吳崇樂，黃 勝*，顏冬蘭，胡麗彬，羅菲菲，葉惠煊

(1.九芝堂股份有限公司，湖南 長沙 410205；2.湖南省中藥固體制劑工程技術(shù)研究中心，湖南 長沙 410205；3.中藥驗方湖南省工程研究中心，湖南 長沙 410205)

隨著中藥質(zhì)量控制技術(shù)的發(fā)展，許多化學(xué)藥品的質(zhì)量控制理念與方法在中藥質(zhì)量控制中得到逐步應(yīng)用，如溶出度方法已逐漸應(yīng)用于中藥篩選制劑處方與工藝和內(nèi)在質(zhì)量評價[1-2]。但溶出度在中藥丸劑的研究和應(yīng)用較少，2015版《中國藥典》四部通則中，丸劑項僅規(guī)定了溶散時限的控制指標(biāo)[3]。從臨床用藥情況分析，現(xiàn)行的溶散時限檢查不能全部反映體內(nèi)的吸收和藥效情況，而溶出度試驗更能反映體內(nèi)藥物的吸收情況。

六味地黃丸是傳統(tǒng)中醫(yī)滋陰補腎的經(jīng)典名方，始見于宋代錢乙的《小兒藥證直訣》，由熟地黃、酒萸肉、牡丹皮、山藥、茯苓、澤瀉六味中藥材組成，主治腎陰虧損、頭暈耳鳴、腰膝酸軟、骨蒸潮熱、盜汗遺精、消渴等證[4]。目前，對六味地黃丸質(zhì)量評價如指紋圖譜研究的報道較多[5-8]，但僅有少數(shù)關(guān)于六味地黃丸溶出度的報道研究，且主要集中在對丹皮酚單一成分或者丹皮酚、馬錢苷2種成分的溶出度進行評價[9-15]。

本實驗建立以馬錢苷、莫諾苷和丹皮酚為指標(biāo)成分的溶出度測定方法，同時測定六味地黃丸馬錢苷、莫諾苷和丹皮酚的體外溶出度，為六味地黃丸的質(zhì)量控制和評價提供依據(jù)。

1 儀器與試藥

1.1 儀器

ZRS-8LD智能溶出試驗儀(天津市天大天發(fā)科技有限公司)；BS2202S電子天平(賽多利斯科儀器(北京)有限公司)；KQ-700DV型數(shù)控超聲波清洗器(昆山市超聲儀器有限公司)；Waters 2695-2998液相色譜儀(美國沃特斯公司)。

1.2 試劑與藥品

六味地黃丸：濃縮丸(廠家1，批號201903046；廠家2，批號19073262)。丹皮酚對照品(中國食品藥品檢定研究院，批號110708-201407)。馬錢苷對照品(中國食品藥品檢定研究院，批號111640-201707)。莫諾苷對照品(中國食品藥品檢定研究院，批號111998-201602)。其他試劑均為分析純。

2 方法與結(jié)果

2.1 色譜條件

參照《中國藥典》2015版六味地黃丸濃縮丸含量測定方法。

2.2 溶液制備

2.2.1 對照品溶液制備 分別精密稱取莫諾苷對照品10.35 mg、馬錢苷對照品10.31 mg和丹皮酚對照品20.25 mg，加入50%甲醇50 mL，溶解，搖勻，配制成每1 mL中含莫諾苷、馬錢苷、丹皮酚分別為0.207 mg/mL、0.206 2 mg/mL、0.405 mg/mL的混合溶液，即得。并稀釋至刻度，搖勻即得對照品儲備液。

2.2.2 供試品溶液制備 參照《中國藥典》2015版四部0931(第二法)溶出測定法，以脫氣處理的pH=1.2鹽酸-氯化鈉溶液500 mL為溶出介質(zhì)，溫度保持在(37±0.5)℃，轉(zhuǎn)速100 r·min-1，取供試品6份，每份約10 g，分別投入6個溶出杯內(nèi)，立即啟動旋轉(zhuǎn)并開始計時，在規(guī)定時間點吸取溶液5 mL(每次取樣結(jié)束補充同溫同體積的釋放介質(zhì))，上清液經(jīng)0.45 μm微孔濾膜濾過，取續(xù)濾液，即得供試品溶液。

2.3 線性關(guān)系考察

分別精密吸取1 mL、3 mL、5 mL、7 mL、9 mL對照品儲備液置于10 mL量瓶中，加甲醇溶解并稀釋至刻度，進樣10 μL，測定峰面積。以峰面積Y為縱坐標(biāo)，質(zhì)量濃度X為橫坐標(biāo)進行線性回歸，得回歸方程及相關(guān)系數(shù)見表1。結(jié)果表明莫諾苷在3.519～31.671 μg/mL，馬錢苷在4.005～36.045 μg/mL，丹皮酚在12.5～112.5 μg/mL范圍內(nèi)有良好的線性關(guān)系。

表1 對照品溶液線性關(guān)系考察結(jié)果

2.4 精密度試驗

取丹皮酚、馬錢苷、莫諾苷混合標(biāo)準(zhǔn)溶液連續(xù)進樣6次，每次10 μL。結(jié)果莫諾苷的RSD為0.48%，馬錢苷的RSD為0.65%，丹皮酚的RSD為0.43%。

2.5 穩(wěn)定性試驗

取溶出時間為4 h的六味地黃丸的溶出液于0 h、1 h、2 h、4 h、8 h、12 h進樣測定。結(jié)果莫諾苷的RSD為3.52%，馬錢苷的RSD為3.89%，丹皮酚的RSD為4.26%。表明供試品溶液在12 h內(nèi)基本穩(wěn)定。

2.6 重復(fù)性試驗

取同一批供試品 (批號：201903046)，按“2.2.2”項下方法平行制備6份，并進行含量測定，記錄峰面積，分別計算莫諾苷、馬錢苷和丹皮酚的含量，其含量測定結(jié)果的RSD值分別為0.95%、1.23%和1.58%。

2.7 加樣回收率試驗

精密稱定已知含有量的六味地黃丸粉6份，分別精密稱定加入丹皮酚、馬錢苷、莫諾苷對照品，分別置于50 mL量瓶中，加甲醇充分溶解并稀釋至刻度，過濾，取續(xù)濾液1 mL加甲醇稀釋至10 mL，混勻，取10 μL進樣，測定峰面積，根據(jù)回歸方程計算馬錢苷、莫諾苷、丹皮酚的量及回收率，結(jié)果表明回收率良好。見表 2。

表2 加樣回收率試驗結(jié)果 (n=6)

2.8 溶出度的測定

按“2.2.2”項下操作，分別于5 min、15 min、30 min、45 min、60 min、90 min、2 h、4 h取樣5 mL，用0.45 μm微孔濾膜濾過，隨即補充等量的溶出介質(zhì)，取續(xù)濾液10 μL進樣。按照“2.1”項下色譜條件測定峰面積，求算藥物質(zhì)量濃度并換算成不同時間的累積溶出百分率，取平均值。結(jié)果見表3。

表3 不同廠家六味地黃丸濃縮丸多指標(biāo)的累積溶出度 (n=6)

繪制溶出曲線。以表3中平均累積溶出度(%)為縱坐標(biāo)，時間為橫坐標(biāo)(min)繪制溶出曲線。不同廠家六味地黃丸濃縮丸中莫諾苷、馬錢苷、丹皮酚的溶出曲線分別見圖1、圖2、圖3。

圖1 六味地黃丸濃縮丸中莫諾苷的溶出曲線

圖2 六味地黃丸濃縮丸中馬錢苷的溶出曲線

圖3 六味地黃丸濃縮丸中丹皮酚的溶出曲線

2.9 相似度評價

采用相似因子法進行分析[16]，比較2個廠家六味地黃丸濃縮丸的溶出度。

以廠1濃縮丸(批號：201903046)作為參比制劑，根據(jù)上述公式計算各溶出指標(biāo)的f2值，結(jié)果見表6。莫諾苷、馬錢苷、丹皮酚的相似因子均大于75，表明不同廠家六味地黃丸濃縮丸中莫諾苷、馬錢苷和丹皮酚的溶出行為相似。

表6 六味地黃丸濃縮丸多指標(biāo)相似因子

3 討論

根據(jù)累積溶出度計算公式，累計溶出度理論最大值應(yīng)為100%。本次試驗計算不同廠家六味地黃丸濃縮丸中莫諾苷、馬錢苷的累積溶出度均存在超過100%，其中莫諾苷達到250%以上。研究[17]表明，當(dāng)溶液pH=1～4時，莫諾苷、馬錢苷的含量均呈增加趨勢，pH=1～2時，呈明顯增加趨勢。本次試驗選用的溶出介質(zhì)為pH=1.2，推測酒萸肉中含有多種莫諾苷衍生物在酸性條件下轉(zhuǎn)化為莫諾苷。此外，在給藥劑量范圍內(nèi)，莫諾苷衍生物在酸性條件下轉(zhuǎn)化為莫諾苷，對人體安全無害。

溶出時間的確定。張啟明等[17-18]認(rèn)為，在酸性介質(zhì)(pH =1. 0～3. 0)中的最長測定時間建議為2 h，在前期的預(yù)實驗中，發(fā)現(xiàn)隨著時間的增加，溶出率相應(yīng)增加，4 h時溶出曲線趨于平穩(wěn)，6 h溶出率與4h溶出率差值僅為1%。因此，本實驗溶出時間設(shè)定為4 h。

本實驗采用f2相似因子法評價不同廠家六味地黃丸指標(biāo)成分的釋放規(guī)律，結(jié)果表明，3個指標(biāo)成分的f2均大于70，說明不同廠家制劑之間釋藥行為相似，但溶出曲線趨勢略有差異，可能與不同廠家在制劑過程中的工藝參數(shù)、設(shè)備差異有關(guān)。

本實驗選擇與胃液酸性接近的pH=1.2的鹽酸-氯化鈉溶液作為溶出介質(zhì)，參照2015版《中國藥典》六味地黃丸的含量檢測指標(biāo)考察六味地黃丸濃縮丸的溶出度變化，但在此環(huán)境下，酒萸肉中的多種莫諾苷衍生物轉(zhuǎn)化后為莫諾苷，不能較好地評價莫諾苷的釋放度。因此，建議選擇六味地黃丸中其他具有代表性的、在該環(huán)境下穩(wěn)定的活性成分作為考察指標(biāo)。