， ， ，，子?xùn)|，2b，2c， ，

（1.東北林業(yè)大學(xué) a.化學(xué)化工與資源利用學(xué)院；b.森林植物生態(tài)學(xué)教育部重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室；c.林業(yè)生物制劑教育部工程研究中心，黑龍江 哈爾濱 150040；2.黑龍江中醫(yī)藥大學(xué) a.附屬第二醫(yī)院南院，黑龍江 哈爾濱 150060；b.教育部北藥基礎(chǔ)與應(yīng)用研究重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，黑龍江 哈爾濱 150040；c.黑龍江省中藥及天然藥物藥效物質(zhì)基礎(chǔ)研究重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，黑龍江 哈爾濱 150040）

杜仲Eucommia ulmoides為杜仲科杜仲屬植物，是我國(guó)特有的植物[1]。杜仲具有較高的經(jīng)濟(jì)價(jià)值，為我國(guó)二級(jí)保護(hù)植物。在保健功能方面，杜仲具有舒張血管、降血壓[2]、強(qiáng)筋壯骨、治療腰膝酸痛和腿足拘攣等作用[3]，這與其含有多種功能性成分有著密不可分的關(guān)系，然而不同樹齡和不同部位中的化學(xué)成分及其含量并不完全一致[4]，導(dǎo)致其活性功能的強(qiáng)度不一致。傳統(tǒng)中藥是以杜仲皮為原料，并且約20年生杜仲的干皮才可入藥[5]，但是，剝皮會(huì)導(dǎo)致樹木死亡[6]，嚴(yán)重破壞杜仲資源。為解決當(dāng)前面臨的杜仲可持續(xù)開發(fā)利用問題，了解杜仲中多種功能性成分與其樹齡和部位之間的關(guān)系、開發(fā)杜仲其他部位顯得極為重要。

據(jù)目前國(guó)內(nèi)外對(duì)杜仲化學(xué)成分的相關(guān)研究報(bào)道可知，杜仲干皮、枝皮和葉中的相同化學(xué)成分含量相差較大[7-13]，如松脂醇二葡萄苷為杜仲主要降壓成分，其在干皮中的含量約為0.55%，明顯高于其他部位[14]；綠原酸具有較強(qiáng)的殺菌消炎功能，并有類腎上腺素的作用，在杜仲各部位均有存在，但在葉中的含量比其他部位高，可達(dá)2.5%，約為同期采集的杜仲干皮中含量的2 倍[15-16]；京尼平苷酸具有降血壓和調(diào)節(jié)血壓的功效，杜仲葉中的含量約為1.5%，而枝皮中的含量可高達(dá)6.71%[17]。杜仲功能性成分的相關(guān)研究主要停留在含量測(cè)定方面，鮮見從整體角度闡明多種化學(xué)成分與杜仲樹齡和部位之間的相關(guān)性。張子?xùn)|等[18]采用高效液相色譜法（HPLC）對(duì)杜仲中5 種苯丙素類成分同時(shí)測(cè)定，但未能建立杜仲中其余多種主要化學(xué)成分的HPLC 測(cè)定方法，也未能闡明杜仲樹齡與活性成分含量的相關(guān)性。為給杜仲采收期和采收部位的確定提供理論參考，本試驗(yàn)中分別測(cè)定不同樹齡杜仲的干皮、枝皮和葉中17 種主要化學(xué)成分的含量，探討這些化學(xué)成分與樹齡和部位之間的相關(guān)性。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

杜仲樣品采于陜西省漢中市略陽縣國(guó)家杜仲良種基地，樣株樹齡分別為16、17、18、19、20、21、22、23、24、25 a，分別采集各樹齡杜仲的葉、枝皮和干皮。

標(biāo)準(zhǔn)品：紫丁香苷（純度≥98%）、綠原酸（純度≥98%）、咖啡酸（純度＞98%）、蘆?。兌取?8%）、桃葉珊瑚苷（純度≥98%）、原兒茶酸（純度＞98%）、松脂醇二葡萄糖苷（純度＞98%）、京尼平（純度≥98%）、京尼平苷（純度≥98%）、京尼平苷酸（純度≥98%）、山奈酚（純度≥98%）購(gòu)自中國(guó)藥品生物制品檢定所，槲皮素（純度≥98%）、松柏苷（純度≥98%）購(gòu)自上海源葉生物科技有限公司，橄欖樹脂素（純度≥97%）購(gòu)自云南西力生物技術(shù)股份有限公司，紫云英苷（純度＞98%）、金絲桃苷（純度＞98%）、丁香樹脂醇二葡萄糖苷（純度＞98%）購(gòu)自大連美侖生物技術(shù)有限公司。

試驗(yàn)用乙腈為色譜純，試驗(yàn)用水為去離子水。其他試劑均為分析純，購(gòu)自天津科密歐化工試劑有限公司。變色酸、濃硫酸、冰醋酸、對(duì)二甲氨基苯甲醛、亞硝酸鈉、氫氧化鈉和硝酸鋁購(gòu)自天津市致遠(yuǎn)化學(xué)試劑有限公司。

1.2 儀器與設(shè)備

LC-20A HPLC 儀（包括SPD-20A 紫外檢測(cè)器）購(gòu)自日本島津公司，紫外分光光度計(jì)購(gòu)自上海美譜達(dá)儀器有限公司，RE 52-99 旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)器購(gòu)自上海亞榮生化儀器廠，KQ2200D 型數(shù)控超聲波清洗器購(gòu)自昆山市超聲儀器有限公司，BS124S 電子天平（1/10 000）和PB-10 酸度計(jì)購(gòu)自德國(guó)Sartorius公司，電熱恒溫水浴鍋購(gòu)自天津泰斯特儀器有限公司，DFT-50 手提式高速萬能粉碎機(jī)（50 g）購(gòu)自溫嶺市林大機(jī)械有限公司，KQ2200DE 型數(shù)控超聲波清洗器購(gòu)自昆山市超聲儀器有限公司，Unique-LCR20 多功能超純水系統(tǒng)購(gòu)自廈門銳思捷水純化技術(shù)有限公司。

1.3 杜仲中4 類化合物含量的測(cè)定

1.3.1 總木脂素含量的測(cè)定

用天平精密稱取松脂醇二葡萄糖苷標(biāo)準(zhǔn)品3.5 mg，用無水甲醇溶解后，定容于10 mL 容量瓶中，配制成質(zhì)量濃度為0.35 g/L 的標(biāo)準(zhǔn)品溶液。精密吸取標(biāo)準(zhǔn)品溶液0、0.2、0.4、0.6、0.8、1.0、1.2 mL 于10 mL 具塞試管中，在通風(fēng)櫥中60 ℃水浴加熱，揮干溶媒。每管依次加入10%變色酸0.5 mL、濃硫酸3 mL、蒸餾水1.5 mL，搖勻。沸水浴中加熱反應(yīng)30 min，迅速冷卻。以空白溶液為對(duì)照，于570 nm 處測(cè)吸光度（平行3 次）[19]。以標(biāo)準(zhǔn)品質(zhì)量濃度為橫坐標(biāo)（x），峰面積為縱坐標(biāo)（y），繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線，得到回歸方程y=7.619 3x-0.029 0，相關(guān)系數(shù)R2=0.999 8，線性范圍0.140 0%～0.560 0%。

將30 種杜仲樣品分別用粉碎機(jī)制成粉末，精密稱取各杜仲樣品1.0 g（平行3 份），每份樣品中加入無水甲醇溶液，料液比為1∶10，超聲提取30 min，過濾。濾液保留，剩余殘?jiān)俅渭訜o水甲醇溶液，料液比為1∶10，超聲提取30 min，過濾。合并2 次濾液，得供試品溶液，備用。分別準(zhǔn)確吸取各供試樣品溶液0.6 mL 于具塞試管中，按其標(biāo)準(zhǔn)品吸光度測(cè)定方法測(cè)定吸光度，根據(jù)標(biāo)準(zhǔn)曲線計(jì)算總木脂素在各樣品中的含量。

1.3.2 總環(huán)烯醚萜類含量的測(cè)定

用天平精密稱取桃葉珊瑚苷標(biāo)準(zhǔn)品5.1 mg，用無水甲醇溶解后，定容于5 mL 容量瓶中，配制成質(zhì)量濃度為1.02 g/L 的標(biāo)準(zhǔn)品溶液。精密吸取標(biāo)準(zhǔn)品溶液0、0.1、0.2、0.4、0.6、0.8、1.0 mL 于10 mL 容量瓶中，依次精密加入2 mL 乙醇溶液、1 mL 醋酸、1 mL 對(duì)二甲氨基苯甲醛溶液，再用蒸餾水定容至刻度，搖勻，于80 ℃水浴加熱進(jìn)行反應(yīng)30 min，冷卻一段時(shí)間后，以75%乙醇溶液為空白對(duì)照，在604 nm 處測(cè)定吸光度（平行3 次）[20]。以標(biāo)準(zhǔn)品質(zhì)量濃度為橫坐標(biāo)（x），峰面積為縱坐標(biāo)（y），繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線，得到回歸方程y=1.670 7x+0.049 4，R2=0.996 9，線性范圍0.006 8～0.108 8 g/L。

供試品溶液的制備同1.3.1。分別準(zhǔn)確吸取各供試樣品溶液0.6 mL 于10 mL 容量瓶中，按其標(biāo)準(zhǔn)品吸光度測(cè)定方法測(cè)定吸光度，根據(jù)標(biāo)準(zhǔn)曲線計(jì)算總環(huán)烯醚萜類在各樣品中的含量。

1.3.3 總苯丙素類含量的測(cè)定

用天平精密稱取綠原酸標(biāo)準(zhǔn)品1.7 mg，置入25 mL 容量瓶中，加入無水甲醇使其完全溶解后定容至刻度，搖勻。精密吸取綠原酸標(biāo)準(zhǔn)品溶液1.0 mL 于25 mL 容量瓶中，加入無水甲醇溶解稀釋至刻度，搖勻，配制成質(zhì)量濃度為0.005 g/L 的綠原酸標(biāo)準(zhǔn)品溶液。吸取標(biāo)準(zhǔn)品溶液0、1.0、2.0、3.0、4.0、5.0、6.0 mL 于10 mL 具塞試管中，依次加無水甲醇定容至刻度，以空白溶劑組為對(duì)照，分別在330 nm 處測(cè)定吸光度（平行3 次）[21-22]。以標(biāo)準(zhǔn)品質(zhì)量濃度為橫坐標(biāo)（x），峰面積為縱坐標(biāo)（y），繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線，得到回歸方程y=37.237 0x+0.016 4，R2=0.999 3，線性范圍0.002 8～0.081 6 g/L。

供試品溶液的制備同1.3.1。分別準(zhǔn)確吸取各供試樣品溶液1.0 mL 于10 mL 具塞試管中，按其標(biāo)準(zhǔn)品吸光度測(cè)定方法測(cè)定吸光度，根據(jù)標(biāo)準(zhǔn)曲線計(jì)算總苯丙素類在各樣品中的含量。

1.3.4 總黃酮類含量的測(cè)定

用天平精密稱取蘆丁標(biāo)準(zhǔn)品10 mg，置于50 mL 容量瓶中，加入60%乙醇溶液充分溶解，搖勻，得質(zhì)量濃度為0.2 g/L 的蘆丁標(biāo)準(zhǔn)品溶液。分別精密吸取標(biāo)準(zhǔn)品溶液0、1.0、2.0、3.0、4.0、5.0 mL 于10 mL 具塞試管中，分別精確加入5%的亞硝酸鈉溶液0.3 mL，搖勻，靜置6 min，分別加入10%的硝酸鋁溶液0.3 mL，搖勻，靜置6 min，分別加入1 mol/L NaOH 溶液4 mL，再分別用30%的乙醇溶液稀釋至刻度，搖勻，靜置15 min，以空白溶劑為對(duì)照，于510 nm 處測(cè)定吸光度（平行3 次）[23]。以標(biāo)準(zhǔn)品質(zhì)量濃度為橫坐標(biāo)（x），峰面積為縱坐標(biāo)（y），繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線，得到回歸方程y=7.898 0x-0.005 1，R2=0.999 6，線性范圍0.001 9 ～0.080 0 g/L。

供試品溶液的制備同1.3.1。分別準(zhǔn)確吸取各供試樣品溶液1.0 mL 于10 mL 具塞試管中，按其標(biāo)準(zhǔn)品吸光度測(cè)定方法測(cè)定吸光度，按照標(biāo)準(zhǔn)曲線計(jì)算總黃酮類在各樣品中的含量。

1.4 杜仲中4 類化合物具體活性成分的測(cè)定

1.4.1 木脂素類、環(huán)烯醚萜類、苯丙素類化合物中活性成分含量的測(cè)定

采用HPLC 變波長(zhǎng)-梯度洗脫法，同時(shí)測(cè)定杜仲中12 種活性成分（木脂素類、環(huán)烯醚萜類、苯丙素類）的含量。

1.4.1.1 標(biāo)準(zhǔn)品溶液的制備

精密稱取適量松脂醇二葡萄糖苷、丁香樹脂醇二葡萄糖苷、橄欖樹脂素、京尼平、京尼平苷、京尼平苷酸、桃葉珊瑚苷、綠原酸、咖啡酸、紫丁香苷、松柏苷、原兒茶酸標(biāo)準(zhǔn)品，用甲醇溶解、定容，配制成1 g/L 的混合標(biāo)準(zhǔn)品溶液，于4 ℃冰箱中保存?zhèn)溆肹17-18]。

1.4.1.2 供試品溶液的制備

分別精確稱取粉碎后的杜仲樣品粉末1.0 g，每份樣品中加入無水甲醇溶液，超聲提取30 min，料液比為1∶10，過濾。保留濾液，殘?jiān)脽o水甲醇再次超聲提取30 min，料液比為1∶10，過濾。將2 次的濾液合并，混勻。分別吸取1 mL 各樣品的合并濾液，12 000 r/min 離心10 min，取上清液。

1.4.1.3 HPLC 色譜條件

色譜條件：HiQ Sil C18 色譜柱（250 mm×4.6 mm，5 μm），柱溫25 ℃，進(jìn)樣量5 μL，流動(dòng)相流速1.0 mL/min，檢測(cè)波長(zhǎng)208、277、240 nm。梯度洗脫條件見表1。

表1 杜仲中木脂素類、環(huán)烯醚萜類和苯丙素類活性成分含量HPLC 分析梯度洗脫條件Table1 HPLC analysis gradient elution conditions of lignans,iridoids and phenylpropanoids in E.ulmoides

1.4.1.4 方法學(xué)考查

1）線性關(guān)系考查。分別精密吸取梯度質(zhì)量濃度范圍的標(biāo)準(zhǔn)品溶液進(jìn)行HPLC 測(cè)定，進(jìn)樣量為5 μL，測(cè)定峰面積（平行測(cè)定3 次）。以進(jìn)樣質(zhì)量濃度x為橫坐標(biāo)，峰面積y為縱坐標(biāo)，繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線。

2）精密度試驗(yàn)。分別吸取標(biāo)準(zhǔn)品溶液進(jìn)行HPLC 測(cè)定，一天內(nèi)重復(fù)進(jìn)樣6 次，計(jì)算各標(biāo)準(zhǔn)品峰面積的相對(duì)標(biāo)準(zhǔn)偏差。

3）穩(wěn)定性試驗(yàn)。取杜仲樣品溶液，室溫放置48 h 內(nèi)不同時(shí)間進(jìn)樣，進(jìn)行HPLC 測(cè)定，計(jì)算各樣品中12 種有效成分峰面積的相對(duì)標(biāo)準(zhǔn)偏差。

4）重復(fù)性試驗(yàn)。取每種杜仲樣品各6 份，分別按1.4.1.2 中的方法制備供試品溶液，進(jìn)行HPLC 測(cè)定，計(jì)算12 種有效成分峰面積的相對(duì)標(biāo)準(zhǔn)偏差。

5）回收率試驗(yàn)。精密稱取每種杜仲樣品各3份，分別加入不同質(zhì)量濃度的標(biāo)準(zhǔn)品溶液后，按1.4.1.2中的方法制備待測(cè)溶液，分別進(jìn)樣后計(jì)算30 種杜仲樣品的平均回收率和相對(duì)標(biāo)準(zhǔn)偏差。

1.4.1.5 樣品含量的測(cè)定

對(duì)制備好的各杜仲樣品的12 種活性成分進(jìn)行HPLC 測(cè)定，計(jì)算樣品中12 種木脂素類、環(huán)烯醚萜類和苯丙素類化合物含量。

1.4.2 黃酮類化合物中活性成分含量的測(cè)定

1.4.2.1 標(biāo)準(zhǔn)品溶液的制備

精密稱取適量蘆丁、山奈酚、槲皮素、紫云英苷、金絲桃苷標(biāo)準(zhǔn)品，用甲醇溶解、定容，配制成1 g/L 的混合標(biāo)準(zhǔn)品溶液，于4 ℃冰箱中保存?zhèn)溆谩?/p>

1.4.2.2 供試品溶液的制備

同1.4.1.2。

1.4.2.3 色譜條件

色譜條件：HiQ Sil C18 色譜柱（250 mm×4.6 mm，5 μm），柱溫25 ℃，進(jìn)樣量5 μL，流動(dòng)相流速1.0 mL/min，檢測(cè)波長(zhǎng)360 nm。梯度洗脫條件見表2。

表2 杜仲中黃酮類活性成分含量HPLC 分析梯度洗脫條件Table2 The HPLC gradient elution condition of flavonoids in E.ulmoides

1.4.2.4 方法學(xué)考查

線性關(guān)系考查、精密度試驗(yàn)、穩(wěn)定性試驗(yàn)、重復(fù)性試驗(yàn)和回收率試驗(yàn)方法同1.4.1.4。

1.4.2.5 樣品含量的測(cè)定

對(duì)制備好的各杜仲樣品的5 種活性成分進(jìn)行HPLC 測(cè)定，計(jì)算樣品中5 種黃酮類化合物含量。

1.5 統(tǒng)計(jì)分析

應(yīng)用R Studio 3.4.4（Version 3.6）軟件對(duì)數(shù)據(jù)進(jìn)行編程及可視化處理[24]。

2 結(jié)果與分析

2.1 杜仲中4 類化合物的含量

不同年限不同部位杜仲樣品中總木脂素、總環(huán)烯醚萜、總苯丙素和總黃酮含量測(cè)定結(jié)果見表3。

表3 不同年限杜仲不同部位樣品中4 類化合物的含量Table3 The total contents of 4 compounds in different ages and parts of E.ulmoides

2.2 杜仲中17 種活性成分含量測(cè)定方法的建立

2.2.1 HPLC 色譜分析

木脂素類、環(huán)烯醚萜類、苯丙素類12 種活性成分混合標(biāo)準(zhǔn)品的HPLC 分析圖譜如圖1所示，供試品HPLC 分析圖譜及其局部放大圖譜如圖2所示。5 種黃酮類活性成分混合標(biāo)準(zhǔn)品與供試品中該類成分的HPLC 分析圖譜如圖3所示。

2.2.2 方法學(xué)考查結(jié)果

2.2.2.1 線性關(guān)系考查

根據(jù)線性關(guān)系考查方法，得到木脂素類、環(huán)烯醚萜類、苯丙素類和黃酮類17 種活性成分含量的回歸方程及相關(guān)系數(shù)（表4）。

圖1 木脂素類、環(huán)烯醚萜類和苯丙素類活性成分混合標(biāo)準(zhǔn)品的HPLC 色譜圖Fig.1 HPLC chromatography of mixed standard substances (A) with active compounds of lignans,iridoids and phenylpropanoids

圖2 杜仲樣品中木脂素類、環(huán)烯醚萜類和苯丙素類活性成分的HPLC 色譜圖Fig.2 HPLC chromatography of lignans,iridoids and phenylpropanoids in E.ulmoides

圖3 黃酮類活性成分混合標(biāo)準(zhǔn)品和杜仲樣品中該類成分的HPLC 色譜圖Fig.3 HPLC chromatographies of active flavonoids compounds in mixed standard substances and in E.ulmoides sample

表4 杜仲17 種活性成分含量的線性方程及相關(guān)系數(shù)Table4 The regression equation,correlation coefficients of 17 active ingredients in E.ulmoides

2.2.2.2 精密度試驗(yàn)

根據(jù)精密度試驗(yàn)考查方法，計(jì)算17 種標(biāo)準(zhǔn)品峰面積的相對(duì)標(biāo)準(zhǔn)偏差。結(jié)果表明：松脂醇二葡萄糖苷、丁香樹脂醇二葡萄糖苷、橄欖樹脂素、桃葉珊瑚苷、京尼平、京尼平苷、京尼平苷酸、綠原酸、咖啡酸、紫丁香苷、松柏苷、原兒茶酸、蘆丁、山奈酚、槲皮素、紫云英苷、金絲桃苷面積的相對(duì)標(biāo)準(zhǔn)偏差分別為2.56%、1.33%、3.76%、2.12%、4.02%、1.54%、2.77%、2.43%、0.98%、0.99%、1.55%、0.78%、3.78%、2.12%、1.27%、3.65%、1.33%，表明儀器精密度良好。

2.2.2.3 穩(wěn)定性試驗(yàn)

根據(jù)穩(wěn)定性試驗(yàn)考查方法，計(jì)算各樣品中17種有效成分峰面積的相對(duì)標(biāo)準(zhǔn)偏差。結(jié)果表明：松脂醇二葡萄糖苷、丁香樹脂醇二葡萄糖苷、橄欖樹脂素、桃葉珊瑚苷、京尼平、京尼平苷、京尼平苷酸、綠原酸、咖啡酸、紫丁香苷、松柏苷、原兒茶酸、蘆丁、山奈酚、槲皮素、紫云英苷、金絲桃苷峰面積的相對(duì)標(biāo)準(zhǔn)偏差分別為2.32%、1.56%、2.02%、3.58%、1.87%、2.61%、1.91%、2.35%、0.98%、1.66%、1.15%、0.77%、1.97%、3.5%、2.11%、0.97%、1.63%，表明供試品溶液中17 種成分在該試驗(yàn)條件下48 h 內(nèi)較為穩(wěn)定。

2.2.2.4 重復(fù)性試驗(yàn)

根據(jù)重復(fù)性試驗(yàn)考查方法，計(jì)算17 種有效成分峰面積的相對(duì)標(biāo)準(zhǔn)偏差。結(jié)果表明：松脂醇二葡萄糖苷、丁香樹脂醇二葡萄糖苷、橄欖樹脂素、桃葉珊瑚苷、京尼平、京尼平苷、京尼平苷酸、綠原酸、咖啡酸、紫丁香苷、松柏苷、原兒茶酸、蘆丁、山奈酚、槲皮素、紫云英苷、金絲桃苷峰面積的RSD 分別為3.74%、2.81%、3.09%、1.68%、3.19%、4.11%、2.94%、1.44%、0.67%、1.12%、0.97%、0.53%、2.65%、1.87%、2.95%、2.86%、4.54%，表明該方法重復(fù)性良好。

2.2.2.5 回收率試驗(yàn)

根據(jù)回收率試驗(yàn)考查方法，計(jì)算30 種杜仲樣品中17 種物質(zhì)的平均回收率和相對(duì)標(biāo)準(zhǔn)偏差，結(jié)果見表5。由表5可知，各物質(zhì)加樣回收率良好。

表5 杜仲中17 種活性成分回收率試驗(yàn)結(jié)果Table5 Test results of recovery rate of 17 active ingredients in E.ulmoides %

2.3 杜仲中主要活性成分含量與其樹齡和部位的相關(guān)性

2.3.1 杜仲樣品中4 類化合物含量與其樹齡和部位的相關(guān)性

已有的研究報(bào)道表明，杜仲中4 類化合物含量會(huì)隨著采收期的不同而變化[25]，并且其在不同部位的含量也不同[26]。結(jié)合30 種杜仲樣品中總木脂素、總環(huán)烯醚萜、總苯丙素和總黃酮的含量，應(yīng)用R Studio 3.4.4 軟件中的hclust 函數(shù)進(jìn)行聚類分析及Complex Heatmap 可視化處理，結(jié)果如圖4所示。

由圖4可知，使用最長(zhǎng)距離法可以將試驗(yàn)樣品分成6 類。結(jié)合統(tǒng)計(jì)數(shù)據(jù)的基本分析結(jié)果來看，第1 類為樣品16-Y 和18-Y，這2 個(gè)樣品中的苯丙素類與黃酮類化合物含量明顯高于其他樣品，環(huán)烯醚萜類化合物含量也較高；第2 類為樣品17-Y和21-Y，二者的環(huán)烯醚萜類化合物含量明顯高于其他樣品，且黃酮類與苯丙素類含量較高；第3類為樣品20-Y 和25-Y，其木脂素類、黃酮類、苯丙素類化合物含量均較高，環(huán)烯醚萜類含量較低；第4 類為樣品24-Y、19-Y、19-Z 和19-G，該組樣品中的有效成分總含量相似，但總體上苯丙素類含量較高；第5 類為樣品16-G、17-G、18-G、17-Z 和18-Z，這組樣品中的環(huán)烯醚萜類化合物含量較高，木脂素類化合物含量低于其他樣品；第6 類為樣品23-Z、20-Z、20-G、22-Y、23-Y、24-Z、25-Z、16-Z、22-Z、22-G、24-G、25-G、21-Z、21-G 和23-G，該組樣品中木脂素含量整體較高。第6 類中的第1 組子分類為樣品24-Z、25-Z、16-Z、22-Z、22-G、24-G、25-G、21-Z、21-G 和23-G，這組樣品中的木脂素類含量明顯高于其他化合物成分的含量；第2 組子分類為樣品22-Y 和23-Y，這組樣品中的木脂素類成分和黃酮類成分含量均較高。

圖4 根據(jù)4 類化合物的含量不同樹齡杜仲不同部位樣品的聚類結(jié)果Fig.4 Cluster heatmap of different tree ages and parts set with 4 total compounds in E.ulmoides

就杜仲的部位而言，杜仲葉的黃酮類成分和苯丙素類成分含量最高，環(huán)烯醚萜類成分含量次之；杜仲枝皮主要含有木脂素類成分；杜仲干皮的木脂素類化合物含量普遍較高，少數(shù)木脂素類成分含量低的干皮樣品中，環(huán)烯醚萜類成分含量較高。對(duì)不同部位4 類化合物含量進(jìn)行獨(dú)立樣本ANOVA 函數(shù)分析，結(jié)果顯示不同部位的木脂素類、苯丙素類、黃酮類含量存在顯著差異（P＜0.000 1），分析結(jié)果具有統(tǒng)計(jì)學(xué)上的意義。

就杜仲的樹齡而言，隨著樹齡的增加，杜仲葉的黃酮類成分和苯丙素類成分含量呈減少趨勢(shì)，其木脂素類成分含量呈增加趨勢(shì)，25年生杜仲葉的木脂素含量最高；杜仲枝皮和干皮的木脂素類成分含量呈增長(zhǎng)趨勢(shì)。對(duì)不同樹齡樣品的4 類化合物含量進(jìn)行獨(dú)立樣本ANOVA 函數(shù)分析，結(jié)果顯示不同樹齡樣品的木脂素類、苯丙素類和黃酮類成分含量存在顯著差異（P＜0.001），分析結(jié)果具有統(tǒng)計(jì)學(xué)上的意義。

2.3.2 杜仲樣品中17 種活性成分含量與其樹齡和部位的相關(guān)性

對(duì)不同樹齡杜仲不同部位樣品的17 種有效成分含量進(jìn)行聚類熱圖分析，結(jié)果如圖5所示。由圖5可見，17 種活性成分可分成6 類。第1 類為槲皮素和蘆丁，含量較高的樣品為22-Y、23-Y、25-Y、18-Z 和18-G。第2 類為山奈酚、綠原酸、金絲桃苷、紫云英苷和松柏苷，含量較高的樣品分別為16-Y、17-Y、18-Y、20-Y、22-Y、24-Y 和25-Y，其子分類松柏苷含量較高的樣品為18-Y、24-Y、25-Y、16-Z 和18-Z。第3 類為京尼平苷酸、桃葉珊瑚苷和咖啡酸，含量較高的樣品為21-Y、21-Z、23-Z 和24-Z。第4 類為松脂醇二葡萄糖苷、京尼平苷和原兒茶酸，含量較高的樣品為17-Z、22-Z、23-Z、24-Z 和25-Z。第5類為丁香樹脂醇二葡萄糖苷和橄欖樹脂素，含量較高的樣品為22-Z、23-Z、25-Z 和25-G，且25-G 中丁香樹脂醇二葡萄糖苷含量極高。第6類為京尼平和紫丁香苷，含量較高的樣品為16-Z、18-Z 和20-Z，其中紫丁香苷含量較高的樣品還有16-Y、18-Y 和20-Y。

圖5 根據(jù)17 種活性成分的含量不同樹齡杜仲不同部位樣品的聚類結(jié)果Fig.5 The cluster heatmap of different tree ages and parts set with 17 active compounds in E.ulmoides

由圖5可見，不同樹齡杜仲不同部位樣品可分為4 大類。其中，第2 類中樣品16-Y、17-Y、18-Y、20-Y 和25-Y 與第1 類中樣品22-Y 和23-Y的松脂醇二葡萄糖苷和京尼平含量極低，山奈酚、綠原酸、金絲桃苷和紫云英苷含量較高。樣品24-Y 被單獨(dú)分為第3 類，其松柏苷、京尼平苷酸、桃葉珊瑚苷和京尼平苷含量均較高，咖啡酸與原兒茶酸含量極高。第4 類的子分類中樣品18-Z、19-Z、20-Z、16-G、17-G、20-G、21-G、22-G、23-G、24-G 和25-G 的松脂醇二葡萄糖苷和京尼平含量均較高。

根據(jù)聚類分析結(jié)果，利用R 語言單因素ANOVA 函數(shù)進(jìn)行數(shù)據(jù)分析。結(jié)果表明，就杜仲樹齡而言，在杜仲不同部位中原兒茶酸含量隨樹齡的增加呈增加趨勢(shì)（P＜0.05）；就杜仲部位而言，紫丁香苷在杜仲葉和枝皮中含量較高（P＜0.05），京尼平在杜仲枝皮中含量較高（P＜0.01），松柏苷和綠原酸在杜仲葉中含量較高（分別為P＜0.05和P＜0.001），咖啡酸在杜仲葉和枝皮中含量均較高，橄欖樹脂素在杜仲枝皮和干皮中含量較高（P＜0.05），金絲桃苷在杜仲葉中含量極高（P＜0.05）。由圖5可見，黃酮類化合物蘆丁、槲皮素、山奈酚、紫云英苷、金絲桃苷在杜仲葉中含量較高；木脂素類化合物松脂醇二葡萄糖苷、丁香樹脂醇二葡萄糖苷和橄欖素脂素在杜仲枝皮和干皮中含量較高；苯丙素類化合物松柏苷和綠原酸在杜仲葉中含量較高。

3 結(jié)論與討論

應(yīng)用分光光度法測(cè)定不同樹齡杜仲不同部位樣品中總木脂素類、總環(huán)烯醚萜類、總苯丙素類和總黃酮類成分的含量，并應(yīng)用R 語言中聚類熱圖分析各種活性化合物與杜仲部位和樹齡之間的關(guān)系，得出以下結(jié)論：黃酮類、木脂素類和苯丙素類成分的含量與杜仲的部位有關(guān)，黃酮類和苯丙素類成分的含量與杜仲的樹齡有關(guān)。杜仲葉中黃酮類和苯丙素類成分含量最高，環(huán)烯醚萜類成分含量次之；杜仲枝皮中主要含有木脂素類成分；杜仲干皮中木脂素類化合物含量普遍較高，且木脂素類化合物含量隨杜仲樹齡的增加而增加；杜仲葉中黃酮類和苯丙素類化合物含量隨著杜仲樹齡的增加呈減少趨勢(shì)。

建立了同時(shí)測(cè)定松脂醇二葡萄糖苷、丁香樹脂醇二葡萄糖苷、橄欖樹脂素、桃葉珊瑚苷、京尼平、京尼平苷、京尼平苷酸、綠原酸、咖啡酸、紫丁香苷、松柏苷和原兒茶酸含量的變波長(zhǎng)-梯度洗脫HPLC 法；建立了同時(shí)測(cè)定蘆丁、槲皮素、山奈酚、紫云英苷和金絲桃苷含量的HPLC 法。這2 種含量測(cè)定方法的考查結(jié)果良好，可以用來測(cè)定杜仲中17 種活性成分的含量。利用R 語言中的聚類熱圖分析函數(shù)，將杜仲活性成分含量數(shù)據(jù)可視化，并進(jìn)行聚類分析，進(jìn)一步將數(shù)據(jù)分類歸納，最終得出結(jié)論：原兒茶酸含量與杜仲的樹齡有關(guān)；紫丁香苷、京尼平、松柏苷、綠原酸、咖啡酸、橄欖樹脂素和金絲桃苷的含量與杜仲的部位有關(guān)。原兒茶酸在杜仲不同部位中的含量隨樹齡的增加呈增加趨勢(shì)；紫丁香苷在杜仲葉和枝皮中含量較高；京尼平在杜仲枝皮中含量較高；松柏苷和綠原酸在杜仲葉中含量較高；金絲桃苷在杜仲葉中含量極高；咖啡酸在杜仲葉和枝皮中含量均較高；橄欖樹脂素在杜仲枝皮中含量較高。試驗(yàn)結(jié)果均具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義，并且根據(jù)聚類熱圖中單體活性成分含量趨勢(shì)與根據(jù)4 類化合物成分含量趨勢(shì)分析所得結(jié)論相符。

李洪果等[27]通過微觀水平分析發(fā)現(xiàn)，杜仲群體的遺傳多樣性較高，杜仲群體間的遺傳分化水平低、相似程度高，杜仲的遺傳變異以群體內(nèi)變異為主，所研究的9 對(duì)基因組會(huì)影響杜仲的生長(zhǎng)狀態(tài)，而不同生長(zhǎng)狀態(tài)杜仲中的活性成分含量不同。楊勇智等[28]對(duì)杜仲中齡林進(jìn)行間伐試驗(yàn)，并對(duì)其合理經(jīng)營(yíng)密度進(jìn)行調(diào)查研究，結(jié)果表明杜仲林分密度會(huì)對(duì)其胸徑、樹高、冠幅和樹皮等產(chǎn)生影響。本試驗(yàn)中僅對(duì)杜仲不同部位和樹齡樣品的活性成分含量進(jìn)行了分析，而實(shí)際上基因組和生長(zhǎng)密度均會(huì)影響杜仲的生長(zhǎng)，進(jìn)而影響杜仲中活性成分含量，下一步可以考慮研究杜仲的活性成分含量與基因組和生長(zhǎng)密度的相關(guān)性。