吳曉斐，何源，黃治平，張丹丹，鄭宏艷，丁健

（農(nóng)業(yè)農(nóng)村部環(huán)境保護(hù)科研監(jiān)測所，天津300191）

據(jù)《2018年中國水資源公報(bào)》[1]顯示，2018年我國年用水總量為6 015.5億m3，其中農(nóng)業(yè)年用水總量占61.4%，隨著淡水資源的短缺以及人們環(huán)保意識的提高，大家開始尋找其他途徑以減少農(nóng)業(yè)淡水用量。因生活污水中含有大量的氮磷等植物生長所必需的營養(yǎng)元素而使得污水灌溉進(jìn)入大眾視野，特別是農(nóng)村廁所革命后，經(jīng)三格化糞池、三聯(lián)式沼氣池和雙甕漏斗式等處理系統(tǒng)產(chǎn)生的生活污水，其含重金屬等有害物質(zhì)極少[2]，利用此類污水進(jìn)行灌溉不僅可以緩解用水壓力，還可減少農(nóng)業(yè)中化肥的使用量，降低經(jīng)濟(jì)成本及其對環(huán)境的污染。在生態(tài)系統(tǒng)中，土壤微生物在物質(zhì)循環(huán)和能量流動中占有重要地位，微生物的生物活性以及種群組成能夠反映土壤肥力及土壤質(zhì)量，當(dāng)微生物多樣性指數(shù)提高時，土壤綜合肥力指數(shù)隨之呈現(xiàn)不同形式的上升趨勢[3-4]，且土壤微生物還可以預(yù)警生態(tài)系統(tǒng)的變化[5]。土壤酶參與了土壤中的腐殖質(zhì)合成分解、有機(jī)物的水解和轉(zhuǎn)化以及各種氧化還原反應(yīng)等，土壤理化性質(zhì)的變化以及水肥管理措施、耕作措施、種植條件等，都會對土壤酶活性產(chǎn)生影響，研究表明土壤脲酶、蔗糖酶和磷酸酶與土壤養(yǎng)分具有顯著正相關(guān)關(guān)系[6-7]，因而土壤酶活性是土壤肥力的指示指標(biāo)之一[8-9]。正是因?yàn)橥寥牢⑸锖兔富钚詫ν寥婪柿Φ闹甘咀饔?，所以肥料的施用會對微生物豐富度、多樣性及群落結(jié)構(gòu)和土壤酶活性產(chǎn)生影響[10-11]。研究認(rèn)為肥料的合理施用對土壤微生物群落結(jié)構(gòu)和土壤酶活性具有積極的影響，Guo等[12]利用小麥-大豆輪作系統(tǒng)研究不同肥料組合對土壤微生物群落結(jié)構(gòu)的影響，結(jié)果表明牛糞促進(jìn)了Deltaproteobacteria和Bacteroidetes的相對豐度；劉佳歡等[13]發(fā)現(xiàn)適量施用肥料對土壤微生物數(shù)量和土壤酶活性具有顯著促進(jìn)作用；但研究發(fā)現(xiàn)在使用再生水灌溉時減少氮肥的使用量更有利于土壤微生物多樣性的增加[10]。

農(nóng)村地區(qū)因存在村民居住分散、污水收集管道建設(shè)不完善、缺乏資金支持和后續(xù)的技術(shù)管理人員等問題，所以在污水合理利用、降低生活污水處理成本及保護(hù)環(huán)境等方面有所不便，在選擇農(nóng)村污水處理技術(shù)的同時，研究在不同污水處理梯度下的污水資源化利用，即將污水處理到何種程度進(jìn)行污水回灌等資源化利用，可解決以上問題。郭魏等[14]利用連續(xù)砂濾池工藝的尾水連續(xù)5年灌溉番茄，發(fā)現(xiàn)蔗糖酶活性有所降低，且在低氮條件下再生水灌溉對細(xì)菌群落結(jié)構(gòu)影響較小，在高氮條件下再生水促進(jìn)細(xì)菌生長；楊茜[15]利用生活污水原水、厭氧出水和“厭氧+人工濕地技術(shù)”尾水回灌，厭氧出水灌溉對土壤酶活性無顯著影響，但對土壤有益菌屬具有一定的促進(jìn)作用。高遠(yuǎn)等[16]則認(rèn)為A2O工藝的尾水灌溉對土壤細(xì)菌數(shù)量和土壤細(xì)菌群落多樣性具有抑制作用；周媛等[11]利用A/O反硝化生物濾池和臭氧氧化組合工藝的二級出水灌溉番茄，發(fā)現(xiàn)污水灌溉對土壤脲酶和淀粉酶活性有促進(jìn)作用，對土壤蔗糖酶和過氧化氫酶活性有抑制作用，且施氮處理對土壤酶活性具有顯著影響。由此可見，在不同污水處理工藝和肥料的共同作用下，不同處理梯度的污水對土壤微生物群落結(jié)構(gòu)和酶活性的影響結(jié)果不盡相同，且以往研究選取的污水處理梯度較少，多數(shù)僅選取一種或兩種污水處理梯度，缺少完整污水處理工藝下的各種污水處理梯度的研究，因此本文依據(jù)當(dāng)?shù)剞r(nóng)村實(shí)際情況，選擇適宜當(dāng)?shù)氐纳钗鬯幚砉に?，探討在各處理梯度污水資源化利用條件下，對土壤微生物群落結(jié)構(gòu)和酶活性負(fù)面影響較小或具有正面影響的污水處理梯度，對選取合適的農(nóng)村污水處理程度等方面具有重要意義。本研究通過小型污水處理裝置獲取不同處理程度的污水，在不同的施肥條件下，采用室內(nèi)模擬試驗(yàn)對污水灌溉的茭白-水稻輪作土壤進(jìn)行分析，探討不同處理梯度污水對土壤細(xì)菌群落結(jié)構(gòu)和酶活性的影響，以期為降低污水處理成本及生活污水水質(zhì)安全性回灌提供數(shù)據(jù)支持。

1 材料與方法

1.1 供試土壤和試驗(yàn)用水

試驗(yàn)土壤取自合肥市肥西縣紫蓬鎮(zhèn)新農(nóng)村水稻田內(nèi)，除去地面雜草，收集0～25 cm層土壤。土壤收集后自然風(fēng)干，去除草根、石粒等雜物，過20目篩備用。供試土壤pH值6.35，有機(jī)質(zhì)12.77 g·kg-1，全氮0.91 g·kg-1，全磷0.46 g·kg-1，速效鉀110.44 mg·kg-1，速效磷12.34 mg·kg-1，堿解氮121.36 mg·kg-1。

生活污水原水取自安徽省合肥市蜀山區(qū)安徽中棉種業(yè)長江有限責(zé)任公司污水池內(nèi)，經(jīng)小型污水處理試驗(yàn)裝置（圖1），其污水處理流程為污水池→厭氧→儲水池→接觸氧化→儲水池→土地處理系統(tǒng)→出水。

本研究的試驗(yàn)用水取自上述污水處理試驗(yàn)裝置，其中：污水處理梯度（1）為未經(jīng)處理設(shè)施處理，取自污水池的生活污水；污水處理梯度（2）為經(jīng)厭氧工藝的出水，取自三級厭氧池后的儲水池；污水處理梯度（3）為經(jīng)厭氧+接觸氧化工藝的出水，取自接觸氧化池后的儲水池；污水處理梯度（4）為經(jīng)厭氧+接觸氧化+土地處理系統(tǒng)工藝的出水，取自污水處理裝置的最終出水，（5）為清水作為對照，各污水水質(zhì)見表1。

1.2 試驗(yàn)設(shè)計(jì)方案

室內(nèi)模擬試驗(yàn)為盆栽試驗(yàn)，用PVC板做成長40 cm、寬40 cm、高50 cm的試驗(yàn)盆，在試驗(yàn)盆內(nèi)填土種植水稻和茭白。每個試驗(yàn)盆中填土30.0 kg，施用底肥后將每個盆中用清水澆透，采用茭白-水稻輪作模式進(jìn)行盆栽試驗(yàn)。其中污水灌溉設(shè)5個處理：清水灌溉、處理梯度（1）出水、處理梯度（2）出水、處理梯度（3）出水和處理梯度（4）出水；施肥設(shè)兩個處理：完全不施肥W（0 kg N·hm-2）、施肥降低20%F（180 kg N·hm-2）。各處理分別用W1：不施肥水平下生活污水灌溉；FW1：施肥水平下生活污水灌溉；W2：不施肥水平下處理梯度（2）出水灌溉；FW2：施肥水平下處理梯度（2）出水灌溉；W3：不施肥水平下處理梯度（3）出水灌溉；FW3：施肥水平下處理梯度（3）出水灌溉；W4：不施肥水平下處理梯度（4）出水灌溉；FW4：施肥水平下處理梯度（4）出水灌溉；CK：不施肥水平下清水灌溉；FCK：施肥水平下清水灌溉表示。因污水中含有氮磷等營養(yǎng)元素，因此選擇的施肥量180 kg N·hm-2是本地農(nóng)田常規(guī)用量的80%。該研究共10個處理，每個處理設(shè)3次重復(fù)。

本試驗(yàn)肥料選用復(fù)合肥料（N-P2O5-K2O：15-15-15）作底肥施入盆內(nèi)，且在水稻分蘗期按75 kg·hm-2的標(biāo)準(zhǔn)追施肥料。選取長勢和大小一致的茭白無性繁殖體，確保每盆存活的茭白植株為1株，待所有植物地上部分均正常生長后，開始污水灌溉，加入頻次均為每日一次，每次1.0 L，各處理灌溉時間和灌水定額相同；茭白收獲后，選取水稻秧苗以10 cm×10 cm的密度進(jìn)行移栽種植，在分蘗期保持水層1.5 cm，分蘗末期保持水層3.0 cm，其他時期保持平均水層2.5 cm。

1.3 樣品采集

水稻成熟后選取0～20 cm土壤層，采用五點(diǎn)法采集土壤，一部分新鮮土壤在0～4℃下保存用于土壤微生物的分離；另一部分新鮮土壤進(jìn)行風(fēng)干處理，用帶電玻璃棒吸附除去細(xì)根，揀去石礫及植物殘?bào)w，過1 mm和0.25 mm篩，用于土壤脲酶、蔗糖酶和堿性磷酸酶活性的測定。

圖1污水處理試驗(yàn)裝置示意圖Figure 1 Schematic diagramof sewage treatment test facility

表1試驗(yàn)用水水質(zhì)Table 1 Test water quality

1.4 土壤酶活性測定方法

土壤脲酶活性采用苯酚鈉比色法測定，土壤堿性磷酸酶活性采用磷酸苯二鈉比色法測定，土壤蔗糖酶活性采用3，5-二硝基水楊酸比色法測定[17]。

1.5 土壤微生物群落結(jié)構(gòu)分析

1.5.1 DNA提取

DNA提取參照DNA Kit（Omega Bio-tek，Norcross，GA，U.S.）試劑盒說明書，提取得到的DNA樣品用1%瓊脂糖凝膠電泳檢測，并用分光光度法（260 nm/280 nm光密度比）進(jìn)行質(zhì)量檢測。

1.5.2 MiSeq測序

微生物多樣性檢測選取細(xì)菌16SrDNA V3～V4區(qū)，DNA樣本使用Illumina Miseq PE300高通量測序平臺測序。細(xì)菌16SrDNA V3～V4擴(kuò)增引物為338F（5′-ACTCCTACGGGAGGCAGCAG-3′）和806R（5′-GGACTACNNGGGTATCTAAT-3′）。PCR反應(yīng)體系（總體系為25μL）：12.5μL KAPA 2G Robust Hot Start Ready Mix、1μL Forward Primer（5μmol·L-1）、1μL Reverse Primer（5μmol·L-1）、5μL DNA（加入的DNA總量為30 ng），最后加5.5μL dd H2O補(bǔ)足至25μL。反應(yīng)參數(shù)：95℃預(yù)變性5 min；95℃變性45 s，55℃退火50 s，72℃延伸45 s，28個循環(huán)；72℃延伸10 min。測序原始序列上傳至NCBI的SRA數(shù)據(jù)庫。

1.6 數(shù)據(jù)分析與計(jì)算方法

在Illumina MiSeq平臺進(jìn)行Paired-end測序，根據(jù)barcodes歸類各處理組序列信息聚類為用于物種分類的OUT（Operational Taxonomic Units），OTU相似性設(shè)置為97%。對比silva數(shù)據(jù)庫，得到每個OTU對應(yīng)的物種分類信息。利用qiime version v.1.8.0對數(shù)據(jù)進(jìn)行抽平處理，并采用0.97的相似度進(jìn)行分析得到Chao1指數(shù)、Simpson指數(shù)、Coverage指數(shù)和Shannon指數(shù)[18-20]。

Chao1指數(shù)：指示菌種豐富度，用以評估群落中的OTU數(shù)目。其公式為：

式中：Schao1為估計(jì)的OTU數(shù)；Sobs為觀測到的OTU數(shù)；n1為只有一條序列的OTU數(shù)目；n2為只有兩條序列的OTU數(shù)目。

Simpson指數(shù)：用來評估群落中的優(yōu)勢種。其公式為：

式中：Ni為某一特定物種的個體的總數(shù)；N為發(fā)現(xiàn)的個體總數(shù)。

Coverage指數(shù)：觀測深度，用以表征各樣本的覆蓋率，反映了本次測序結(jié)果是否代表了樣本中微生物的真實(shí)情況。其公式為：

式中：n1為只含一條序列的OTU數(shù)目；N為抽樣中出現(xiàn)的總的序列數(shù)目。

Shannon指數(shù)：用以反映群落中物種豐富度。其公式為：

式中：Pi為樣品中屬于第i種的個體的比例。

經(jīng)過UniFrac算法利用系統(tǒng)進(jìn)化的信息來比較樣品間物種群落差異，通過SPSS軟件對細(xì)菌多樣性指數(shù)和土壤酶活性進(jìn)行單因素方差分析。

2 結(jié)果與分析

2.1 土壤細(xì)菌稀釋性曲線

稀釋性曲線（Rarefaction curve）即從樣品中隨機(jī)選擇一定數(shù)量的個體，計(jì)算個體代表的物種數(shù)，利用個體數(shù)量和物種數(shù)構(gòu)建曲線，從而比較具有不同數(shù)量測序數(shù)據(jù)的樣本中物種豐富度，確定樣品中測序數(shù)據(jù)的數(shù)量是否合理[21]。由圖2可知，在α=0.03的水平上，隨著測序數(shù)據(jù)量的增加，各處理的曲線均趨向平緩，這說明本次試驗(yàn)測序數(shù)據(jù)的數(shù)量是合理的。

圖2不同處理的稀釋性曲線（α=0.03）Figure 2 Rarefaction curves of different treatments（α=0.03）

2.2 土壤細(xì)菌層次聚類分析

圖3基于bray curtis多樣本聚類樹Figure 3 Multiple copy clustering tree based on bray curtis

在多樣本聚類樹中，樹枝長度代表的是樣本之間的距離，當(dāng)樣本相似度越高時，樣本越能聚集到一起[22]。如圖3所示，橫坐標(biāo)為各處理間的距離系數(shù)。以相似性0.8為標(biāo)準(zhǔn)時，樣本分為兩大類，一類是FW3、FW4、FW2、FW1，另一類是CK、W3、W4、FCK、W2、W1。在施肥條件下，與對照相比，污水灌溉使得細(xì)菌群落結(jié)構(gòu)發(fā)生明顯變化，其中FW2和FW4樣本相似度較高；在不施肥條件下，處理梯度較低的污水灌溉與清水灌溉的土壤細(xì)菌群落結(jié)構(gòu)變化較大，W1和W2處理的樣本相似度高，W3和W4處理的土壤細(xì)菌群落結(jié)構(gòu)與對照相差較?。辉谕还喔葪l件下，施肥土壤和不施肥土壤的細(xì)菌群落結(jié)構(gòu)發(fā)生明顯變化，其中清水灌溉下的兩種土壤的細(xì)菌群落結(jié)構(gòu)變化小于污水灌溉，處理梯度（3）灌溉下的兩種土壤的細(xì)菌群落結(jié)構(gòu)變化小于其他處理梯度的污水灌溉處理。

2.3 不同處理梯度污水對細(xì)菌群落多樣性和群落組成的影響

2.3.1 不同處理梯度污水對土壤細(xì)菌多樣性指數(shù)的影響

Chao1指數(shù)和Shannon指數(shù)與群落多樣性呈正比，Simpson指數(shù)與群落多樣性呈反比，Coverage指數(shù)越高說明樣本中序列被檢出的概率越高。由表2可知，在不施肥條件下，W2處理的Shannon指數(shù)（9.49）顯著低于其他處理，Simpson指數(shù)（0.008 4）顯著高于其他處理（P＜0.05）；在施肥條件下，不同污水灌溉的土壤細(xì)菌群落多樣性無顯著變化；同時，在相同灌溉條件下，除處理梯度（2），不施肥土壤的Chao1指數(shù)和Shannon指數(shù)均高于施肥土壤，Coverage指數(shù)略低于施肥土壤；處理梯度（1）、處理梯度（3）和處理梯度（4）的土壤中，不施肥的Simpson指數(shù)低于施肥土壤，處理梯度（2）和清水灌溉的土壤中，不施肥的Simpson指數(shù)高于施肥土壤。

2.3.2 不同處理梯度污水對土壤細(xì)菌在門水平上相對豐度的影響

在施肥和未施肥的土壤中共同檢測出了12種菌門，包括變形菌門（Proteobacteria）、螺旋體菌門（Saccharibacteria）、綠彎菌門（Chloroflexi）、厚壁菌門（Firmicutes）、酸桿菌門（Acidobacteria）、疣微菌門（Verrucomicrobia）、放 線 菌 門（Actinobacteria）、Parcubacteria、芽單胞菌門（Gemmatimonadetes）、藍(lán)藻門（Cyanobacteria）、硝化螺旋菌門（Nitrospirae）、擬桿菌門（Bacteroidetes），Other為相對豐度低于1%的微生物。

由圖4可知，在施肥的條件下，變形菌門（Proteobacteria）相對豐度最高，其次是綠彎菌門（Chloroflexi）、酸桿菌門（Acidobacteria）和放線菌門（Actinobacteria）；與對照相比，隨著污水處理強(qiáng)度的增加，變形菌門（Proteobacteria）相對豐度逐漸提高，在FW1處理（24.39%）下最低，低于對照土壤的29.28%；而FW1處理土壤中綠彎菌門（Chloroflexi）和酸桿菌門（Acidobacteria）的相對豐度（27.10%、16.35%）均高于其他處理，與對照相近；污水灌溉對放線菌門（Actinobacteria）有促進(jìn)作用，F(xiàn)W1和FW4的促進(jìn)作用較強(qiáng)，相對豐度增幅為95.90%和62.87%，F(xiàn)W2和FW3的促進(jìn)效果較弱，相對豐度增幅為37.27%和20.11%；污水灌溉對厚壁菌門（Firmicutes）也具有一定的促進(jìn)作用，且FW2、FW3及FW4的促進(jìn)能力較強(qiáng)，相對增幅為146.91%、142.59%和132.10%。

表2不同處理對土壤細(xì)菌群落多樣性的影響Table 2 Effects of different treatments on soil bacterial community diversity

在未施肥條件下，污水灌溉和清水灌溉的土壤中放線菌門（Actinobacteria）和厚壁菌門（Firmicutes）的相對豐度低于施肥條件下的土壤，提高了硝化螺旋菌門（Nitrospirae）的相對豐度；與施肥土壤相比，W1抑制了綠彎菌門（Chloroflexi）和酸桿菌門（Acidobacteria）的相對豐度，兩種菌門相對豐度降幅為13.58%和9.30%，其他3種處理梯度出水則提高了綠彎菌門（Chloroflexi）和酸桿菌門（Acidobacteria）的相對豐度，與之相反的是W1對變形菌門（Proteobacteria）、芽單胞菌門（Gemmatimonadetes）和螺旋體菌門（Saccharibacteria）的相對豐度有促進(jìn)作用，其他3種處理梯度出水和清水灌溉的土壤對這3種菌門具有抑制作用；其他菌門相對豐度變化不明顯。

2.3.3 不同處理梯度污水對土壤細(xì)菌在屬水平上相對豐度的影響

由圖5可知，在施肥土壤中，F(xiàn)W1中厭氧菌屬（Anaerolinea）的相對豐度（2.27%）略高于其他處理；污水灌溉降低了土壤中厭氧黏細(xì)菌屬（Anaeromyxobacter）的相對豐度，其中FW3對其抑制作用最強(qiáng)，相對豐度降低74.61%；與FCK相比，污水灌溉對Haliangium和Geobacter有抑制作用，其中FW4處理中兩種菌屬相對豐度的降幅為2.46%和9.06%，抑制作用最低，F(xiàn)W1處理中兩種菌屬相對豐度的降幅為56.64%和63.65%、FW3處理中的降幅為66.34%和28.43%，F(xiàn)W1和FW3處理對其抑制作用較強(qiáng)；污水灌溉提高了芽單胞菌屬（Gemmatimonas）和鞘氨醇單胞菌屬（Sphingomonas）的相對豐度，F(xiàn)W2對兩者的促進(jìn)作用最好，相對豐度升高100%和261.40%，F(xiàn)W1、FW3和FW4次之；與FCK相比，F(xiàn)W3顯著提高了Candidatus_Nitrotoga的相對豐度，升幅為588.69%，而其他污水處理對Candidatus_Nitrotoga有抑制作用，F(xiàn)W1對Candidatus_Nitrotoga有顯著的抑制作用，降幅為97.35%。

圖4土壤細(xì)菌在門水平上的相對豐度Figure 4 Relative abundance of soil bacteriaat phylum level

圖5土壤細(xì)菌在屬水平上的相對豐度Figure 5 Relative abundance of soil bacteria at genus level

與施肥土壤相比，在未施肥土壤中污水灌溉提高了厭氧黏細(xì)菌屬（Anaeromyxobacter）、Sideroxydans和Haliangium的相對豐度，分別增加了0.12%～0.92%、0.13%～1.05%、0.30%～0.95%，降低了鞘氨醇單胞菌屬（Sphingomonas）的相對豐度，降低了0.28%～1.74%，但清水灌溉卻對鞘氨醇單胞菌屬（Sphingomonas）的相對豐度有促進(jìn)作用，增加了0.81%。

2.4 不同處理梯度污水對土壤酶活性的影響

由表3得出，與施肥土壤相比，處理梯度（1）灌溉使得不施肥土壤中堿性磷酸酶活性降低；除此以外，在同一處理梯度污水灌溉下，不施肥土壤中的脲酶、蔗糖酶和堿性磷酸酶活性大于施肥土壤相應(yīng)的酶活性。不施肥土壤的堿性磷酸酶活性表現(xiàn)為W2＞W(wǎng)4＞W(wǎng)1＞W(wǎng)3＞CK，與施肥土壤中的變化趨勢一致，污水灌溉對土壤堿性磷酸酶活性具有促進(jìn)作用，在不同施肥條件下處理梯度（2）灌溉中的堿性磷酸酶活性相對于對照分別提高了55.40%和46.67%，促進(jìn)作用最強(qiáng)。不施肥土壤脲酶活性表現(xiàn)為W4＞W(wǎng)1＞W(wǎng)3＞W(wǎng)2＞CK，與清水灌溉相比，污水灌溉對不施肥土壤脲酶活性有促進(jìn)作用，且隨著污水處理強(qiáng)度的增加，土壤脲酶活性先降低后升高，在W2處理中脲酶活性最低，為106.49 U·g-1；施肥土壤中脲酶活性表現(xiàn)為FW1＞FCK＞FW4＞FW2＞FW3，F(xiàn)W3處 理 相 對 于FCK降 低 了25.85%，抑制了脲酶活性，其余幾個處理對施肥土壤脲酶活性無顯著影響。不施肥土壤的蔗糖酶活性表現(xiàn)為W2＞W(wǎng)1＞W(wǎng)3＞W(wǎng)4＞CK，施肥土壤蔗糖酶活性表現(xiàn)為FW3＞FW1＞FW2＞FW4＞FCK，污水灌溉土壤中蔗糖酶活性大于清水灌溉的土壤蔗糖酶活性。

3 討論

本研究表明，在施肥水平下，不同處理梯度的污水灌溉對土壤細(xì)菌群落多樣性影響均不顯著，與Ibekwe等[23]研究結(jié)果類似。但現(xiàn)在多數(shù)研究[5，24]認(rèn)為污水灌溉可提高土壤微生物多樣性，這可能有以下幾個原因：一是由于本次研究僅有一次茭白-水稻輪作的生長周期（8個月左右），與Bastida等[5]、Dang等[24]研究中的3年到30年灌溉周期相比，本次試驗(yàn)灌溉周期較短；二可能是土壤質(zhì)量、灌溉方式等問題。在不施肥土壤中，W2降低了土壤中的細(xì)菌多樣性，其他3種污水在一定程度上表現(xiàn)出抑制作用，但與清水灌溉并無顯著差異，這可能是因?yàn)樵诓皇┓实耐寥乐?，植物更多地從污水和土壤中吸收營養(yǎng)物質(zhì)，而W2中的植物生長更旺盛，所需的營養(yǎng)物質(zhì)也就更多，從而導(dǎo)致土壤肥力下降，而研究證明微生物豐富度及多樣性指數(shù)與土壤綜合肥力指數(shù)具有冪函數(shù)關(guān)系，當(dāng)微生物多樣性提高時，土壤綜合肥力指數(shù)也隨著提高，而土壤綜合肥力指數(shù)主要用以指示土壤肥力質(zhì)量，土壤微生物多樣性包含細(xì)菌群落多樣性在內(nèi)，因此土壤細(xì)菌多樣性增加有利于提高土壤肥力[4,25]，所以使得W2灌溉土壤中細(xì)菌多樣性降低。但研究發(fā)現(xiàn)在同一灌溉條件下，降低肥料的使用會刺激微生物對碳、氮的反應(yīng)[26]，因此可以增加細(xì)菌群落多樣性，這與郭魏[10]的結(jié)論相似。

土壤微生物的群落結(jié)構(gòu)變化是在水質(zhì)和施肥互作下的群體性反應(yīng)，這種變化由優(yōu)勢種群的變化及某一部分非優(yōu)勢種群的有無來表現(xiàn)[27]。本次研究中發(fā)現(xiàn)，施肥的土壤中污水灌溉的土壤細(xì)菌群落結(jié)構(gòu)與清水灌溉相比發(fā)生了改變，土壤細(xì)菌在門水平上相對豐度變化較大，但在屬水平上優(yōu)勢種（unidentified）未發(fā)生明顯改變。這表明相對于清水灌溉，污水灌溉促進(jìn)了土壤中變形菌門（Proteobacteria）的相對豐度，且隨著污水處理梯度的減弱、污水濃度的增加，土壤中污水濃度與變形菌門（Proteobacteria）的相對豐度呈負(fù)相關(guān)（FW3處理除外）；污水灌溉降低了土壤中酸桿菌門（Acidobacteria）的相對豐度，提高了放線菌門（Actinobacteria）相對豐度，其中施肥土壤中的酸桿菌門（Acidobacteria）和放線菌門（Actinobacteria）相對豐度隨處理梯度的增加呈現(xiàn)先下降后上升的趨勢，不施肥土壤中酸桿菌門（Acidobacteria）隨著污水濃度的增加相對豐度先增加后減少的趨勢，不施肥土壤中污水濃度與放線菌門（Actinobacteria）的相對豐度具有正相關(guān)性。變形菌門（Proteobacteria）中的固氮菌可固定土壤中的氮元素，這說明當(dāng)污水處理梯度增加、污水濃度變低時，污水灌溉通過提高有益菌屬的相對豐度，促進(jìn)土壤中氮元素轉(zhuǎn)化的有關(guān)過程，但高濃度污水對其提高率較低，可能是因?yàn)槲鬯械奈⑸镫S灌溉進(jìn)入土壤，對土壤微生物產(chǎn)生了抑制作用；放線菌門（Actinobacteria）可以參與土壤中有機(jī)物的分解和氮循環(huán)[28-29]，這說明污水灌溉可以促進(jìn)放線菌門（Actinobacteria）生長繁殖，從而促進(jìn)了土壤有機(jī)物的分解，提高了土壤養(yǎng)分水平，其中生活污水原水灌溉更有利于放線菌門（Actinobacteria）生長。酸桿菌門（Acidobacteria）可以降解植物殘?bào)w、參與單碳化合物降解，為土壤提供養(yǎng)分[30]，污水灌溉通過抑制酸桿菌門（Acidobacteria）的活性在一定程度上抑制了土壤中的碳循環(huán)過程，其中在施肥土壤中處理梯度（3）、在不施肥土壤中處理梯度（1）對其抑制作用較強(qiáng)。

表3不同污水濃度灌溉對土壤酶活性的影響Table 3 Effects of irrigation with different sewage concentrations on soil enzyme activity

土壤脲酶可以催化尿素，提高土壤供氮能力；土壤蔗糖酶使蔗糖加速分解，增加土壤中易溶性物質(zhì)[8]；土壤磷酸酶促進(jìn)了有機(jī)磷的脫磷過程，促進(jìn)磷元素的有效性[18]，土壤微生物通過分泌酶的形式參與到土壤各種反應(yīng)過程中。脲酶、蔗糖酶和磷酸酶與土壤中碳、氮、磷循環(huán)具有密切聯(lián)系，其變化反映了土壤養(yǎng)分的動態(tài)變化情況[31]，因此土壤酶可以反應(yīng)微生物在土壤各項(xiàng)生化反應(yīng)中的強(qiáng)度及方向[32]。潘能等[33]研究發(fā)現(xiàn)，農(nóng)田土壤經(jīng)再生水灌溉后，土壤蔗糖酶、堿性磷酸酶和脲酶活性均有一定程度的提高；韓洋等[34]研究發(fā)現(xiàn)再生水對土壤蔗糖酶活性有促進(jìn)作用，García-Orenes等[35]研究發(fā)現(xiàn)污水灌溉提高了土壤脲酶和堿性磷酸酶活性。本研究表明，在施肥水平下，污水灌溉均促進(jìn)了土壤堿性磷酸酶和蔗糖酶的活性，在完全不施肥水平下，污水灌溉對3種酶活性均有不同程度的促進(jìn)作用。原因是相較于清水，污水中含有更多的氮、磷營養(yǎng)元素和更多種類的微生物，這些物質(zhì)隨灌溉進(jìn)入到土壤中，提高了土壤微生物群落多樣性，從而使得堿性磷酸酶活性和蔗糖酶活性增加。但處理梯度（3）顯著降低了施肥土壤中脲酶活性，其他污水處理對脲酶活性無顯著影響，且處理梯度（3）使得施肥土壤中與氮有關(guān)的變形菌門（Proteobacteria）的相對豐度顯著降低，這可能是因?yàn)樘幚硖荻龋?）中Candidatus Nitrotoga的相對豐度高于其他污水處理5.88%～269.41%，Candidatus Nitrotoga屬于亞硝酸鹽氧化細(xì)菌，亞硝酸鹽氧化細(xì)菌主要作用是將亞硝態(tài)氮氧化為硝態(tài)氮[36]，而郭魏等[10]研究發(fā)現(xiàn)硝態(tài)氮含量與土壤脲酶活性呈顯著負(fù)相關(guān)，因此導(dǎo)致其脲酶活性和變形菌門（Proteobacteria）的相對豐度降低，其他處理中的微生物相對豐度相差較小，導(dǎo)致其他污水處理對脲酶活性無顯著影響。同時在同一灌溉條件下，不施肥土壤中3種酶活性大于施肥土壤中酶活性，對比施肥處理，減少常規(guī)肥刺激了微生物對氮磷的反應(yīng)，提高了3種酶活性，這與以往研究結(jié)果[16]相似。

4 結(jié)論

（1）在施肥條件下，不同處理梯度下的污水灌溉對土壤細(xì)菌群落多樣性無顯著影響；完全不施肥條件下，處理梯度（2）降低了土壤中的細(xì)菌群落多樣性；在同一灌溉條件下，降低肥料的使用可以增加細(xì)菌群落多樣性。

（2）污水灌溉對細(xì)菌門水平上的優(yōu)勢種影響較大，對細(xì)菌屬水平上的優(yōu)勢種影響較小。隨著污水處理梯度的提高，變形菌門（Proteobacteria）活性提高，有利于土壤氮元素的轉(zhuǎn)化；污水灌溉在不同施肥水平上促進(jìn)了土壤中放線菌門（Actinobacteria）的生長繁殖，處理梯度（1）對其促進(jìn)作用最強(qiáng)，更有利于植物結(jié)瘤固氮、提高土壤肥力；污水灌溉中酸桿菌門（Acidobacteria）的活性顯著低于清水灌溉，對土壤物質(zhì)循環(huán)造成一定影響。

（3）隨著污水處理梯度的加強(qiáng)，堿性磷酸酶活性呈現(xiàn)出先增加后減少再增加的趨勢，蔗糖酶顯現(xiàn)出先增加后減少的趨勢，且均高于對照，其中處理梯度（2）綜合效果更優(yōu)；土壤脲酶活性表現(xiàn)為先降低后增加的趨勢，除施肥條件下處理梯度（3）外，其他處理對施肥土壤脲酶活性影響不顯著；在同一灌溉條件下，不施肥土壤中3種酶活性大于施肥土壤中酶活性[處理梯度（1）堿性磷酸酶活性相當(dāng)]。

（4）綜合考慮，在不施肥水平下使用生活污水原水灌溉、在施肥水平下施用厭氧處理出水灌溉對土壤細(xì)菌群落結(jié)構(gòu)變化、提高酶活性更有利。