孫小紅 李婕 劉瓊 袁鑫

蘭州市婦幼保健院，甘肅 蘭州730000

耳聾（又稱聽力障礙）為不同程度的聽力損失，其作為感官障礙之一，在臨床上比較常見，在世界人口中的發(fā)病率大約為5%，全球患有該病的兒童超過3200萬名，其中發(fā)病率最高的為發(fā)展中國家［1]。在各種因素中，遺傳因素高達50%～60%［2]，如在遺傳性耳聾中，非綜合性遺傳性耳聾的唯一癥狀為聽力障礙，發(fā)生率大約為70%［3]。當前，這種類型的耳聾與97 個耳聾基因相關(guān)［4]。研究發(fā)現(xiàn)，4 個常見基因突變位點為GJB2、SLC26A4、mtDNA 和GJB3，覆蓋我國50%的耳聾人群，具有一定的篩查意義［5]。本研究對甘肅某特殊教育學(xué)校63例耳聾患者外周血4 個耳聾相關(guān)基因13 個突變位點篩查分析，報告如下。

1 資料與方法

1.1 一般資料 于2018 年3月至2019 年3月收集甘肅某特殊教育學(xué)校63例耳聾患者，其中男性40例，女性23例，年齡6～16 歲，平均（8.9±2.1）歲。按照國際聽力損失的標準分級（WHO-1997）［6]：重度聽力損失13例，極重度聽力損失50例。

1.2 納入與排除標準 納入標準：（1）全部患兒均確診為非綜合征性耳聾，診斷時需結(jié)合聽力損害情況、病史與各種影像學(xué)檢查結(jié)果；（2）簽訂知情同意書。排除標準：（1）除聽力損失外還合并有其他系統(tǒng)癥狀者；（2）綜合征型耳聾患者。

1.3 試劑與儀器 全血基因組提取試劑盒（潮州凱普生物化學(xué)有限公司），PCR-導(dǎo)流雜交法耳聾基因檢測試劑盒(離心柱型)、PCR 擴增儀ABI7300（自美國賽默飛世爾科技公司），醫(yī)用核酸分子快速雜交儀HHM-2、核酸分子雜交儀HB-2012A（廣東凱普生物科技股份有限公司），百泰克ND5000 超微量分光光度計（北京百泰克生物技術(shù)有限公司）。

1.4 方法

1.4.1 DNA分離提取。抽取受檢者2 mL 外周靜脈血，使用EDTA-K2 抗凝，取100μL 外周血，DNA 采用凱普全血基因組提取試劑盒（離心柱型）提取基因組，其純度的測定使用分光光度計，與OD 260/280=1.7～2.0相符，所選擇的模板為：取5 μL 抽提好的DNA 樣本，在開展PCR 擴增操作時嚴格根據(jù)說明書上的程序進行，設(shè)定擴增系數(shù)為25μL，在-20℃的冰箱中保存剩余DNA 樣品留作備用。

1.4.2 PCR 擴增與雜交。擴增完成后，按DNA 雜交試劑盒操作說明書，使用核酸分子雜交儀HB-2012A 完成耳聾相關(guān)基因檢測（導(dǎo)流雜交法）。

1.4.3 最終結(jié)果認定。顯色結(jié)束后，參照圖1 進行4 個耳聾基因的13 個致聾突變位點GJB2（35delG、176del16、235delC、299delAT、155delTCTG）、SLC26A4（IVS7-2A＞G、2168A＞G、1229C＞T）、12SrRNA（1494C＞T、1555A＞G）及GJB3（538C＞T）的判定。其中，Biotin 能夠?qū)φ麄€雜交過程進行科學(xué)的監(jiān)控，H 代表野生型檢測基因，M代表突變型檢測基因。見圖2。

2 結(jié)果

63例受檢的耳聾學(xué)生中突變攜帶者20例，檢出率為31.75%，其中14例GJB2 突變基因（23.8%），4例SLC26A4 突變基因（6.35%），2例mtDNA 突變基因檢出（3.17%），未GJB3 檢出基因突變。見表1。

圖1 檢測結(jié)果判讀參照圖

表1 甘肅某特殊教育學(xué)校63例聾基因突變各位點檢測結(jié)果（n=63）

3 討論

圖2 結(jié)果判讀圖

耳聾在臨床上比較常見，對人類的身體健康造成嚴重影響，該病可根據(jù)患者是否合并其他系統(tǒng)病變進行劃分類型。耳聾分子流行病學(xué)調(diào)查表明，大多數(shù)非綜合征型耳聾是由GJB2、SLC26A4、mtDNA 12S rRNA 和GJB3 基因的突變引起［7，8]。研究顯示，GJB2 基因突變在一定程度上會直接關(guān)系到遺傳性非綜合征性耳聾的發(fā)展［9]。GJB2 基因編碼間隙連接蛋白Connexin 26（Cx26）分子，Cx26分子主要在神經(jīng)傳導(dǎo)纖維和耳蝸的感覺上皮和基底細胞上分布，作為電解質(zhì)、第二信使的重要通道。非綜合征性遺傳耳聾影響離子的細胞內(nèi)外交換，進而影響聲音傳遞導(dǎo)致聽力損傷。有關(guān)GJB2 基因突變的類型共有150 多種，突變類型包括移碼突變、錯義突變和無義突變等。GJB2 基因突變存在種族和地域差異，其中235delC 是亞洲人群中最常見的GJB2 基因突變類型［10]。歐洲聽力損失人群中GJB2 基因比較常見的突變位點則為35delG［11]。SLC26A4 基因定位于的7 號染色體q31 位，所包含的外顯子共有21 個，能夠?qū)崿F(xiàn)對Pendrin 蛋白的有效編碼，這種蛋白能夠在內(nèi)耳內(nèi)淋巴管、內(nèi)淋巴囊及Corti 器外溝細胞表達出來，Pendrin 作為氯離子轉(zhuǎn)運體能夠?qū)?nèi)耳內(nèi)淋巴離子平衡進行有效調(diào)節(jié)。SLC26A4 基因突變在中國人群中最常見的突變位點是IVS7-2A＞G，韓國和日本最常見突變是2168A＞G［11]。本研究耳聾患者檢測出SLC26A4基因突變者4例，占6.35%，居所檢測突變基因的第二位。線粒體突變屬母系遺傳，人類mtDNA 編碼13 種多肽和rRNAs2 個和線粒體翻譯所需的tRNA 22 個。研究表明，由mtDNA 12S rRNA 突變所引起的遺傳性耳聾發(fā)生率大約為20%，其中mtDNA 12S rRNA 1555A＞G 位點突變在中國藥物性耳聾為最常見的突變位點，該位點因其位于核糖體小亞基氨酰-tRNA 受體位點，導(dǎo)致其對氨基糖苷類藥物極為敏感，為有效預(yù)防耳聾，應(yīng)要求攜帶有該基因突變位點的人群禁服氨基糖苷類藥物［12-13]。本研究耳聾患者檢測出mtDNA 12S rRNA 1555A＞G 基因均質(zhì)突變者2例，突變率3.17%。GJB3則是我國最早發(fā)現(xiàn)的與耳聾相關(guān)的基因［14]，此突變常造成常染色體顯性遺傳或隱性遺傳的非綜合征型耳聾的可能性較大。但本研究未檢測到GJB3 基因的相關(guān)突變，可能與樣本量小及檢測位點少有關(guān)。

本研究重點檢測與分析了63例耳聾患者外周血4 個耳聾相關(guān)基因GJB2、SLC26A4、mtDNA 12S rRNA和GJB3 及13 個突變熱點，檢出率為31.75%。耳聾基因檢測結(jié)果表明，針對該特殊教育學(xué)校非綜合征性耳聾患者，GJB2 是引起他們聽力損失的主要突變基因，其次為SLC26A4，GJB2 耳聾基因檢測意義較大。在聽力損失人群中進行耳聾基因檢測，有利于幫助遺傳性耳聾患者找到相關(guān)致病原因，為聽力損失患者在癥狀初期確定診斷、防止由聾致啞、患者及其家族成員提供遺傳咨詢和指導(dǎo)，并為減少出生缺陷提供理論依據(jù)。