張丹,孫萍,陳思瑾,幸華,芮仕立,牛早霞，栗孟飛

(1.甘肅農(nóng)業(yè)大學(xué)生命科學(xué)技術(shù)學(xué)院，甘肅省干旱生境作物學(xué)重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，甘肅 蘭州 730070；2.甘肅省定西市農(nóng)業(yè)生態(tài)與資源保護(hù)技術(shù)推廣站，甘肅 定西 743000)

植物激素是指植物通過自身代謝產(chǎn)生的、在低濃度下即誘發(fā)生理效應(yīng)的有機(jī)信號分子，在植物生長發(fā)育及環(huán)境響應(yīng)過程中具有重要作用[1].植物激素常被分為內(nèi)源激素(endogenous hormones)和外源激素(exogenous hormones)兩類.內(nèi)源性植物激素是植物自身代謝產(chǎn)生的一類具有高度生物活性的有機(jī)小分子化合物，在植物某一部位合成，然后再轉(zhuǎn)運(yùn)至其他部位發(fā)揮生物學(xué)作用；外源植物激素是人工合成的具有植物激素活性的物質(zhì)，又叫植物生長調(diào)節(jié)劑.根據(jù)生理功能和化學(xué)結(jié)構(gòu)的不同，可將植物激素分為：生長素(auxins)[如吲哚-3-乙酸(Indole-3-acetic acid，IAA)、吲哚-3-丁酸(Indole-3-butyric acid，IBA)、萘乙酸(Naphthylacetic acid，NAA)等]、細(xì)胞分裂素(cytokinins，CTKs)[如玉米素(Zeatin，ZT)、異戊烯基腺嘌呤(isopentenyl adenine，iPAde)、6-芐氨基腺嘌呤(6-benzylaminopurine，6-BA)等]、赤霉素(gibberellins，GAs)、脫落酸(abscisic acid，ABA)、乙烯(ethylene，ETH)、油菜素甾醇(brassinosteroids，BRs)、茉莉酸(jasmonic acid，JA)及其衍生物和水楊酸(salicylic acid，SA)等8大類[2].

由于植物激素在提高作物產(chǎn)量和品質(zhì)方面扮演著重要角色，因此對其準(zhǔn)確地檢測具有重要意義[3].目前，對于植物激素的檢測經(jīng)典方法有：1)生物鑒定法，利用激素作用于植物組織和器官產(chǎn)生特異性反應(yīng)進(jìn)行測定；2)免疫檢測法，基于抗原和抗體的特異性結(jié)合，包括放射免疫測定法、酶聯(lián)免疫吸附測定法、熒光免疫法等；3)色譜法，利用激素在固定相和流動(dòng)相上保留性質(zhì)的差異實(shí)現(xiàn)分離和檢測，早期主要有紙層析和薄板層析法，現(xiàn)代最常見的方法有氣相色譜法(gas chromatography，GC)和高效液相色譜法(high performance liquid chromatography，HPLC)；4)色譜質(zhì)譜(Chromatography-mass spectrometry,C-MS)聯(lián)用技術(shù)，克服了傳統(tǒng)色譜技術(shù)在植物激素定性和定量分析方面的不足，將色譜對復(fù)雜混合物的分離能力與質(zhì)譜的高選擇性、高靈敏度以及能夠直接得到待測物質(zhì)的結(jié)構(gòu)與相對分子量等特點(diǎn)相結(jié)合，已在激素分析等領(lǐng)域得到了廣泛應(yīng)用；其中，LC-MS靈敏度高，選擇性強(qiáng)，且可同時(shí)測定多種不同激素，是目前激素分析的主流，也是今后的發(fā)展趨勢[4-6].

基于LC-MS的優(yōu)勢，很多學(xué)者就LC-MS同時(shí)檢測植物激素的方法進(jìn)行了細(xì)致研究與報(bào)道.比如，鐘冬蓮等[7]同時(shí)測定了毛竹筍中4種內(nèi)源性植物激素(GA3、ABA、IAA和IBA)；郭建恒等[8]同時(shí)測定了大花羅布麻葉中5種植物激素(GA3、ABA、IAA、IBA和JA)；龔明霞等[9]同時(shí)測定了辣椒葉片中7種植物激素(GA1、GA3、GA4、ABA、IAA、ZT和JA).到目前為止，還沒有建立針對不同植物種類、同時(shí)檢測GA3、iPAde、6-BA、IAA、SA和ABA等6種植物激素的LC-MS方法.

1 材料與方法

1.1 試劑

試驗(yàn)所用6種植物內(nèi)源激素標(biāo)準(zhǔn)品：吲哚-3-乙酸(indole-3-acetic acid，IAA)、赤霉素(gibberellin A3，GA3)、異戊烯基腺嘌呤(isopentenyl adenine，iPAde)、6-芐氨基腺嘌呤(6-benzylaminopurine，6-BA)、脫落酸(abscisic acid，ABA)和水楊酸(salicylic acid，SA)均采自上海源葉生物科技有限公司.乙腈、甲醇、甲酸、無水乙醇均為色譜級(≥98%，HPLC).

1.2 儀器

LC-MS聯(lián)用儀(Agilent 1290-6460,美國)，色譜柱ZORBAX Eclipse Plus C18(Rapid resolution HD 2.1 mm×150 mm，1.8 μm).

1.3 測定方法

LC條件：檢測波長290 nm，柱溫35 ℃，流速0.3 mL/min；流動(dòng)相：B(甲醇)∶A (0.1%甲酸)，采用梯度洗脫：0～1 min 10%～40%(B)、1～2.5 min 40%～45%(B)、2.5～5 min 45%～80%(B)、5～5.1 min 80%～10%(B)、5.1～7.1 min 10%～10%(B)，進(jìn)樣量5 μL.

MS條件：電噴霧電離子源(ESI)，掃描方式為負(fù)離子掃描，多反應(yīng)監(jiān)測模式，離子源溫度350 ℃，干燥氣流速11 L/min，霧化器壓力35 psi，毛細(xì)管電壓4 kV，碰撞氣為高純氮?dú)?6種植物激素的質(zhì)譜具體參數(shù)見表1.

表1 6種植物激素的質(zhì)譜參數(shù)

1.4 植物內(nèi)源激素的提取

植物內(nèi)源激素的提取參考張玉瓊等[10]方法.具體步驟為：首先，稱取1.0 g新鮮植物(馬鈴薯、油菜和苜蓿)葉片，液氮研磨至勻漿后置于15 mL離心管，加入10 mL預(yù)冷的甲醇-甲酸溶液(99∶1)；22 ℃超聲2 min后置于4 ℃下靜置提取12 h；其次，浸提液以10 000 r/min離心10 min，吸取1.0 mL上清液，加入H2O定容至10 mL；然后，用ODS C18固相萃取柱進(jìn)行上樣吸附，用10%甲醇溶液6 mL，分兩次淋洗固相萃取柱；最后，用甲醇-甲酸溶液(99∶1) 6 mL進(jìn)行洗脫，收集的洗脫液經(jīng)減壓濃縮至小體積，用甲醇定容至1.0 mL，0.22 μm微孔濾膜過濾，用于內(nèi)源激素的檢測.

1.5 定性與定量分析

對分析樣品溶液進(jìn)行LC-MS/MS測定，以各種激素的保留時(shí)間和特征離子對為依據(jù)進(jìn)行定性，采用標(biāo)準(zhǔn)曲線進(jìn)行定量.

2 結(jié)果與分析

2.1 標(biāo)準(zhǔn)品獨(dú)立檢測方法的建立

6種激素質(zhì)量濃度均為10 μg/L，進(jìn)樣量5 μL時(shí)，在1.3測定方法條件下，GA3出峰時(shí)間為4.42 min、峰面積為283.38(圖1-1A和1-1B)；iPAde出峰時(shí)間為4.63 min、峰面積為256.78(圖1-2A和1-2B)；6-BA出峰時(shí)間為4.84 min、峰面積為525.71(圖1-3A和1-3B)；IAA出峰時(shí)間為5.09 min、峰面積為70.41(圖1-4A和1-4B)；SA出峰時(shí)間為5.51 min、峰面積為641.50(圖1-5A和1-5B)；ABA出峰時(shí)間為5.71 min、峰面積為675.65(圖1-6A和1-6B).

2.2 標(biāo)準(zhǔn)品同時(shí)檢測方法的建立

將以上6種激素標(biāo)準(zhǔn)樣品(質(zhì)量濃度10 μg/L)進(jìn)行混合，進(jìn)樣量5 μL，在相同的色譜條件下進(jìn)行同時(shí)測定，結(jié)果見圖2.GA3、iPAde、6-BA、IAA、SA和ABA之間分離度較好，各激素基線之間沒有重疊，表明該檢測方法可同時(shí)進(jìn)行6種激素的檢測.

2.3 測定方法的線性范圍和檢出限

將混合的標(biāo)準(zhǔn)樣品配制成梯度濃度，在相同的色譜條件下測定其峰面積，以濃度X(μg/L)為橫坐標(biāo)，色譜峰面積Y為縱坐標(biāo)繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線，并獲得相應(yīng)的線性回歸方程及相關(guān)系數(shù).表2結(jié)果表明：6種植物激素在濃度范圍內(nèi)具有良好的線性關(guān)系，相關(guān)系數(shù)R2均達(dá)到0.99，檢出限在1.0～100 μg/L之間，說明本研究方法對植物激素有較高的檢測靈敏度.

2.4 同時(shí)檢測方法在植物樣品中的檢測效果

利用上述建立的6種植物激素同時(shí)檢測方法，對馬鈴薯、油菜和苜蓿葉片中提取的內(nèi)源激素進(jìn)行檢測(圖3).3種植物葉片中6種內(nèi)源激素盡管存在含量和靈敏度差異，以及提取液中其他化學(xué)組分的干擾，但是激素均有較好的出峰和分離度.這表明本研究所建立的同時(shí)檢測6種植物激素的方法可用于植物激素的快速檢測.

圖1 GA3、iPAde、6-BA、IAA、SA和ABA標(biāo)準(zhǔn)品獨(dú)立測定的LC(A)-MS(B)圖譜Figure 1 Chromatograms of GA3,iPAde,6-BA,IAA,SA and ABA individually determined by LC(A)-MS(B)

圖2 GA3、iPAde、6-BA、IAA、SA和ABA標(biāo)準(zhǔn)品同時(shí)測定的LC-MS圖譜Figure 2 Chromatograms of GA3,iPAde,6-BA,IAA,SA and ABA simultaneously determined by LC-MS

表2 6種植物激素的線性關(guān)系和檢出限

圖3 LC-MS同時(shí)測定方法在植物內(nèi)源激素檢測中的應(yīng)用Figure 3 Application of simultaneous determination by LC-MS in plant endogenous hormones

3 討論

HPLC基于高壓、高速、高效、高靈敏度和操作方便的特點(diǎn)，以及適宜于高沸點(diǎn)、熱穩(wěn)定性差和相對分子質(zhì)量大的有機(jī)化合物，已廣泛的應(yīng)用于自然界有機(jī)化合物的分離與分析[11]，當(dāng)然也包括同時(shí)分離測定植物多種內(nèi)源和外源激素，比如張玉瓊等[10]同時(shí)測定了小麥葉中5種激素(IAA、ABA、GA3、ZT和SA)，楊途熙等[12]同時(shí)測定了杏花芽中8種激素(ZT、GA3、IAA、6-BA、ABA、IBA、腺素和秋水仙素)，李華等[13]同時(shí)測定了枇杷果實(shí)中10種激素(ZT、GA3、SA、6-BA、IAA、IBA、JA、ABA、激動(dòng)素和苯甲酸).盡管HPLC能借助色譜柱對有機(jī)化合物進(jìn)行高效的分離，然而其對化合物的檢測器主要為紫外光度檢測器(ultraviolet photometric detector)、光電二極管陳列檢測器(photo-diode array detector)、熒光檢測器(fluorescence detector)、差示折光檢測器(differential refractive index detector)和電導(dǎo)檢測器(electrical conductivity detector)等光譜的檢測方面，不能從化合物結(jié)構(gòu)上進(jìn)行真正鑒定，而生物提取液中含有大量的化學(xué)結(jié)構(gòu)相似和極性相近的化合物.

MS分析可在電噴霧大氣壓(electron spray ionization,ESI)離子源的基礎(chǔ)上使單體或混合物離子化，按照質(zhì)荷比m/z (mass-charge ratio)進(jìn)行分離，然后從分子離子峰可以準(zhǔn)確地測定物質(zhì)的相對分子質(zhì)量，進(jìn)而利用元素的精確質(zhì)量及豐度比求算其元素組成，最終根據(jù)有機(jī)化合物的標(biāo)準(zhǔn)譜圖檢索，確立或者推測化合物的分子式[11].基于此，LC-MS聯(lián)用不僅可以使得化合物在LC的條件下進(jìn)行較好的分離和含量的檢測，而且還可以在后續(xù)MS的條件下對分離的化合物進(jìn)行結(jié)構(gòu)的鑒定，最終實(shí)現(xiàn)對生物體內(nèi)提取所得化合物的含量和種類進(jìn)行同時(shí)檢測.

本研究通過對LC-MS/MS測定過程中流動(dòng)相、流速、柱溫等的優(yōu)化，最終建立了可針對不同植物，同時(shí)測定6種植物激素(GA3、iPAde、6-BA、IAA、SA和ABA)的高效與便捷檢測方法，這將對深入研究植物生長與發(fā)育過程、揭示植物響應(yīng)生物與非生物環(huán)境機(jī)制、提高植物產(chǎn)量和品質(zhì)以及鑒定殘留激素等方面具有重要的實(shí)際應(yīng)用與參考價(jià)值.