段瑞芳，武翠玲，王牛牛，任晨霞

血管緊張素轉(zhuǎn)化酶2(Angiotensin I converting enzyme 2， ACE2)，該基因編碼的蛋白質(zhì)屬于二肽基羧二肽酶的血管緊張素轉(zhuǎn)化酶家族[1]，被證明是嚴(yán)重急性呼吸綜合征病毒(Sever acute respiratory syndrome coronavirus, SARS-CoV)的功能性受體[2-3]，最近又被證明是新型冠狀病毒(severe acute respiratory syndrome coronavirus 2, SARS-CoV-2)受體[4]。研究表明ACE2極大地促進(jìn)了SARS-CoV復(fù)制的效率，SARS-CoV S蛋白介導(dǎo)細(xì)胞間融合的能力取決于ACE2蛋白的存在[2]。人、小鼠和大鼠對(duì)SARS-CoV病毒的感染效率與各物種的ACE2支持病毒復(fù)制的能力相關(guān)[5-7]，阻斷ACE2結(jié)合SARS-CoV S蛋白的抗體可保護(hù)小鼠免受SARS-CoV病毒感染[8]。自2002年SARS-CoV暴發(fā)以來(lái)，廣泛的結(jié)構(gòu)分析揭示了SARS-CoV穗蛋白受體結(jié)合域(Receptor-binding domain, RBD)與宿主受體ACE2之間的相互作用，該相互作用調(diào)節(jié)了SARS-CoV的物種和人類之間的傳播。目前已有研究發(fā)現(xiàn)，SARS-CoV-2的 RBD序列(包括直接接觸ACE2的受體結(jié)合基序(Receptor-binding motif， RBM)與SARS-CoV的序列相似，SARS-CoV-2 RBM中的幾個(gè)關(guān)鍵殘基與人ACE2有良好的相互作用，雖然SARS-CoV-2 RBM中的其他幾個(gè)關(guān)鍵殘基與ACE2結(jié)合不理想，但這些證件仍表明ACE2為致使人類細(xì)胞感染SARS-CoV-2病毒的受體[9]。此外，石正麗課題組的研究報(bào)道，確認(rèn)新型冠狀病毒SARS-CoV-2進(jìn)入細(xì)胞的方式與SARS-CoV病毒一致，都是通過(guò)ACE2受體介導(dǎo)。他們對(duì)不同物種中ACE2是否為介導(dǎo)SARS-CoV-2病毒進(jìn)入細(xì)胞的受體進(jìn)行研究發(fā)現(xiàn)，除小鼠外，SARS-CoV-2病毒可進(jìn)入人類、中華菊頭蝠、果子貍和豬等物種表達(dá)ACE2的HeLa細(xì)胞，但SARS-CoV-2病毒不能進(jìn)入未表達(dá)ACE2的HeLa細(xì)胞中[4]。對(duì)72個(gè)人體組織的實(shí)時(shí)定量PCR分析表明，ACE2 mRNA在支氣管和肺實(shí)質(zhì)以及心臟，腎臟和胃腸道中高效表達(dá)[10]。這也與新型冠狀病毒SARS-CoV-2引起呼吸系統(tǒng)、消化道反應(yīng)為主的癥狀高度吻合?；谶@些研究，對(duì)ACE2基因和蛋白進(jìn)行結(jié)構(gòu)和功能進(jìn)行生物信息學(xué)分析具有重要意義，以期為此次新型冠狀病毒SARS-CoV-2的作用機(jī)制及治療提供一定的理論支持。

1 材料與方法

1.1材料 ACE2的氨基酸序列由NCBI數(shù)據(jù)庫(kù)中GenBank中下載，檢索號(hào)為NP_001358344.1。

1.2方法 運(yùn)用Promoter Scan軟件對(duì)ACE2基因的啟動(dòng)子與相關(guān)轉(zhuǎn)錄因子進(jìn)行預(yù)測(cè)；分別使用SMOPA、Swiss-Model數(shù)據(jù)庫(kù)對(duì)ACE2蛋白的二級(jí)結(jié)構(gòu)、三級(jí)結(jié)構(gòu)進(jìn)行預(yù)測(cè)；通過(guò)SignalP5.0軟件預(yù)測(cè)出ACE2蛋白信號(hào)肽區(qū)域；用TMHMM對(duì)其跨膜結(jié)構(gòu)進(jìn)行預(yù)測(cè)；ACE2蛋白的理化性質(zhì)與親疏水性分別用ProtParam、ProtScale進(jìn)行分析；利用NetNGlyc1.0Server和NetOGlyc4.0Server軟件對(duì)ACE2蛋白的N-糖基化和O-糖基化位點(diǎn)進(jìn)行在線分析；經(jīng)過(guò)Netphos3.1aServer分析出ACE2蛋白的磷酸化位點(diǎn)；此外，ACE2蛋白的相關(guān)作用蛋白也通過(guò)String在線服務(wù)器做了預(yù)測(cè)，并對(duì)ACE2的互作蛋白進(jìn)行GO和KEGG功能富集分析，分析結(jié)果利用Image GP作圖展示。

2 結(jié) 果

2.1ACE2蛋白二級(jí)結(jié)構(gòu)預(yù)測(cè) 獲得ACE2蛋白序列后，在SMOPA數(shù)據(jù)庫(kù)中對(duì)ACE2蛋白質(zhì)的二級(jí)結(jié)構(gòu)進(jìn)行預(yù)測(cè)。圖1顯示為預(yù)測(cè)結(jié)果，其中α螺旋占比超過(guò)一半以上達(dá)51.18%，α螺旋有利于蛋白質(zhì)結(jié)構(gòu)的穩(wěn)定，因此ACE2蛋白二級(jí)結(jié)構(gòu)中如此高的α螺旋結(jié)構(gòu)暗示此蛋白構(gòu)象穩(wěn)定。無(wú)規(guī)則卷曲常位于蛋白質(zhì)的特異性功能部位，常出現(xiàn)在蛋白質(zhì)表面，無(wú)規(guī)卷曲在該蛋白二級(jí)結(jié)構(gòu)中占比達(dá)33.42%，符合ACE2蛋白作為受體蛋白的性質(zhì)。其次，延伸結(jié)構(gòu)和β轉(zhuǎn)角分別占比11.18%和4.22%。

圖1 ACE2蛋白二級(jí)結(jié)構(gòu)預(yù)測(cè)Fig.1 Prediction of secondary structure of ACE2 protein

2.2ACE2蛋白三級(jí)結(jié)構(gòu)預(yù)測(cè) 三級(jí)結(jié)構(gòu)預(yù)測(cè)通過(guò)Swiss-Model 數(shù)據(jù)庫(kù)進(jìn)行，首先將目的蛋白在數(shù)據(jù)庫(kù)中已有的蛋白進(jìn)行序列比對(duì)后，選擇相似度高或同源蛋白質(zhì)進(jìn)行自動(dòng)化比對(duì)建模，從而預(yù)測(cè)未知蛋白質(zhì)的三級(jí)結(jié)構(gòu)，ACE2蛋白三級(jí)結(jié)構(gòu)預(yù)測(cè)的結(jié)果如圖2所示。

圖2 ACE2蛋白三級(jí)結(jié)構(gòu)預(yù)測(cè)及其同源蛋白相似性波形圖Fig.2 Prediction of secondary structure of ACE2 protein and homologous protein similarity waveform

2.3ACE2蛋白信號(hào)肽序列 SignalP5.0軟件用于ACE2蛋白信號(hào)肽序列分析，輸入ACE2氨基酸序列N端前70個(gè)氨基酸，通過(guò)預(yù)測(cè)這段氨基酸序列中是否存在潛在酶切位點(diǎn)，從而預(yù)測(cè)蛋白是否存在信號(hào)肽。如圖3所示，ACE2存在信號(hào)肽，切割位點(diǎn)位于第19-20位氨基酸殘基之間。

圖3 ACE2 蛋白信號(hào)肽分析Fig.3 Signal peptide analysis of ACE2 protein

2.4ACE2蛋白跨膜結(jié)構(gòu)分析 TMHMM軟件被用于ACE2蛋白的跨膜結(jié)構(gòu)信息預(yù)測(cè)，結(jié)果見(jiàn)圖4。預(yù)測(cè)結(jié)果顯示，ACE2氨基酸序列中1-740位氨基酸位于細(xì)胞膜外，跨膜區(qū)位741-761位氨基酸序列，764-805位氨基酸位于細(xì)胞內(nèi)。ACE2蛋白的氨基酸有90%以上位于細(xì)胞膜外，此結(jié)果與ACE2蛋白成為SARA-Cov和SARS-CoV-2病毒受體的研究結(jié)果高度匹配。

圖4 ACE2蛋白跨膜區(qū)的預(yù)測(cè)Fig.4 Prediction of transmembrane region of ACE2 protein

2.5ACE2蛋白的理化性質(zhì) 使用ProtParam軟件對(duì)ACE2蛋白的理化性質(zhì)進(jìn)行預(yù)測(cè)。ACE2蛋白由805個(gè)氨基酸序列組成，蛋白分子量為92 463.04，總分子式為C4170H6358N1092O1222S35，總原子數(shù)為12 877，其中帶正電荷的氨基酸殘基Arg(arginine)和Lys(lysine)占 9.7%(78/805)；帶負(fù)電荷的氨基酸殘基 Asp(asparticacid)和Glu(glutamicacid)占 12.3%(99/805)。軟件分析顯示ACE2蛋白等電點(diǎn)PI=5.36，意味著ACE2蛋白偏酸性。此外，預(yù)測(cè)結(jié)果還顯示ACE2蛋白為不穩(wěn)定蛋白，其預(yù)測(cè)不穩(wěn)定指標(biāo)為40.09。其脂肪系數(shù)為80.55，平均親水性系數(shù)-0.375。ACE2蛋白質(zhì)的親疏水性通過(guò)ProtScale軟件分析，結(jié)果見(jiàn)圖5。其最大的疏水性分值為3.778，親水性的最大值為-3.311。如圖5所示，ACE2蛋白親水性氨基酸多于疏水性氨基酸，結(jié)合其親水性系數(shù)，推測(cè)ACE2蛋白為親水性蛋白。

圖5 ACE2 蛋白親疏水性分析Fig.5 Analysis of hydrophilicity and hydrophobicity of ACE2 protein

2.6ACE2蛋白翻譯后修飾 蛋白質(zhì)翻譯后修飾使得蛋白具有特定功能，對(duì)于真核細(xì)胞的生命活動(dòng)具有重要意義。常見(jiàn)的蛋白質(zhì)翻譯后修飾包括有泛素化、磷酸化、糖基化、甲基化、乙?；?、酯基化等。在此，我們對(duì)ACE2蛋白糖基化與磷酸化位點(diǎn)進(jìn)行分析，結(jié)果見(jiàn)圖6、7。分析結(jié)果顯示，ACE2蛋白N-糖基化位點(diǎn)有6個(gè)，分別位于第53、90、103、322、432、690位氨基酸(圖6)。

圖6 ACE2 蛋白N-糖基化分析Fig.6 ACE2 protein N-glycosylation analysis

圖7 ACE2 蛋白磷酸化的分析Fig.7 Analysis of phosphorylation of ACE2 protein

如圖7所示，ACE2蛋白磷酸化位點(diǎn)有77個(gè)，分別為第2、3、4、10、19、43、44、47、70、105、106、109、113、128、129、155、167、218、254、257、317、409、420、425、545、547、563、602、617、623、626、646、680、707、709、721、776、787、804位的絲氨酸(serine)位點(diǎn)；第20、52、92、118、125、129、229、276、282、324、414、434、445、496、517、519、548、593、686、698、763、803位的蘇氨酸(threonine)位點(diǎn)；以及第41、196、199、202、207、217、237、252、255、497、510、515、613、633、641、649、781位的酪氨酸(tyrosine)位點(diǎn)。

2.7ACE2相互作用網(wǎng)絡(luò) 利用STRING構(gòu)建蛋白相互作用網(wǎng)絡(luò)，發(fā)現(xiàn)與ACE2相互作用的蛋白有很多，圖8中展示出其中聯(lián)系密切的30個(gè)，分別是 I型血管緊張素受體(Type-1 angiotensin II receptor I, AGTR1)；II型血管緊張素受體(Type-2 angiotensin II receptor II, AGTR2)；血管緊張素原(Angiotensinogen, AGT)；血管緊張素轉(zhuǎn)換酶(Angiotensin-converting enzyme, ACE)；腎素(Renin, REN)；內(nèi)皮素1(Endothelin 1, EDN1)；內(nèi)皮素2(Endothelin 2, EDN2)；X-脯氨酰氨肽酶2(X-prolyl aminopeptidase 2, XPNPEP2)；脯氨酰羧肽酶(ProlylCarboxypeptidase, PRCP)；膜金屬內(nèi)肽酶(Membrane metalloendopeptidase, MME)；激肽原1(Kininogen 1, KNG1)；激肽釋放酶B1(Kallikrein B1, KLKB1)；谷氨酰胺基肽酶(Glutamyl aminopeptidase, ENPEP)；ATPase H+轉(zhuǎn)運(yùn)輔助蛋白2(ATPase H+ transporting accessory protein 2, ATP6AP2)；胰酶1(Chymase 1, CMA1)； 阿佩林(Apelin, APLN)；凝血因子II(Coagulation factor II, F2)；甲基多巴α亞基(Meprin A subunit alpha, MEP1A)；甲基多巴β亞基(Meprin A subunit beta, MEP1B)；G蛋白亞基alpha q(G protein subunit alpha q, GNAQ)；G蛋白耦聯(lián)受體激酶2(G protein-coupled receptor kinase 2, ADRBK1)；G蛋白耦聯(lián)受體激酶5(G protein-coupled receptor kinase5, GRK5)；β抑制蛋白1(Arrestin beta 1, ARRB1)；β抑制蛋白2(Arrestin beta 2, ARRB2)；胃抑制多肽(Gastric inhibitory polypeptide, GIP)；胰高血糖素(Glucagon, GCG)；二肽基肽酶4(Dipeptidyl peptidase 4, DPP4)；組織蛋白酶G(Cathepsin G, CTSG)；表皮生長(zhǎng)因子受體(Epidermal growth factor receptor, EGFR)；絲裂原激活的蛋白激酶3(Mitogen-activated protein kinase 3, MAPK3)。

圖8 ACE2 蛋白相互作用的預(yù)測(cè)Fig.8 Prediction of ACE2 protein interaction

2.8ACE2相互作用蛋白功能富集 將STRING的GO和KEGG功能富集結(jié)果可視化，如圖9所示顯著富集到的ACE2相互作用蛋白的生物學(xué)過(guò)程包括全身動(dòng)脈血壓的激素調(diào)節(jié)過(guò)程(regulation of systemic arterial blood pressure by hormone)、全身動(dòng)脈血壓的調(diào)節(jié)(regulation of systemic arterial blood pressure)、腎素-血管緊張素對(duì)全身動(dòng)脈血壓的調(diào)節(jié)(regulation of systemic arterial blood pressure by renin-angiotensin)、血液循環(huán)(blood circulation)、激素水平調(diào)節(jié)(regulation of hormone levels)等。顯著富集到的ACE2相互作用蛋白主要位于細(xì)胞外空間(extracellular space)、細(xì)胞質(zhì)膜(plasma membrane)、囊泡(cytoplasmic vesicle)、胞質(zhì)囊泡(vesicle)、質(zhì)膜部分(plasma membrane part)、分泌顆粒(secretory granule)等。顯著富集到的ACE2相互作用蛋白的分子功能包括G蛋白耦聯(lián)受體的結(jié)合(G protein-coupled receptor binding)、信號(hào)受體結(jié)合(signaling receptor binding)、肽鏈內(nèi)切酶活性(endopeptidase activity)、肽酶活性(peptidase activity)、催化活性(catalytic activity)、金屬肽酶活性(metallopeptidase activity)等。顯著富集到的ACE2相互作用蛋白的信號(hào)通路包括腎素-血管緊張素系統(tǒng)(Renin-angiotensin system)、蛋白質(zhì)消化吸收(Protein digestion and absorption)、腎素分泌(Renin secretion)、松弛素信號(hào)通路(Relaxin signaling pathway)、趨化因子信號(hào)通路(Chemokine signaling pathway)、內(nèi)吞作用(Endocytosis)、以及心肌細(xì)胞的腎上腺素能信號(hào)(Adrenergic signaling in cardiomyocytes)等。

圖9 ACE2 相互作用蛋白功能富集Fig.9 Function of ACE2 interacting proteins

3 討 論

目前研究已發(fā)現(xiàn)的ACE2蛋白功能主要包括2個(gè)方面，其一ACE2被證明是冠狀病毒SARS-CoV、SARS-CoV-2、HCoV-NL63(human coronavirus NL63)的受體，是上述3種病毒入侵細(xì)胞的必要條件[2,4,11]，其二在腎素-血管緊張素系統(tǒng)(Renin-angiotensin system, RAS)中發(fā)揮重要作用。本研究通過(guò)各種生物信息學(xué)軟件對(duì)ACE2蛋白的詳細(xì)生物信息學(xué)信息進(jìn)行了分析。結(jié)果顯示ACE2蛋白為含有信號(hào)肽的跨膜蛋白，該蛋白90%以上的結(jié)構(gòu)位于細(xì)胞膜外，已有研究表明 SARS-CoV-2 與 ACE2 結(jié)合的位置位于胞外段頂端[12]，分析結(jié)果與其作為細(xì)胞外病毒受體的生物學(xué)功能相吻合。結(jié)構(gòu)學(xué)研究揭示了， SARS-CoV及SARS-CoV-2通過(guò)病毒受體結(jié)合結(jié)構(gòu)域與ACE2的細(xì)胞外催化結(jié)構(gòu)域互動(dòng)結(jié)合，這種互動(dòng)能夠?qū)е录?xì)胞內(nèi)吞、膜融合從而使得SARS-CoV進(jìn)入宿主細(xì)胞[12-13]。而本研究中對(duì)ACE2蛋白功能富集分析也發(fā)現(xiàn)與ACE2相互作用蛋白主要分布在細(xì)胞外、細(xì)胞質(zhì)膜以及囊泡等區(qū)域，并且與介導(dǎo)內(nèi)吞作用的信號(hào)通路相關(guān)。

對(duì)ACE2相互作用蛋白的分析發(fā)現(xiàn)，ACE2與多個(gè)蛋白發(fā)生相互作用，我們?cè)趫D8中展示了30個(gè)。其中有19個(gè)蛋白與RAS調(diào)節(jié)相關(guān)，包括ACE、AGT、REN等[14-17]；這與ACE2功能富集分析結(jié)果吻合，即人ACE2蛋白主要通過(guò)參與腎素-血管緊張素系統(tǒng)、腎素分泌、松弛素信號(hào)通路、心肌細(xì)胞的腎上腺素等信號(hào)通路，在全身動(dòng)脈血壓調(diào)節(jié)、血液循環(huán)以及體液調(diào)節(jié)的生物學(xué)過(guò)程中發(fā)揮作用。其次，相互作用蛋白中有5個(gè)與G蛋白耦聯(lián)受體結(jié)合相關(guān)，包括GNAQ、GRK5、ADPBK1、ARRB1、ARRB2，而RAS系統(tǒng)調(diào)節(jié)也被證明與G蛋白耦聯(lián)受體信號(hào)通路相關(guān)[18-20]。RAS是機(jī)體重要的體液調(diào)節(jié)系統(tǒng)，血管緊張素轉(zhuǎn)化酶(angiotensin converting enzyme，ACE)作用于 血 管 緊 張 素 I(angiotensin I，Ang I)，產(chǎn)生血管緊張素 II (Ang II)，進(jìn)一步激活 G 蛋白耦聯(lián)受體，從而促血管收縮、促炎、促進(jìn)細(xì)胞凋亡等。ACE2與 ACE屬同工酶。ACE2可水解 AngⅡ，產(chǎn)生 Ang(1-7)，起到舒張血管、抗心肌肥大、抗炎、抗纖維化、改善心肌重構(gòu)等保護(hù)性作用。正常人體中 ACE2/ACE處于動(dòng)態(tài)平衡，調(diào)節(jié)機(jī)體生理功能[21]。周元琳等[21]研究提到，在SARS-CoV侵染小鼠細(xì)胞后，ACE2蛋白水平顯著降低，Ang II大量堆積，從而使RAS系統(tǒng)穩(wěn)態(tài)失衡。Imai等[22]發(fā)現(xiàn)，在肺組織中，Ang II高表達(dá)會(huì)增加血管通透性，導(dǎo)致肺水腫肺炎、心肌炎、急性呼吸窘迫綜合征等各種疾病?；赟ARS-CoV與SARS-CoV-2基因序列、進(jìn)入細(xì)胞的方式及其感染癥狀的相似性，并且SARS-CoV-2與ACE2結(jié)合的親和力為SARS-CoV的10～20倍[12]，推測(cè)SARS-CoV-2與大量ACE2結(jié)合，使得ACE2蛋白水平急劇減少，進(jìn)而產(chǎn)生一系列肺部損傷癥狀。值得注意的是，ACE2蛋白具有豐富的糖基化位點(diǎn)和磷酸化位點(diǎn)，糖基化對(duì)其與病毒結(jié)合是至關(guān)重要的[23]，此外與ACE2蛋白相互作用蛋白多為蛋白酶類，推測(cè)其可能通過(guò)在不同的氨基酸位點(diǎn)發(fā)生磷酸化，從而與多種酶蛋白相互作用發(fā)揮其生物學(xué)功能。

由于ACE2蛋白在介導(dǎo)SARS-CoV-2感染宿主細(xì)胞過(guò)程中發(fā)揮必不可少的作用，并且ACE2蛋白水平的變化對(duì)肺部組織損傷有顯著影響，ACE2已成為SARS-CoV-2感染的治療靶點(diǎn)。Liu等人經(jīng)過(guò)研究分析后建議將基于ACE2的肽作為治療SARS-CoV-2病毒感染的潛在藥物靶點(diǎn)[24]。選擇性破壞SARS-CoV-2與 ACE2 的結(jié)合也是一種選擇[25]。并且Wan等[9]的研究發(fā)現(xiàn)，SARS-CoV-2可從多種物種(除了大鼠和小鼠)中識(shí)別ACE2，他們認(rèn)為提出可以從受體ACE2入手，研究SARS-CoV-2的中間宿主。因此對(duì)于ACE2蛋白作為病毒受體的功能和機(jī)制研究是極有價(jià)值的。本研究對(duì)ACE2蛋白結(jié)構(gòu)和功能進(jìn)行生物信息學(xué)分析，希望能為SARS-CoV-2病毒的攻克提供一些理論基礎(chǔ)。

利益沖突：無(wú)