA-BA梨酒在抗氧化性能方面表現(xiàn)突出，而RC212梨酒則較差。

2.4 相關性分析結果

為了研究各變量間的關系，對梨酒的多酚質量濃度、總黃酮質量濃度、羥自由基清除能力、pH值、鐵還原力、還原糖質量濃度、總酸質量濃度、糖酸比和DPPH自由基清除率這9 個變量進行相關性分析。

表 4 不同變量的相關性分析Table 4 Correlation analysis among different variables

如表4 所示，多酚質量濃度與黃酮質量濃度、鐵還原力、D P P H 自由基清除率呈極顯著正相關（P＜0.01）；黃酮質量濃度與鐵還原力、還原糖質量濃度、總酸質量濃度、DPPH自由基清除率呈極顯著正相關（P＜0.01），與羥自由基清除能力、pH值呈顯著負相關（P＜0.05）；鐵還原力與還原糖質量濃度、總酸質量濃度、DPPH自由基清除率呈極顯著正相關（P＜0.01）；還原糖質量濃度與總酸質量濃度呈極顯著正相關（P＜0.01），與糖酸比、DPPH自由基清除率呈顯著正相關（P＜0.05）；總酸質量濃度與DPPH自由基清除率呈極顯著正相關（P＜0.01）；pH值與總酸質量濃度呈極顯著負相關（P＜0.01），與鐵還原力、還原糖質量濃度、DPPH自由基清除率呈顯著負相關（P＜0.05）。

2.5 對不同酵母釀制梨酒的因子分析結果

由于不同梨酒的乙醇體積分數(shù)變異系數(shù)小，提取系數(shù)較小，因此在做因子分析時剔除了乙醇體積分數(shù)這個變量。經因子分析，提取各個因子的公因子方差，可知提取系數(shù)均大于0.7，其中對多酚的提取系數(shù)最低，為0.749，對糖酸比的提取系數(shù)最高，為0.975（表5）。

表 5 公因子方差Table 5 Common factor variance

通過因子分析，共提取了3 個特征值大于1.0的公因子，累積方差貢獻率達到89.939%（表6），說明這3 個公因子能夠很好地解釋所有變量。

通過正交旋轉法得到旋轉成分矩陣（表6）。各因子選取載荷值絕對值大于0.700的指標作為解釋變量。F1的方差貢獻率為38.970%，解釋變量包括pH值、還原糖質量濃度、總酸質量濃度，反映了梨酒的營養(yǎng)成分，命名為營養(yǎng)因子；F2的方差貢獻率為33.975%，解釋變量包括多酚質量濃度、黃酮質量濃度、羥自由基清除能力、DPPH自由基清除率，反映了梨酒的抗氧化能力，命名為功能因子；F3的方差貢獻率為16.993%，解釋變量為糖酸比，反映了梨酒的風味，命名為風味因子。公因子方差貢獻率是其權重，體現(xiàn)了各因子在評價中的作用大小，可見營養(yǎng)因子和功能因子的作用接近，風味因子的作用較小。

表 6 3 個公因子的初始特征值、方差貢獻率、累計方差貢獻率、及各變量在不同因子中的載荷值Table 6 Initial eigenvalues, variance contribution rates, accumulative variance contribution rates and loading matrix of three common factors

2.6 不同梨酒的綜合因子得分及其品質評價結果

以多酚質量濃度、總黃酮質量濃度、還原糖質量濃度、總酸質量濃度、糖酸比、DPPH自由基清除率、鐵還原力、羥自由基清除能力、pH值為變量，通過SPSS分析軟件的因子分析法可直接得出各因子的得分值FAC1、FAC2和FAC3，依據(jù)各個因子得分值與綜合因子得分的回歸模型公式，采用公式F＝38.970%×FAC1+33.975%×FAC2+16.993%×FAC3計算不同梨酒的綜合因子得分（F）。如表7所示，根據(jù)綜合因子得分，各酵母釀造梨酒排序依次為：LA-BA＞F33＞2323＞LA-PE＞LA-RA＞X16＞LA-MA＞EC1118＞KD＞F15、BO213＞LA-DE＞R-HST＞LA-EC＞RC212?？芍狶A-BA所釀梨酒的綜合品質最好，RC212梨酒較差，其他梨酒的綜合品質則介于兩者之間。

對梨酒的綜合因子得分和各變量之間做相關性分析表明，梨酒的綜合因子得分與多酚質量濃度、總黃酮質量濃度、鐵還原力、還原糖質量濃度、總酸質量濃度和DPPH自由基清除率均呈極顯著正相關（P＜0.01），與pH值呈極顯著負相關（P＜0.01）（表8），說明營養(yǎng)成分含量越高，抗氧化能力越強，pH值越低，梨酒的綜合得分越高。

表 7 不同酵母釀制梨酒的綜合因子得分Table 7 Comprehensive scores of pear wine fermented with different yeasts

表 8 綜合因子得分與各變量的相關性Table 8 Correlation analysis between comprehensive scores and variables

2.7 梨酒綜合品質評價預測模型的建立

表 9 逐步回歸法的結果Table 9 Results of stepwise regression method

以因子分析得到的不同梨酒綜合因子得分為因變量，剔除獨立性較差的變量糖酸比和pH值，以多酚質量濃度、總黃酮質量濃度、還原糖質量濃度、總酸質量濃度、羥自由基清除能力、DPPH自由基清除率和鐵還原力為自變量，進行逐步回歸分析，建立梨酒綜合品質評價理論模型（表9），得到的回歸模型為：F’＝-3.123+0.486×+0.980×+0.006×+0.034×，其中和F’4分別代表還原糖質量濃度、鐵還原力能力、多酚質量濃度和DPPH自由基清除率。模型的調整R2為0.996，接近1，說明估計的模型對觀測值的擬合程度很高。方差分析結果表明F對應的P＜0.05，因此認為回歸方程有效。將不同梨酒的對應變量值代入模型，得到每種梨酒綜合品質的理論評分（表10），并將該評分與利用因子分析得到的綜合因子得分進行相關性分析，r＝0.946（P＜0.01），說明該模型與實際評估結果相一致，具有很高的可靠性?；诖四Ｐ停磥砜梢詫婢频倪€原糖質量濃度、鐵還原力、多酚質量濃度和DPPH自由基清除率4 個指標進行測定，然后計算得分，對梨酒品質進行綜合評價?；诖嗽u價，可以對釀酒酵母的篩選提供指導。

表 10 通過回歸方程計算得出的梨酒理論評分Table 10 Theoretical scores for pear wine calculated from the regression equation

3 討 論

已有許多報道表明多酚和總黃酮具有抗氧化性能[9-11,20-24]。在本研究中通過對各變量做偏相關分析得知，多酚質量濃度和總黃酮質量濃度均與鐵還原力、DPPH自由基清除能力呈極顯著正相關（P＜0.01），說明兩者對梨酒的抗氧化能力貢獻較大。

還原糖、總酸質量濃度均分別與D P P H 自由基清除率呈顯著正相關（P＜0.05）和極顯著正相關（P＜0.01），說明糖酸等營養(yǎng)物質參與了抗氧化的過程。阿依姑麗·艾合麥提等[25]報道野山杏的有機酸具有清除自由基的能力。程勇杰等[26]報道樹莓酵素和藍莓酵素均以酒石酸、乙酸和檸檬酸為主，并具有DPPH自由基清除率、羥自由基清除能力。葡萄酒的抗氧化活性不僅與酚類物質有關，還與酒石酸、糖含量等指標存在顯著或極顯著相關性[27]，這與本研究結果一致。梨酒的主要有機酸為蘋果酸、檸檬酸和酒石酸[12]，蘋果酸能夠捕獲自由基，具有抗氧化活性[28]。而檸檬酸和酒石酸則均對板藍根提取物的抗氧化效果有協(xié)同增效作用[29]。梨酒中的有機酸究竟是直接參與抗氧化過程，還是和其他物質協(xié)同發(fā)揮作用有待于進一步研究。

因子分析是多元變量統(tǒng)計分析中最常用的方法之一，毛園園[30]利用SPSS軟件中的主成分分析法對釀酒葡萄理化指標進行篩選，提取了8 個葡萄酒主要因子作為最終的主要理化指標，達到簡化數(shù)據(jù)降低運算量的目的。曹忠威等[31]采用多元線性回歸模型構造了釀酒葡萄和葡萄酒理化指標之間的關系，確定了白葡萄酒新的評價指標。趙國群等[12]采用主成分分析對梨酒品質進行評價，認為梨酒中的總酸、總酚、酒石酸、可溶性固形物、還原糖、干浸出物和單寧含量是評價梨酒品質的主要指標，與本研究結果有部分相似之處，但其沒有涉及梨酒的抗氧化功能研究。本研究通過因子分析法，把代表梨酒品質和抗氧化功能的9 個變量簡化得到了3 個公因子：營養(yǎng)因子、功能因子和風味因子，分別代表了梨酒的營養(yǎng)性、功能性和風味，也符合人們對果酒的評價和消費習慣。

梨酒的綜合因子得分與多酚質量濃度、黃酮質量濃度、還原糖質量濃度、總酸質量濃度、鐵還原力、DPPH自由基清除能力均呈極顯著正相關（P＜0.01）（表8），說明營養(yǎng)成分豐富、具有強抗氧化能力的酒能夠獲得好的評價，這與實際中的評價標準相符合。也說明本研究所選擇的評價指標合理，建立的評價體系可行。但遺憾的是羥自由基清除能力未能在本評價體系中獲得很好的體現(xiàn)，推測可能有其他物質參與羥自由基的清除，具體機理還有待后續(xù)研究予以揭示。

通過逐步回歸分析法建立的梨酒綜合品質理論模型可以很好地和通過因子分析建立的評價體系相擬合，說明此模型具有較高的可靠性，期望能夠通過此模型的建立簡化梨酒的評價參數(shù)，同時為篩選釀制優(yōu)質梨酒的酵母菌種提供指導。

4 結 論

本實驗通過因子分析法，對不同酵母釀制梨酒的綜合品質進行評價，結果表明LA-BA酵母釀制的梨酒綜合品質最好。通過逐步回歸法建立了梨酒綜合品質評價的理論模型：F’＝-3.123+0.486×F’1+0.980×F’2+0.006×F’3+0.034×F’4，其中F’1、F’2、F’3和F’4分別代表還原糖含量、鐵還原力能力、多酚含量和DPPH自由基清除率。此理論模型可以很好地和通過因子分析建立的評價體系相擬合，說明其具有較高的可靠性，期望能夠通過此模型的建立簡化梨酒的評價參數(shù)，同時為篩選釀制優(yōu)質梨酒的酵母菌種提供指導。