鼻咽癌是常見惡性腫瘤，起源于鼻咽腔的頂部和側(cè)壁，鼻咽癌嚴重影響著人們的生活質(zhì)量[1]。研究表明，鼻咽癌的發(fā)生與其基因的異常表達有關(guān)，研究其分子發(fā)生機制對于鼻咽癌的治療和診斷具有重要意義[2]。miRNA在人體內(nèi)表達，與人類多種疾病有關(guān)[3]。miRNA在疾病中異常表達改變往往與疾病的進程有關(guān)，通過靶向抑制或重建基因的表達可能是疾病治療的有效途徑[4]。研究報道顯示，腫瘤的發(fā)生與miRNA的表達有關(guān)，miRNA可以作用一種小分子標記物用于腫瘤的治療[5]。目前已知miR-106a-5p 參與調(diào)控細胞生長，參與腫瘤進程，其作用機制與靶向調(diào)控基因的表達有關(guān)[6]。miR-106a-5p在肝癌等腫瘤組織中高表達，miR-106a-5p 通過作用于PTEN影響肝癌細胞生長[7]。第10號染色體同源缺失性磷酸酶-張力蛋白（phosphatase and tensin homolog deleted on chromosome 10，PTEN）是一種與細胞生長等有關(guān)的基因，在多種腫瘤中表達下調(diào)，可以通過作用于細胞內(nèi)相關(guān)細胞因子阻礙細胞的生長，對細胞的遷移和侵襲能力也具有抑制作用[8]。目前尚未發(fā)現(xiàn)miR-106a-5p在鼻咽癌細胞中的作用研究。本次實驗首先探討miR-106a-5p在鼻咽癌細胞和正常鼻咽上皮細胞中的表達差異，并初步研究下調(diào)miR-106a-5p對鼻咽癌細胞增殖、侵襲、遷移以及上皮間質(zhì)轉(zhuǎn)化（epithelial mesenchymal transition，EMT）的影響。

材料與方法

一、材料

鼻咽癌細胞CNE-2、HK1、SUNE2（中國醫(yī)學科學院腫瘤細胞庫）；正常鼻咽上皮細胞NP69（上海江林生物科技有限公司）；Lipofectamine2000（美國Invitrogen公司）；模擬物陰性對照劑、miR-106a 模擬物、陰性對照抑制劑和miR-106a抑制劑（百奧邁科生物技術(shù)有限公司）；PTEN 抗體（貨號10047-1-AP，美國Proteintech公司）；vimentin 抗體（貨號KF685，上海滬震生物科技有限公司）；E-cadherin 抗體（貨號10204-MM08-F，北京義翹神州科技有限公司）；GAPDH 抗體（貨號AG019，碧云天生物技術(shù)研究所）。

二、方法

1.Realtime PCR 方法測定miR-106a-5p在鼻咽癌細胞中的表達：收集鼻咽癌細胞CNE-2、HK1、SUNE2和正常鼻咽上皮細胞NP69，使用Trziol 方法分別提取細胞中的總RNA。提取的RNA 樣品使用紫外分光光度計測定濃度以及純度以后，分裝并保存在-80℃。按照試劑盒合成cDNA，cDNA 體系為：0.2 μL的MMLV Reverse Transcriptase、4 μL的5×RT Buffer、0.25 μL的Rnasin、1.25 μL的miR-RT Primers、1 μL的RNA Sample，添加RNase Free H2O至20 μL。cDNA 合成條件為：16℃ 30 min，42℃90 min，72℃ 5 min。取cDNA 樣品，根據(jù)如下體系進行PCR反應：2.5 μL的cDNA、5 μL的2×Realtime PCR Master Mix、0.2 μL的上下游引物，最后補足ddH2O 至10 μL。PCR反應程序設置為：95℃ 15 s，60℃ 15 s，72℃ 20 s，一共設置40個循環(huán)。根據(jù)PCR反應過程中的CT值對miR-106a-5p表達水平進行半定量分析，采用2-△△CT法，內(nèi)參為U6。實驗重復3次，每次3個平行樣，取平均值。（表1）

表1 引物序列信息

2.細胞轉(zhuǎn)染和下調(diào)效果檢測：在鼻咽癌細胞SUNE2中分別轉(zhuǎn)染轉(zhuǎn)染陰性對照抑制劑和miR-106a-5p抑制劑，并依次命名為Anti-NC和Anti-miR-106a-5p，設置沒有轉(zhuǎn)染的細胞為對照組，細胞轉(zhuǎn)染試劑用Lipofectamine2000。于細胞轉(zhuǎn)染之后的48 h，收集各組細胞，用Realtime PCR 方法檢測下調(diào)效果，步驟同上。實驗重復3次，每次3個平行樣，取平均值。

3.MTT檢測下調(diào)miR-106a-5p對鼻咽癌細胞增殖影響：將鼻咽癌細胞SUNE2 接種到96孔板，每個孔中按照3 000個細胞接種，細胞分成對照組、Anti-NC組、Anti-miR-106a-5p組，每組3個復孔，培養(yǎng)48 h，把培養(yǎng)板取出，依次在每個孔中添加5 mg/mL的MTT 溶液，然后放在37℃孵育結(jié)合4 h，最后把孔內(nèi)的液體吸棄，再加入DMSO 溶液各150 μL，孵育反應10 min，以酶標儀檢測每個孔的OD值，測定波長設置為470 nm。

4.Transwell 小室方法分別檢測下調(diào)miR-106a-5p后的鼻咽癌細胞侵襲以及遷移能力變化：侵襲以及遷移實驗均用8 μm的Transwell 小室進行檢測。侵襲實驗前以基質(zhì)膠包被小室，其余步驟均相同。檢測步驟為：以不含血清的培養(yǎng)液將對照組、Anti-NC組以及Anti-miR-106a-5p組細胞配制成濃度為5×105個/mL的懸浮液，依次吸取100 μL 添加到上室，繼續(xù)放在37℃結(jié)合反應48 h。4﹪多聚甲醛固定，0.1﹪結(jié)晶紫染色。選擇5個視野分別統(tǒng)計細胞侵襲以及遷移數(shù)目。

5.Western blot檢測下調(diào)miR-106a-5p對鼻咽癌細胞中vimentin、E-cadherin、PTEN 蛋白表達影響：取培養(yǎng)48 h 以后的對照組、Anti-NC組、Anti-miR-106a-5p組細胞，提取細胞蛋白。蛋白在SDS-PAGE電泳以前用Loading Buffer 煮沸變性。40 μg 蛋白上樣量。常規(guī)方法進行SDS-PAGE 電泳，觀察電泳結(jié)束之后，把凝膠取出。轉(zhuǎn)膜放在冰上操作，電流設置為250 mA，轉(zhuǎn)膜進行60 min。取出PVDF 膜，置于封閉液（含有5﹪牛血清白蛋白的TBST 溶液）中于室溫結(jié)合反應2 h。然后將PVDF 膜置于一抗稀釋液，在4℃過夜反應。最后把PVDF 膜放在1:3 000稀釋之后的二抗反應液內(nèi)，放在室溫條件下結(jié)合孵育1.5 h。采用ECL 方法顯色，使用軟件Image J 統(tǒng)計分析蛋白灰度值，內(nèi)參為GAPDH，對目的蛋白進行半定量分析。實驗重復3次，每次3個平行樣，取平均值。

6.miR-106a-5p 靶基因預測和鑒定：在線靶基因預測軟件（targetscan）發(fā)現(xiàn)miR-106a-5p 同PTEN的3，UTR 端有互補結(jié)合位點，使用熒光素酶報告系統(tǒng)鑒定靶向關(guān)系。將構(gòu)建好的PTEN野生型（WT）熒光素酶報告載體和PTEN突變型（MUT）熒光素酶報告載體分別與模擬物陰性對照劑、miR-106a-5p 模擬物共轉(zhuǎn)染到鼻咽癌細胞SUNE2中，48 h 測定各組細胞熒光素酶活性。實驗重復3次，每次3個平行樣，取平均值。WT和MUT 熒光素酶報告載體分別為含有PTEN的3，UTR 端結(jié)合位點和含有突變之后的PTEN的3，UTR 端結(jié)合位點的pmir GLO 載體，載體由吉滿生物科技（上海）有限公司構(gòu)建。

7.PTENsiRNA 轉(zhuǎn)染以后的下調(diào)miR-106a-5p鼻咽癌細胞增殖和侵襲遷移以及EMT檢測：在鼻咽癌細胞SUNE2中分別共轉(zhuǎn)染miR-106a-5p抑制劑、siRNA 陰性對照和miR-106a-5p抑制劑、PTENsiRNA，命名為Anti-miR-106a-5p+si-NC組、AntimiR-106a-5p+si-PTEN組，參照上述MTT 方法、Transwell 小室方法、Western blot分別測定各組細胞增殖和侵襲遷移以及細胞中vimentin、E-cadherin、PTEN蛋白表達。實驗重復3次，每次3個平行樣，取平均值。

三、統(tǒng)計學分析方法

采用SPSS21.0 軟件進行統(tǒng)計學分析，鼻咽癌細胞CNE-2、HK1、SUNE2和正常鼻咽上皮細胞NP69中miR-106a-5p水平以及鼻咽癌細胞SUNE2中miR-106a-5p水平、OD值、侵襲數(shù)目、遷移數(shù)目、熒光素酶活性和vimentin、E-cadherin、PTEN 蛋白水平以±s表示，兩組間比較用獨立樣本t檢驗，多組間比較采用單因素方差分析，組間兩兩比較采用LSD-t檢驗。以P＜ 0.05為差異有統(tǒng)計學意義。

結(jié) 果

一、鼻咽癌細胞中miR-106a-5p的表達水平高于正常鼻咽上皮細胞

與正常鼻咽上皮細胞NP69比較，鼻咽癌細胞CNE-2、HK1、SUNE2中miR-106a-5p升高，差異具有統(tǒng)計學意義（P＜ 0.05，表2），且鼻咽癌細胞SUNE2中miR-106a-5p表達水平高于鼻咽癌細胞CNE-2、HK1，因此，選用表達水平最高的鼻咽癌細胞SUNE2 做后續(xù)實驗。

表2 鼻咽癌細胞和正常鼻咽上皮細胞中miR-106a-5p表達水平（±s，n= 3）

表2 鼻咽癌細胞和正常鼻咽上皮細胞中miR-106a-5p表達水平（±s，n= 3）

注：與NP69比較，aP＜ 0.05；與CNE-2比較，bP＜ 0.05；與HK1比較，cP＜ 0.05；n為實驗重復次數(shù)

細胞 miR-106a-5p NP69 1.00±0.11 CNE-2 1.84±0.13a HK1 2.19±0.14a SUNE2 2.87±0.25abc F值 196.158 P值 ＜0.001

二、miR-106a-5p抑制劑下調(diào)鼻咽癌細胞中miR-106a-5p表達水平

與對照組、Anti-NC組比較，Anti-miR-106a-5p組細胞中miR-106a-5p表達水平下降，差異有統(tǒng)計學意義（P＜ 0.05，表3），而對照組與Anti-NC組之間miR-106a-5p表達差異無統(tǒng)計學意義。

表3 miR-106a-5p抑制劑轉(zhuǎn)染后鼻咽癌細胞中miR-106a-5p水平（±s，n= 3）

表3 miR-106a-5p抑制劑轉(zhuǎn)染后鼻咽癌細胞中miR-106a-5p水平（±s，n= 3）

注：與對照組比較，aP＜ 0.05；與Anti-NC組比較，bP＜ 0.05；n為實驗重復次數(shù)

分組 miR-106a-5p對照組 1.00±0.10 Anti-NC組 0.99±0.12 Anti-miR-106a-5p組 0.31±0.05ab F值 157.015 P值 ＜ 0.001

三、下調(diào)miR-106a-5p對鼻咽癌細胞增殖、侵襲、遷移和EMT影響

與對照組、Anti-NC組比較，Anti-miR-106a-5p組鼻咽癌細胞miR-106a-5p水平、OD值、細胞侵襲數(shù)遷移數(shù)和vimentin蛋白表達水平降低，E-cadherin蛋白表達水平升高，差異具有統(tǒng)計學意義（P均＜0.05，圖1～2、表4）。

四、miR-106a-5p 靶向調(diào)控PTEN

在線靶基因預測軟件發(fā)現(xiàn)miR-106a-5p與PTEN的3'UTR 端有結(jié)合位點（圖3）；經(jīng)熒光素酶系統(tǒng)鑒定二者為靶向調(diào)控關(guān)系（表5）；與對照組、Anti-NC組比較，Anti-miR-106a-5p組細胞中PTEN蛋白表達水平升高，差異有統(tǒng)計學意義（P＜ 0.05，表6、圖4）。

五、PTEN siRNA可逆轉(zhuǎn)下調(diào)miR-106a-5p對鼻咽癌細胞增殖、侵襲、遷移和EMT影響

與Anti-miR-106a-5p-inhibitor +si-NC組比較，Anti-miR-106a-5p-inhibitor+si-PTEN組細胞OD值、侵襲數(shù)目遷移數(shù)目vimentin蛋白表達均升高，E-cadherin蛋白表達降低，差異具有統(tǒng)計學意義（P＜ 0.05，圖5、表7）。PTENsiRNA可逆轉(zhuǎn)下調(diào)miR-106a-5p對鼻咽癌細胞增殖、侵襲、遷移和EMT影響。

表4 miR-106a抑制劑轉(zhuǎn)染后鼻咽癌細胞OD值、侵襲數(shù)目、遷移數(shù)目和vimentin、E-cadherin蛋白水平（±s，n= 3）

表4 miR-106a抑制劑轉(zhuǎn)染后鼻咽癌細胞OD值、侵襲數(shù)目、遷移數(shù)目和vimentin、E-cadherin蛋白水平（±s，n= 3）

注：與對照組比較，aP＜ 0.05；與Anti-NC組比較，bP＜ 0.05；n為實驗重復次數(shù)

分組 OD值 侵襲數(shù)目（個）遷移數(shù)目（個）vimentin E-cadherin對照組 0.56±0.05 128.47±11.65 182.51±14.81 0.84±0.09 0.29±0.04 Anti-NC組 0.57±0.04 129.84±10.93 180.68±17.64 0.82±0.07 0.28±0.05 Anti-miR-106a-5p組 0.32±0.02ab 85.12±6.75ab 122.01±11.62ab 0.30±0.05ab 0.76±0.08ab F值 120.200 58.070 48.046 163.277 193.457 P值 ＜ 0.001 ＜ 0.001 ＜ 0.001 ＜ 0.001 ＜ 0.001

圖1 倒置顯微鏡下觀察Transwell 小室檢測miR-106a抑制劑轉(zhuǎn)染后鼻咽癌細胞侵襲和遷移結(jié)果（結(jié)晶紫染色，×200）

圖2 Western blot檢測miR-106a抑制劑轉(zhuǎn)染后鼻咽癌細胞中vimentin、E-cadherin蛋白水平

圖3 miR-106a與PTEN的3'UTR 端結(jié)合位點

圖4 Western blot檢測miR-106a抑制劑轉(zhuǎn)染后鼻咽癌細胞中PTEN 蛋白水平

表5 熒光素酶活性（±s，n= 3）

表5 熒光素酶活性（±s，n= 3）

注：n為實驗重復次數(shù)

分組 MUT WT mimics control 1.00±0.10 1.00±0.12 miR-106a mimics 1.01±0.12 0.46±0.05 t值 0.192 12.462 P值 0.850 ＜ 0.001

表6 miR-106a抑制劑轉(zhuǎn)染后鼻咽癌細胞中PTEN 蛋白水平（±s，n= 3）

表6 miR-106a抑制劑轉(zhuǎn)染后鼻咽癌細胞中PTEN 蛋白水平（±s，n= 3）

注：與對照組比較，aP＜ 0.05；與Anti-NC組比較，bP＜ 0.05；n為實驗重復次數(shù)

分組 PTEN對照組 0.36±0.05 Anti-NC組 0.37±0.04 Anti-miR-106a-5p組 0.69±0.06ab F值 123.546 P值 ＜ 0.001

討 論

本實驗顯示，鼻咽癌細胞中的miR-106a-5p表達水平升高，而抑制miR-106a-5p 能夠抑制鼻咽癌細胞生長，說明miR-106a-5p可能具有促鼻咽癌惡性進展作用，抑制miR-106a-5p可能是抑制鼻咽癌進展的途徑之一。miR-106a-5p是目前發(fā)現(xiàn)的與腫瘤有關(guān)的非編碼RNA之一，其具有多種生物學作用，在不同的腫瘤中發(fā)揮的作用可能不同[10]。研究顯示，miR-106a-5p在非小細胞肺癌等多數(shù)腫瘤中高表達，下調(diào)miR-106a-5p后的腫瘤細胞增殖能力明顯下降[11]。miR-106a-5p在口腔鱗狀細胞癌等腫瘤中低表達，上調(diào)miR-106a-5p表達能夠抑制腫瘤惡性增殖和EMT[12]。

表7 miR-106a-5p抑制劑和PTEN siRNA 轉(zhuǎn)染后鼻咽癌細胞OD值、侵襲數(shù)目、遷移數(shù)目和vimentin、E-cadherin、PTEN 蛋白水平（±s，n= 3）

表7 miR-106a-5p抑制劑和PTEN siRNA 轉(zhuǎn)染后鼻咽癌細胞OD值、侵襲數(shù)目、遷移數(shù)目和vimentin、E-cadherin、PTEN 蛋白水平（±s，n= 3）

注：n為實驗重復次數(shù)

分組 OD值 侵襲數(shù)目（個）遷移數(shù)目（個）vimentin E-cadherin PTEN Anti-miR-106a-5p-inhibitor +si-NC組 0.33±0.03 84.16±5.91 118.42±10.25 0.34±0.06 0.72±0.06 0.67±0.08 Anti-miR-106a-5p-inhibitor +si-PTEN組 0.52±0.05 105.79±8.63 164.28±12.05 0.68±0.05 0.29±0.05 0.35±0.06 t值 9.775 6.204 8.697 13.060 16.517 9.600 P值 ＜ 0.001 ＜ 0.001 ＜ 0.001 ＜ 0.001 ＜ 0.001 ＜ 0.001

圖5 Western blot檢測miR-106a-5p抑制劑和PTEN siRNA轉(zhuǎn)染后鼻咽癌細胞中vimentin、E-cadherin、PTEN 蛋白水平

腫瘤轉(zhuǎn)移是一個復雜過程，腫瘤細胞從原發(fā)病灶脫落，進入血管或淋巴管，通過體液循環(huán)到達新的組織器官，通過細胞惡性增殖形成新的病發(fā)灶[13]。腫瘤細胞侵襲和遷移能力的高低是腫瘤轉(zhuǎn)移能力大小的標志[14]。EMT 過程中，上皮細胞特性明顯減弱，間質(zhì)細胞特性越來越明顯，發(fā)生EMT的腫瘤細胞轉(zhuǎn)移能力越強[15]。vimentin是間質(zhì)細胞標志蛋白，是一種Ⅲ型中間絲蛋白，其在腫瘤中表達上調(diào)，vimentin表達水平越高，細胞轉(zhuǎn)移能力越強；E-cadherin是上皮細胞標志蛋白，其在腫瘤中表達下調(diào)，E-cadherin表達水平越高，細胞轉(zhuǎn)移能力越弱[16]。本研究表明，miR-106a-5p抑制劑可以降低鼻咽癌細胞侵襲以及遷移水平，抑制vimentin蛋白表達，而促進E-cadherin蛋白表達，提示miR-106a-5p在鼻咽癌惡性轉(zhuǎn)移中發(fā)揮促進作用，miR-106a-5p抑制劑可抑制鼻咽癌細胞遷移和侵襲，抑制或延緩腫瘤的復發(fā)和轉(zhuǎn)移。

miRNA 作用機制與靶向調(diào)控不同的靶基因有密切關(guān)系[17-18]。為了探討miR-106a-5p 影響鼻咽癌細胞增殖、遷移和侵襲的作用機制，本研究通過生物信息學軟件預測顯示，PTEN的3'UTR含有與miR-106a-5p互補的核苷酸序列，提示PTEN可能是miR-106a-5p的靶基因。本研究通過雙熒光素酶實驗和Western blot 證實了miR-106a-5p在鼻咽癌細胞中靶向負調(diào)控PTEN。PTEN是目前公認的抗腫瘤進展基因，參與調(diào)控細胞的生長、遷移等過程[19-20]。研究表明，PTEN在鼻咽癌、肺癌、骨肉瘤等幾乎所有的惡性腫瘤中表達下調(diào)，上調(diào)PTEN可抑制腫瘤細胞的惡性生物學行為[21-23]。本實驗顯示，下調(diào)PTEN可以明顯逆轉(zhuǎn)miR-106a-5p抑制劑對鼻咽癌細胞生長和轉(zhuǎn)移潛能的影響，與相關(guān)研究報道結(jié)果一致[24]，提示miR-106a-5p抑制劑可以靶向調(diào)控PTEN的表達抑制鼻咽癌細胞的增殖、遷移和侵襲，miR-106a-5p/PTEN是鼻咽癌靶向分子治療的潛在靶點。

總之，靶向抑制miR-106a-5p表達可能是減緩鼻咽癌惡性進展和轉(zhuǎn)移的途徑，miR-106a-5p在鼻咽癌細胞中表達上調(diào)，miR-106a-5p抑制劑可以在體外抑制鼻咽癌細胞的增殖、侵襲、遷移和EMT，miR-106a-5p 作用機制與靶向調(diào)控PTEN的表達有關(guān)。實驗結(jié)果為研究miR-106a-5p在腫瘤進展中調(diào)控機制和作用提供了參考，為靶向基因治療鼻咽癌提供了新思路。在以后的實驗中會在多株鼻咽癌細胞中進行驗證，并且會對其具體的網(wǎng)絡調(diào)控機制進行探討。