黃小鳳，韋陽連*，余金昌，陶 旭，胡桂兵

(1.東莞植物園，廣東 東莞523086；2.華南農(nóng)業(yè)大學 園藝學院，廣東 廣州510642)

東莞是著名的荔枝之鄉(xiāng)，荔枝種植歷史悠久，其氣候、水土非常適合荔枝生長，積累了豐富的荔枝種質資源，2000～2018年我國審(認)定了40個荔枝新品種，其中‘觀音綠’、‘冰荔’、‘唐夏紅’、‘嶺豐糯’、‘紅繡球’等優(yōu)良新品種均選育自東莞[1-6]。本課題組經(jīng)調查走訪，在東莞的各鎮(zhèn)街還發(fā)現(xiàn)一些民間流傳的優(yōu)質荔枝種質，如寮步鎮(zhèn)的‘白油麻’、茶山鎮(zhèn)的‘紫囊’、中堂的‘奉沖大造’、南城區(qū)的‘大紅帽’等。在對荔枝資源進行性狀調查過程中，發(fā)現(xiàn)來自東莞市茶山鎮(zhèn)南社村的‘紫囊’與來自東莞市大朗鎮(zhèn)水平村的‘紅繡球’(‘紅繡球’是廣東省農(nóng)作物品種審定委員會2003年審定的優(yōu)良品種)的果實性狀很相似，猜測可能為同一荔枝種質。荔枝種質同名異物或同物異名的現(xiàn)象，易造成生產(chǎn)和科研上混亂，為澄清荔枝種質命名混亂和重復現(xiàn)象，便于荔枝種質資源管理，通過對‘紫囊’和‘紅繡球’進行來源考證、引種觀察及SNP分子標記分析，鑒定兩者是否為同物異名。

1 材料與方法

1.1 試驗材料

‘紫囊’來源于廣東省東莞市茶山鎮(zhèn)南社村，是記載始于明代的傳統(tǒng)名優(yōu)荔枝種質；‘紅繡球’來源于東莞市大朗鎮(zhèn)水平村。

1.2 來源考證

采用查閱文獻和實地走訪的方式進行。

1.3 引種觀察

2016年3月，以樹齡30年‘糯米糍’大樹為砧木，通過高接換種的方式，將‘紫囊’和‘紅繡球’的接穗嫁接到東莞植物園的荔枝園，每份種質各嫁接5株。待其成活進入正常生長期后，每份種質選擇3株進行物候期及果實性狀的觀測、比較。

1.4 SNP分子標記

1.4.1 DNA準備

將‘紫囊’和‘紅繡球’的葉片研磨后，用實驗室改良的CTAB小樣法提取DNA，使用瓊脂糖電泳以及核酸蛋白(Nanodrop ND-2000)測定儀測定DNA濃度與純度等數(shù)據(jù)后，DNA稀釋到一定倍數(shù)用于進行SNP標記分析。

1.4.2 SNP分析

20對分型穩(wěn)定、多態(tài)性高的SNP引物(表1)參考Liu等[7]；SNP分型采用高分辨率溶解曲線技術(High resolution melting，HRM)，HRM分型引物的設計、HRM檢測及數(shù)據(jù)分析參考孫清明等[8]。

表1 本研究所用SNP引物信息

2 結果分析

2.1 種質來源的比較

2014年，本課題組在查閱文獻進行東莞本地荔枝資源挖掘時發(fā)現(xiàn)，明末清初廣東著名的學者、詩人屈大均所著《喜謝九丈莞中見過之作》詩云“紫囊一樹人爭食，明歲招予作白猿”[9]，此詩描述的是屈大均到東莞市茶山鎮(zhèn)南社村吃過謝九丈【注：謝九丈即謝重華(1598～1679)，南社鄉(xiāng)農(nóng)、詩人，明遺民】培育的‘紫囊’后，極贊‘紫囊’荔枝的搶手，感嘆到：明年若能品嘗紫囊，請先招呼，我寧可到南社當白猿，也要上樹摘吃。茶山鎮(zhèn)南社族譜有《樟崗記》載：“黃梅紫荔，錯落爭榮”，明確提出，‘紫囊’原來盛產(chǎn)于南社村的樟崗嶺，歷來與黃梅爭榮斗艷。由此可見，‘紫囊’迄今至少有300多年的栽培歷史，在東莞市茶山鎮(zhèn)曾經(jīng)栽培極為興盛。后經(jīng)實地走訪屈大均詩中描述的主人翁謝重華的后人謝進球先生得知，他的祖輩曾在金頭墓(南社一地方土名)種植‘紫囊’，前些年因山地征用這些荔枝樹要被砍，村民認為該荔枝品種品質優(yōu)良應保其后代，故取其芽條嫁接，種植在狗屎嶺(南社另一地方土名)，現(xiàn)僅剩此一株。但最早種植的‘紫囊’從何地引進謝家已無法考究。

根據(jù)《荔枝新品種紅繡球的選育》[1]一文記錄，‘紅繡球’是廣東省農(nóng)業(yè)科學院果樹研究所的技術人員1997年在東莞市大朗鎮(zhèn)水平村發(fā)現(xiàn)的荔枝種質，當?shù)剞r(nóng)民認為該品種核小、成熟期與大種‘糯米糍’相近，誤認為是‘糯米糍’，但經(jīng)過調查分析，認為該品種性狀與‘糯米糍’沒有相似之處，不是‘糯米糍’。后經(jīng)AFLP鑒定，確認‘紅繡球’AFLP指紋圖譜存在特征帶，未發(fā)現(xiàn)與該品種同名異物、同物異名的特征帶，認定‘紅繡球’為新品種，并于2003年通過廣東省農(nóng)作物品種審定委員會審定。

對比‘紫囊’和‘紅繡球’的發(fā)現(xiàn)史可知，‘紅繡球’于1997年發(fā)現(xiàn)，2003年通過品種審定，而‘紫囊’雖至少有300多年的栽培歷史，卻于2014年才被挖掘出來，即‘紅繡球’在進行AFLP鑒定時，并未與‘紫囊’進行比較。

2.2 引種表現(xiàn)

2.2.1 植物學特性

高接3年后，‘紫囊’和‘紅繡球’的植物學特征基本一致。樹冠呈半圓形，樹高 3.5～4.0 m，冠幅 3.5 m ×3.5 m，接穗平均粗度6 cm，表皮呈灰褐色。羽狀復葉，對生，4～6片小葉，葉片披針形或長披針形，墨綠色，中等大小， 長8～12cm，寬2.5～3.5 cm，尖端漸尖，主側脈明顯，花序中等，雌花柱頭2裂。

2.2.2 物候期

自2017年1月至2019年12月，連續(xù)三年對‘紫囊’和‘紅繡球’進行物候期觀察發(fā)現(xiàn)，兩者的物候期基本一致。 每年可抽生3～4批新梢。白點期1月下旬，抽穗期2月中旬，初花期3月下旬，盛花期4月上旬，謝花期4月中旬，落果主要集中在 5月上旬，果實著色期6月上中旬，果實成熟期7月上旬。

2.2.3 果實特征

2019年6月，即高接后第三年， 在‘紫囊’和‘紅繡球’的結果樹中各自隨機選擇3株的果實進行果實特征觀測，結果表明‘紫囊’和‘紅繡球’的果形、果皮顏色、龜裂片特征、種子外觀、口感、風味等特征一致。經(jīng)對二者果實的單果大小、單果重、可溶性固形物、可食率等進行比較發(fā)現(xiàn)，‘紫囊’的果實單果重、橫徑、側徑、果皮重、國核重、果肉重等略小于‘紅繡球’，但它們的果實縱徑、可溶性固形物和可食率基本一致。方差分析顯示，‘紫囊’和‘紅繡球’的果實特征指標之間無顯著差異(表2)。

表2 ‘紫囊’和‘紅繡球’的果實特征比較

2.3 ‘紫囊’與‘紅繡球’的SNP分型結果

HRM分型結果表明，在20對特異性位點上，‘紫囊’荔枝與‘紅繡球’荔枝的分型結果一致(表3)，表明兩份材料在這20對特異性引物上所表現(xiàn)出的基因型完全一致。

表3 ‘紫囊’與‘紅繡球’的20對SNP位點分型

3 討論與結論

來源考證顯示，‘紫囊’與‘紅繡球’分別來源于東莞市的茶山鎮(zhèn)南社村和大朗鎮(zhèn)水平村，兩地相距約30 km?！夏摇怯涊d始于明代，發(fā)現(xiàn)于2014年，在當?shù)貎H存一株的傳統(tǒng)荔枝種質；‘紅繡球’是在大朗及周邊鎮(zhèn)、村都有種植，發(fā)現(xiàn)于1997年，審定于2003年的荔枝新品種。文獻考證和走訪調查都無法判斷‘紫囊’與‘紅繡球’在茶山鎮(zhèn)和大朗鎮(zhèn)之間有無相互傳播的可能，可確定的是‘紅繡球’在進行AFLP分子鑒定時，并未與‘紫囊’進行比對。兩者引種后所表現(xiàn)的植物學特征、物候期及果實性狀基本一致，兩者果實的形狀、果皮顏色、龜裂片特征、口感、風味等特征一致，不同的是‘紫囊’的果實略小于‘紅繡球’的果實，但差異不顯著。傳統(tǒng)植物分類學認為，綠色開花植物分類的主要依據(jù)是花、果實和種子，‘紫囊’與‘紅繡球’的枝、葉、花、果實、種子性狀基本一致，在性狀鑒別層面上可將二者視為同一植物種類。

荔枝品種歸類主要依靠形態(tài)學特征，而表型可受環(huán)境影響，同一基因型在不同地區(qū)可能產(chǎn)生不同的表型，有些表型差異甚至很大，以至于給人新品種的誤判[10]。隨著分子生物學技術的不斷發(fā)展與技術成熟，分子標記已逐漸成為果樹品種資源的鑒定與親緣關系的探究的不可缺少的技術手段之一。單核苷酸多態(tài)性標記(SNP)是同一個物種不同個體間染色體上遺傳密碼單個堿基的轉換、顛換以及單堿基的插入或缺失等，主要表現(xiàn)為基因組核苷酸水平上的變異引起的DNA序列多態(tài)性[11]。SNP標記是目前為止分布較為廣泛、應用較多的一種標記方法，在遺傳上高度穩(wěn)定，具有二等位性，非此即彼，在基因組篩選中只需+/-的分析，而不用分析片段的長度即可判定，易于自動化分型。由于具備上述的優(yōu)勢，SNP標記已愈來愈成為品種鑒定的重要技術手段[12-15]。近年新審定荔枝品種‘御金球’及‘燎原’等即應用了SNP標記這一技術手段[8,16]。為進一步驗證‘紫囊’與‘紅繡球’是否為同一種質，利用20對SNP引物對‘紫囊’與‘紅繡球’進行分子標記研究，結果顯示它們在20對特異性引物上所表現(xiàn)出的基因型完全一致，即在分子水平上證實‘紫囊’與‘紅繡球’為同一種質。

綜合引種觀察和SNP標記研究結果，可以判定記載始于明代的東莞傳統(tǒng)名荔‘紫囊’與當前栽培的‘紅繡球’為同一荔枝種質，兩者屬同物異名。