劉鼎闊 李源 胡鵬程 劉潔 劉芳

1.鼎正新興生物技術(shù)(天津）有限公司 300383

2.天津市飼用微生物制劑企業(yè)重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室 3003833

3.天津市企業(yè)技術(shù)中心 300383

中藥大黃有清熱瀉火、攻積滯、解毒等功效。主要包括游離蒽醌、萘類、兒茶酚、沒食子鞣苷、番瀉苷等成分，游離蒽醌中主要含有大黃素、蘆薈大黃素大黃酸、大黃酚和大黃素甲醚。有效成分主要集中在蒽酮類、蒽醌類、蒽醌衍生物類等，具有超過160種化學(xué)成分結(jié)構(gòu)。通過傳統(tǒng)的煎煮工藝對大黃中的蒽醌成分進(jìn)行提取，提取率非常低，而且長時(shí)間高溫還會(huì)導(dǎo)致蒽醌結(jié)構(gòu)受到破壞，降低藥物效果。有研究顯示，醇提取法提取大黃蒽醌類有效成分方法具有費(fèi)用低、操作簡單、提出率較高等優(yōu)點(diǎn)。

本試驗(yàn)旨在通過對比大黃醇提取物與常見的大黃水煎劑對大腸桿菌、金黃葡萄球菌的抑菌效果，為今后開展大黃提取物的獸藥研發(fā)提供理論依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 材料

菌種：大腸桿菌（E.Coli）（bio-69919）、金黃葡萄球菌（bio-52742）（均由天津市飼用微生物制劑企業(yè)重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室提供）

試驗(yàn)原料：大黃飲片（購自甘肅鑫晟源生物科技開發(fā)有限責(zé)任公司）、乙醇、牛肉膏、蛋白胨、氯化鈉等。

試驗(yàn)設(shè)備：旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀（上海亞榮生化儀器廠）

1.2 方法

1.2.1 菌種的活化挑取大腸桿菌和金黃葡萄球接種于NB培養(yǎng)基，37℃搖床培養(yǎng)活化24h，培養(yǎng)液于4℃離心5min，12000r/min，將上清液通過0.2μm 微孔濾膜過濾，備用。

1.2.2 大黃醇提液的制備大黃飲片粉碎，過60目篩，稱取50g，加入100mL無水乙醇，浸泡12h-16h后，于85℃-90℃下加熱2h，將藥液過濾，收集濾液。濾渣加入80mL無水乙醇，于85℃-90℃下加熱2h，二次過濾并收集濾液。合并兩次濾液，置于50℃烘箱干燥至相對密度1.01mg/mL。以pH7.2、0.05mol/L滅菌的磷酸鹽緩沖液稀釋大黃乙醇提取物至1%、3%、5%、7%及9%，備用。

1.2.3 大黃水煎劑制備大黃飲片粉碎，過60目篩，稱取50g，加水浸泡1h后于煎鍋中煮沸，再文火煎制30min，將藥液過濾，濾渣通過上述方法再進(jìn)行兩次煎煮，將濾液合并，5000r/min離心10min，旋轉(zhuǎn)濃縮至1.0g/ml，紫外滅菌，4℃冰箱備用。

1.2.4 抑菌效果

1.2.4.1 對比大黃醇提取物與大黃水煎劑抑菌效果 分別用制備的大黃醇提取物與大黃水煎劑對大腸桿菌、金黃葡萄球菌進(jìn)行藥敏試驗(yàn)，每組設(shè)置3組重復(fù)，通過t檢驗(yàn)方法對結(jié)果進(jìn)行統(tǒng)計(jì)，對比抑菌效果。

1.2.4.2 不同濃度大黃醇提取物抑菌效果比較 分別用1%、2%、5%、10%大黃醇提取物對對大腸桿菌、金黃葡萄球菌進(jìn)行藥敏試驗(yàn)，每組設(shè)置3組重復(fù)，通過單因素方差分析法對結(jié)果進(jìn)行統(tǒng)計(jì)，對比抑菌效果。

2 結(jié)果

2.1 對比大黃醇提取物與大黃水煎劑抑菌效果如圖1、2、3所示，大黃醇提物對大腸桿菌和金黃葡萄球菌均有顯著抑制作用，且對大腸桿菌的抑菌性優(yōu)于金黃葡萄球菌（P≤0.05）。大黃水煎劑對大腸桿菌和金黃葡萄球菌開始有抑制效果，但抑菌圈界限不明顯，且隨后抑菌圈內(nèi)再次出現(xiàn)細(xì)菌。

圖1 大黃醇提物對大腸桿菌和金黃葡萄球菌的抑菌效果

圖2 大黃醇提取物與大黃水煎劑對大腸桿菌抑制作用

圖3 大黃醇提取物與大黃水煎劑對金黃葡萄球菌抑制作用

2.2 不同濃度大黃醇提取物抑菌效果比較

如圖4、5所示，大黃醇提取物對大腸桿菌及金黃葡萄球菌抑菌效果隨濃度的升高顯著增強(qiáng)，大黃醇提取物濃度為5%時(shí)對大腸桿菌抑菌性最強(qiáng)，濃度為3%時(shí)對金黃葡萄球抑菌性最強(qiáng)。

圖4 大黃醇提取物對大腸桿菌抑菌效果

圖5 醇提取物對金黃葡萄球菌抑菌效果

3 討論

本試驗(yàn)對大黃醇提物及大黃水煎劑的抑菌性進(jìn)行了對比，發(fā)現(xiàn)大黃醇提物對畜禽養(yǎng)殖中常見的大腸桿菌及金黃葡萄球菌具有明顯的抑制作用，而普通大黃水煎劑抑菌性較差。大黃對多種致病菌具有抑制作用，可通過抑制病原菌生物膜和蛋白質(zhì)合成發(fā)揮抗菌作用。有研究表明，大黃中的大黃素可以通過抑制菌體糖及糖代謝中間產(chǎn)物的氧化、脫氫、脫氨，并與之結(jié)合，干擾其模板功能，從而抑制蛋白質(zhì)和核酸的合成，抑制金黃葡萄球菌生物膜相關(guān)基因的表達(dá)及干預(yù)細(xì)胞DNA的釋放，最終抑制其生長。

由于醇提可以使大黃中的有效成分達(dá)到較大程度利用，降低用藥成本，因此，對于畜禽動(dòng)物養(yǎng)殖具有廣泛應(yīng)用前景。