陳林林,吳嘉樹,李 偉,范天嬌,韓 可,辛嘉英,2

(1.哈爾濱商業(yè)大學(xué)，省高校食品科學(xué)與工程重點實驗室,黑龍江哈爾濱 150076;2.中國科學(xué)院，蘭州化學(xué)物理研究所，羰基合成與選擇氧化國家重點實驗室,甘肅蘭州 730000)

三聚氰胺(MEL,C3H6N6,1,3,5-三嗪-2,4,6-三胺)是富氮雜環(huán)化合物。它通常用于生產(chǎn)塑料、粘合劑、涂層劑、餐具、泡沫、顏料、膠水和阻燃劑等[1-3]。由于氮含量高,一些食品企業(yè)違規(guī)將三聚氰胺用于乳制品中,這種方法可以使乳產(chǎn)品通過凱氏定氮法[4]檢測時提供較高的氮濃度,以顯示其產(chǎn)品中的高蛋白質(zhì)含量。過量攝入MEL(美國和歐盟為2.5 ppm;在中國,嬰兒配方奶粉的濃度為百萬分之一)可能會促使腎臟中形成不溶性的MEL氰尿酸鹽結(jié)晶,最終導(dǎo)致腎功能衰竭甚至死亡[5]。例如,2007～2008年在美國和中國由于乳制品中違法添加三聚氰胺造成的兒童和寵物急性腎臟問題[6]。盡管有嚴(yán)格的規(guī)定,一些食品仍含有三聚氰胺[7]。因此,一種簡單、靈敏、穩(wěn)健的檢測三聚氰胺含量的方法是所必需的[8-9]。

現(xiàn)有的三聚氰胺測定方法包括:分光光度法[10]、化學(xué)發(fā)光法[11]、電化學(xué)檢測法[12]、色譜與UV或質(zhì)量檢測器結(jié)合法[13]。在這些方法中,電化學(xué)方法簡單、成本低、更準(zhǔn)確,更易于現(xiàn)場應(yīng)用。此外,電化學(xué)方法為確定許多生物和環(huán)境污染物提供了一種靈敏的方法[14-15]。因此,近年來,電化學(xué)技術(shù)因其強(qiáng)大的應(yīng)用前景在分析化學(xué)領(lǐng)域引起了特別的關(guān)注。

甲烷氧化菌素(methanobactin,Mb)是一種小分子熒光肽,在甲烷氧化菌細(xì)胞外以分泌物的形式存在,在細(xì)胞內(nèi)則參與顆粒甲烷單加氧酶(pMMO)的組成,并且存在于細(xì)胞內(nèi)膜上[16]。Mb與銅的結(jié)合物(Mb-Cu)具有超氧化物歧化酶的活性[17-18]。Mb不僅可以與Cu(Ⅱ)結(jié)合,同時也具有螯合 Au(Ⅲ)并將其還原成Au(0)的能力。目前,已采用生物法制備出修飾有Mb的單分散納米金Mb-AuNPs,該納米金不僅性質(zhì)穩(wěn)定,同時還保持有Mb的生物活性[19-22]。近年來,納米金被廣泛用于三聚氰胺的檢測,李萌萌等[23]把 1,4-二硫蘇糖醇(DTT)、金納米粒子、L-半胱氨酸(L-Cys)組裝到修飾電極表面,制備了 GO/DTT/AuNPs/L-Cys/GCE 復(fù)合電極,用來檢測三聚氰胺,最低檢測濃度為1.0×10-8mol/L。Xin等[20]利用Mb介導(dǎo)納米金的合成過程中,加入三聚氰胺時,三聚氰胺與Mb的惡唑酮環(huán)相互作用,從而中斷Au-NPs的形成。三聚氰胺還可以刺激形成的Au-NP聚集。以此來檢測三聚氰胺,此方法的最低檢出濃度為2.38×10-7mol/L。本實驗將與納米金結(jié)合后的Mb(Mb-AuNPs)以混合自組裝的方法修飾到裸金電極表面,此修飾物質(zhì)與傳統(tǒng)電極修飾物質(zhì)相比,易于制備并且對人體無毒害,可用于直接食品檢測。此復(fù)合電極與三聚氰胺之間產(chǎn)生作用,可以對痕量的三聚氰胺產(chǎn)生響應(yīng),以此分析此修飾電極在檢測三聚氰胺時的電化學(xué)行為。

1 材料與方法

1.1 材料與儀器

三聚氰胺 阿拉丁試劑公司;鐵氰化鉀、亞鐵氰化鉀、磷酸氫二鈉、檸檬酸 天津市天力化學(xué)試劑有限公司;氯金酸 天津市贏達(dá)稀貴化學(xué)試劑廠;檸檬酸鈉 天津市光復(fù)精細(xì)化工研究所。

BSA224S電子天平 賽多利斯科學(xué)儀器(北京)有限公司;CHI660E電化學(xué)工作站 上海辰華大陸化學(xué)試劑廠;HNY-100B恒溫培養(yǎng)振蕩器 天津市歐諾儀器儀表有限公司;R-20旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀 上海-恒科學(xué)儀器有限公司;SHB-Ⅲ循環(huán)水式多用真空泵 鄭州長城科工貿(mào)有限公司;TGL-16高速臺式離心機(jī) 上海醫(yī)療器械六廠;HL-2S恒流泵 上海滬西分析儀器廠有限公司;98-1-B型電子調(diào)溫電熱套 天津市泰斯特儀器有限公司。

1.2 實驗方法

1.2.1 Mb-AuNPs的制備 根據(jù)文獻(xiàn)[24]進(jìn)行Mb的制備和分離純化,并利用Frens法[25]制備出酒紅色的AuNPs溶液,將0.11×10-4mol/L Mb加入2 mL AuNPs溶液中,熒光下檢測Mb與納米金的組裝結(jié)果。

1.2.2 裸金電極的制備 取一個金電極,在制備好的食人魚溶液(70%濃硫酸與30%過氧化氫混合制成)中浸泡5 min取出,用去離子水沖洗幾次,去除表面的食人魚溶液。金電極(φ=3 mm)分別用粒徑為0.25和0.05 μm的氧化鋁懸浮液拋光成鏡面,然后用甲醇和水超聲清洗30 s,從而得到預(yù)處理好的裸金電極。

1.2.3 Mb-AuNPs修飾電極納米金粒徑的優(yōu)化 采用5×10-3mol/L K3[Fe(CN)6]與5×10-3mol/L K4[Fe(CN)6]+0.1 mol/L KCl溶液作為電化學(xué)測定的交流阻抗法(AC impedance method,EIS)與循環(huán)伏安法(CyclicVoltammetry,CV)的測定用溶液。使用已制得的Mb,與平均粒徑分別為10.6、14.3、16.8、17.7和20.6 nm粒徑的納米金進(jìn)行自組裝,利用熒光光譜監(jiān)測組裝過程,將結(jié)合好的Mb-AuNPs修飾到已經(jīng)打磨完畢的裸金電極上,以5×10-3mol/L K3[Fe(CN)6]與5×10-3mol/L K4[Fe(CN)6]+0.1 mol/L KCl溶液為電化學(xué)測定溶液,研究修飾電極的電化學(xué)性能。

1.2.4 三聚氰胺在修飾電極上的電化學(xué)行為 將0.01 mol/L的三聚氰胺溶液與0.1 mol/L PBS緩沖溶液混合,以此溶液作為檢測三聚氰胺的電化學(xué)測定溶液,利用循環(huán)伏安法分析該電極的電化學(xué)行為。

1.2.4.1 PBS溶液對三聚氰胺電化學(xué)行為的影響 使用已制得的Mb,與平均粒徑為16.8 nm的納米金進(jìn)行自組裝,利用熒光光譜監(jiān)測組裝過程,將結(jié)合好的Mb-AuNPs修飾到已經(jīng)打磨完畢的裸金電極上。加入的PBS緩沖溶液濃度分別為0.0、0.1、0.2、0.3、0.4、0.5 mol/L,考察加入不同濃度的PBS對三聚氰胺體系檢測的影響,以確定自組裝修飾電極檢測三聚氰胺的最優(yōu)條件。

1.2.4.2 體系pH對三聚氰胺電化學(xué)行為的影響 使用1.2.4.1中修飾電極的制備方法制備出Mb-AuNPs修飾電極,加入的PBS緩沖溶液濃度為0.1 mol/L,PBS緩沖溶液pH分別為5.0、5.5、6.0、6.5、7.0,考察體系pH對三聚氰胺檢測的影響。

1.2.4.3 修飾電極對三聚氰胺的檢測 使用已制得的Mb,與粒徑為16.8 nm的納米金進(jìn)行自組裝,利用熒光光譜監(jiān)測組裝過程,將結(jié)合好的Mb-AuNPs修飾到已經(jīng)打磨完畢的裸金電極上,使用pH6.0濃度為0.1 mol/L的PBS緩沖溶液,三聚氰胺濃度分別為0.001、0.002、0.003、0.004、0.005、0.006、0.007、0.008、0.009、0.01 mol/L。利用循環(huán)伏安法考察Mb-AuNPs電極對不同濃度三聚氰胺的響應(yīng)性能,根據(jù)三聚氰胺濃度與氧化峰電流的關(guān)系,繪制得到以三聚氰胺濃度(X)為橫坐標(biāo),峰電流(Y)為縱坐標(biāo)標(biāo)準(zhǔn)曲線。

1.3 數(shù)據(jù)處理

所有實驗均重復(fù)3次,不同組的數(shù)據(jù)使用SPSS 17.0軟件采用Duncan’s新復(fù)極差檢驗法進(jìn)行顯著性差異分析,顯著性水平P<0.05。使用Origin軟件繪圖。

2 結(jié)果與分析

2.1 Mb與納米金的組裝結(jié)果

由圖1可知,在275 nm激發(fā)波長下,16.8 nm金納米粒子的最大熒光發(fā)射在550 nm處。隨著Mb的加入,金納米粒子的熒光發(fā)射強(qiáng)度明顯減小,峰位置基本不變,說明金納米粒子和Mb之間存在強(qiáng)烈的相互作用,從而導(dǎo)致金納米粒子的熒光發(fā)生了猝滅,當(dāng)Mb加入量達(dá)到0.20 mL時,金納米粒子的熒光發(fā)射強(qiáng)度與Mb加入量0.18 mL時相比基本不變。實驗中同時考察了10.6、12.7、14.3、17.7、20.6 nm粒徑納米金的結(jié)合情況,結(jié)果顯示,與圖1具有相同的趨勢與結(jié)果?？芍狹b與納米金結(jié)合完成。

圖1 納米金中加入Mb后的熒光光譜Fig.1 Fluorescence spectrum after adding Mb to AuNPs

2.2 不同納米金粒徑Mb-AuNPs的電化學(xué)性能

向預(yù)處理好的裸金電極表面滴加20 μL Mb-AuNPs溶液,避光,置于4 ℃環(huán)境下18 h。測試前用去離子水沖洗并用N2吹干,從而得到制備好的修飾電極以進(jìn)行電化學(xué)測定。將平均粒徑為10.6、14.3、16.8、17.7和20.6 nm的納米金分別結(jié)合Mb后,采用5×10-3mol/L K3[Fe(CN)6]與5×10-3mol/L K4[Fe(CN)6]+0.1 mol/L KCl溶液為測定用溶液,通過交流阻抗與循環(huán)伏安分析其電化學(xué)性能,結(jié)果如圖2和圖3所示。

圖2 修飾電極在測定溶液中的交流阻抗Fig.2 AC impedance of modified electrode in assay solution

圖3 修飾電極在測定溶液中的循環(huán)伏安圖Fig.3 Cyclic voltammetry of modified electrode in assay solution

由圖2所示,經(jīng)擬合后的阻抗圖譜(其中,Z′為實部電阻,Z″為虛部電阻)中的圓弧半徑是隨著Mb-AuNPs與電極表面修飾效果的增大而增大,而電極電子傳遞電阻(Rtc)的值與其阻抗圖譜中的圓弧半徑值相等。裸金電極的Rtc最小,近乎為一條直線,說明此時電極表面光滑,無任何物質(zhì)修飾。當(dāng)電極被自組裝修飾Mb-AuNPs后,Rtc增大,這是因為自組裝在金電極表面的Mb-AuNPs形成了一層有序致密的膜,阻礙電極表面與電解液間的電子傳輸作用,而隨著修飾效果的增加,其電子傳遞電阻也在增加。圖2中各電極的Rtc:Mb-AuNPs(16.8 nm)電極>Mb-AuNPs(17.7 nm)電極>Mb-AuNPs(20.6 nm)電極>Mb-AuNPs(14.3 nm)電極>Mb-AuNPs(10.6 nm)電極。因此,粒徑為16.8 nm的納米金與Mb結(jié)合后的Mb-AuNPs與裸金電極的組裝效果最佳。

從圖3中可以看出,修飾電極的氧化還原峰電流均低于裸電極8.54×10-5A,氧化還原峰電位均高于裸電極0.283 V,這是由于在電極表面有更多的物質(zhì)阻礙電子傳遞過程,使氧化還原峰電流不斷降低,修飾效果越好,降低越明顯。其中Mb-AuNPs(16.8 nm)修飾電極的循環(huán)伏安曲線峰電流最低為6.83×10-5A,峰電位最高為0.324 V,說明修飾效果較好。馮春梁等[26]制備的金-普魯士藍(lán)復(fù)合納米粒子修飾電極,得出當(dāng)交流阻抗圖譜的Rtc最大,循環(huán)伏安曲線的峰電流最小時的條件為最佳的修飾條件。李萌萌等[23]制備的1,4-二硫蘇糖醇(DTT)、金納米粒子、L-半胱氨酸(L-Cys)修飾電極,當(dāng)1,4-二硫蘇糖醇(DTT)、金納米粒子、L-半胱氨酸(L-Cys)修飾到電極表面后,循環(huán)伏安曲線的氧化還原峰電流值降低,交流阻抗圖譜圓弧半徑變小。與本實驗具有相似的結(jié)果。

2.3 三聚氰胺在修飾電極上的電化學(xué)行為

2.3.1 PBS溶液對三聚氰胺電化學(xué)行為的影響 由圖4可以看出在濃度分別為0.0、0.1、0.2、0.3、0.4、0.5 mol/L PBS緩沖溶液的三聚氰胺體系中Mb-AuNPs電極的電化學(xué)行為。在三聚氰胺的電化學(xué)還原中,在添加PBS溶液的反應(yīng)體系中,循環(huán)伏安曲線峰電流隨著PBS溶液濃度的增加而降低。當(dāng)添加與不添加PBS溶液時,體系有明顯的電流響應(yīng),峰電流由2.38×10-7A增加到1.51×10-6A,實驗結(jié)果表明修飾電極檢測三聚氰胺需要在PBS體系下進(jìn)行。當(dāng)加入0.1～0.5 mol/L PBS溶液時,其對應(yīng)的循環(huán)伏安曲線峰電流值分別為:1.51×10-6、1.46×10-6、1.38×10-6、1.30×10-6、1.24×10-6A。0.1 mol/L PBS緩沖溶液的三聚氰胺體系呈現(xiàn)出了最高的電流響應(yīng),因此,選擇0.1 mol/L PBS緩沖溶液的三聚氰胺體系用于Mb-AuNPs電極測定三聚氰胺的后續(xù)研究。

圖4 不同濃度PBS體系檢測三聚氰胺的循環(huán)伏安圖Fig.4 Cyclic voltammetry of melamine detected by different solution ratio systems

2.3.2 體系pH對三聚氰胺電化學(xué)行為的影響 由圖5可知,在不同pH(5.0、5.5、6.0、6.5、7.0)的PBS中Mb-AuNPs電極的性能隨pH變化。隨著檢測體系pH的增加,峰電流呈現(xiàn)增加后減小的趨勢。在三聚氰胺的這種電化學(xué)還原中,各pH(5.0、5.5、6.0、6.5、7.0)下的循環(huán)伏安曲線峰電流分別為1.13×10-6、1.45×10-6、1.51×10-6、1.38×10-6、1.22×10-6A。pH=6.0的檢測體系呈現(xiàn)出了最高的電流響應(yīng)。因此,選擇6.0的pH用于Mb-AuNPs電極測定三聚氰胺的后續(xù)研究。

圖5 不同pH體系檢測三聚氰胺的循環(huán)伏安圖Fig.5 Cyclic voltammetry of melamine detected by different pH systems

2.3.3 修飾電極對三聚氰胺的檢測 從圖6可知,加入三聚氰胺溶液與未加入三聚氰胺溶液的反應(yīng)體系中,循環(huán)伏安曲線有著明顯變化,氧化峰電流由2.12×10-7A增加到1.51×10-6A,氧化峰電位由0.189 V增加到0.243 V。還原峰電流由-5.47×10-7A增加到-1.71×10-6A,還原峰電位由0.02 V增加到0.16 V。加入三聚氰胺溶液后看到了明顯的氧化還原峰,試驗結(jié)果表明,Mb-AuNPs修飾電極在三聚氰胺體系中對三聚氰胺有明顯的響應(yīng)信號。

圖6 修飾電極在有無三聚氰胺溶液體系中的循環(huán)伏安圖Fig.6 Cyclic voltammetry of modified electrode in with or without melamine system

如圖7所示,利用Origin軟件擬合得到標(biāo)準(zhǔn)曲線為y=0.0909x+0.72233,相關(guān)系數(shù)r=0.9909,說明在此范圍內(nèi)三聚氰胺濃度與其峰電流呈現(xiàn)出良好的線性關(guān)系,滿足分析要求。采用三倍信噪比計算其最低檢測限為0.384×10-8mol/L與李萌萌等[23]和楊曉蕊等[27]文獻(xiàn)得出的結(jié)果相比,均低于其檢出限。

圖7 三聚氰胺標(biāo)準(zhǔn)曲線Fig.7 Standard curve of melamine

2.3.4 重現(xiàn)性與穩(wěn)定性 使用同一根Mb-AuNPs電極測定三聚氰胺樣品溶液,重復(fù)測定10次,所得結(jié)果如表1所示,平均峰電流為1.549×10-6A,相對標(biāo)準(zhǔn)偏差RSD為0.75%,表明該電極具有良好的重現(xiàn)性。再將制備好的電極在空氣中放置7 d,然后進(jìn)行檢測。峰電流為1.457×10-6A,與剛制備好的電極峰電流相比無顯著性差異(P<0.05),表明該修飾電極的穩(wěn)定性良好,使用壽命長,可以進(jìn)行實際應(yīng)用。

表1 重現(xiàn)性試驗結(jié)果Table 1 Reproducible test results

2.3.5 干擾實驗 研究了在該三聚氰胺定量過程中普通無機(jī)離子以及有機(jī)化合物可能的干擾作用。結(jié)果表明,500倍的常見無機(jī)鹽NaCl、KNO3,100倍的葡萄糖和尿素等在該三聚氰胺(0.01 mol/L)測定中具有可忽略的干擾效應(yīng)(干擾<±5%)。

3 結(jié)論

通過電化學(xué)循環(huán)伏安法和交流阻抗法對修飾電極的性能以及三聚氰胺在修飾電極上的電化學(xué)行為分析得出,以16.8 nm的納米金制備出的Mb-AuNPs電極電化學(xué)性能最好,在PBS濃度為0.1 mol/L、PBS溶液pH為6.0時,該修飾電極在檢測此三聚氰胺體系時得到最高的電化學(xué)信號。該電極制備簡單,檢測效果好,最低檢出限為0.384×10-8mol/L,相對標(biāo)準(zhǔn)偏差(RSD)為0.75%,并且該電極具有理想的重現(xiàn)性與穩(wěn)定性,為實際樣品的檢測提供理論依據(jù)。