時宗芬，魯星月，張 配，趙素容

鼻咽癌是我國東南地區(qū)發(fā)病率較高的惡性腫瘤之一，有研究[1-2]顯示中國目前鼻咽癌的發(fā)病率和死亡率仍處于世界較高水平，由于鼻咽癌病人在接受放化療治療后，預(yù)后較差，易復(fù)發(fā)等原因，導(dǎo)致部分鼻咽癌病人的5年存活率不高[3-6]。因此，為了提高鼻咽癌治療效果，尋找新的治療策略以提高鼻咽癌病人的生存率值得研究。糖酵解抑制劑3-溴丙酮酸(3-bromopyruvate，3-BrPA)是一種小分子強(qiáng)烷化劑，研究[7-9]表明3-BrPA具有良好的體外抗腫瘤作用，能有效抑制肝癌、胰腺癌和胃癌的生長。本課題組前期研究[10-12]發(fā)現(xiàn)，3-BrPA能促進(jìn)鼻咽癌、乳腺癌細(xì)胞的凋亡以及增強(qiáng)肝癌細(xì)胞對順鉑的敏感性。研究[13-14]顯示，抑制腫瘤細(xì)胞糖酵解過程，使其能量大量缺失能夠增強(qiáng)抗癌藥物的療效。本課題組前期在肝癌細(xì)胞中對3-BrPA的增敏作用進(jìn)行了初步探討，但3-BrPA能否在不同腫瘤細(xì)胞中發(fā)揮良好的化療藥物增敏作用仍需繼續(xù)探索，在鼻咽癌細(xì)胞中，3-BrPA對順鉑誘導(dǎo)的鼻咽癌細(xì)胞凋亡的影響及其作用機(jī)制有待進(jìn)一步探究。因此，本研究以人鼻咽癌細(xì)胞HNE1為研究對象，探討3-BrPA對順鉑誘導(dǎo)的鼻咽癌細(xì)胞凋亡的敏感性及其作用機(jī)制，以期為鼻咽癌的臨床治療提供參考依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 試劑 RPMI 1640培養(yǎng)基：HyClone公司；胰蛋白酶：Gibco公司；胎牛血清：杭州四季青生物工程材料有限公司；ATP檢測試劑盒、線粒體膜電位檢測試劑盒(JC-1)、青霉素-鏈霉素溶液：碧云天生物技術(shù)有限公司；二甲基亞砜(DMSO)：Amresco公司；3-BrPA：Sigma公司；順鉑：齊魯制藥有限公司；AnnexinⅤ-FITC/PI雙染試劑盒：上海貝博生物科技有限公司；Mcl-1、Bcl-2、Bax、Bak抗體：Proteintech公司；山羊抗兔IgG：Abcam公司。

1.2 細(xì)胞與細(xì)胞培養(yǎng) 鼻咽癌細(xì)胞株HNE1購自北京北納創(chuàng)聯(lián)生物技術(shù)研究院，由蚌埠醫(yī)學(xué)院科研中心生化藥理實驗室凍存。將HNE1細(xì)胞置于含10%胎牛血清的RPMI 1640培養(yǎng)液內(nèi)，培養(yǎng)于37 ℃、5% CO2、飽和濕度的培養(yǎng)箱中。

1.3 MTT法檢測細(xì)胞存活率 取對數(shù)生長期的HNE1細(xì)胞，以每孔6 000細(xì)胞接種于96孔板，培養(yǎng)24 h 后換液加入不同濃度3-BrPA(20、40、80、160、320 μmol/L)、順鉑(2、4、8、16、32 μmol/L)以及80 μmol/L 3-BrPA 聯(lián)合順鉑(2、4、8、16、32 μmol/L)處理，同時設(shè)陰性對照組和空白對照組，每個處理3個復(fù)孔，分別培養(yǎng)24、48、72 h后，加入15 μL 20 μg/mL MTT 溶液，繼續(xù)培養(yǎng)4 h，吸去培養(yǎng)液，每孔加入150 μL DMSO，用酶標(biāo)儀在490 nm處測定吸光度值(A490 nm)。計算細(xì)胞的存活率。細(xì)胞存活率(%)=(處理組A490 nm-空白組A490 nm)/(對照組A490 nm-空白組A490 nm)×100%。

1.4 集落克隆形成實驗 取對數(shù)生長期的HNE1細(xì)胞，以每孔5 000細(xì)胞接種于6孔板，24 h后使用8 μmol/L3-BrPA，0.8 μmol/L順鉑以及 8 μmol/L3-BrPA+0.8 μmol/L順鉑處理HNE1細(xì)胞，繼續(xù)培養(yǎng)5～7 d，觀察到細(xì)胞集落形成后，去除培養(yǎng)基，PBS洗滌2次，4%多聚甲醛-20 ℃固定20 min，結(jié)晶紫染色5 min，棄染色液，清洗干凈，室溫干燥并拍照。

1.5 AnnexinⅤ-FITC/PI 雙染檢測細(xì)胞凋亡 實驗分為對照組、80 μmol/L 3-BrPA組、8 μmol/L順鉑組、80 μmol/L 3-BrPA+8 μmol/L順鉑組。取對數(shù)生長期的HNE1細(xì)胞，以每孔1.5×105細(xì)胞接種于12孔板，經(jīng)給藥換液，繼續(xù)培養(yǎng)24 h，收集細(xì)胞，1 000 r/min離心8 min，棄上清液，加入PBS洗1次，棄上清，按照試劑說明書將PI 和AnnexinⅤ-FITC 加入細(xì)胞中孵育20 min，1 h 內(nèi)用流式細(xì)胞儀檢測細(xì)胞的凋亡情況。

1.6 線粒體膜電位檢測 取對數(shù)生長期的HNE1細(xì)胞，以每孔2×105細(xì)胞接種于6孔板，經(jīng)給藥換液(實驗分組同1.5)，繼續(xù)培養(yǎng)24 h，吸除培養(yǎng)液，每孔加入0.5 mL新配制的JC-1染色工作液(按照J(rèn)C-1檢測試劑盒說明書進(jìn)行操作)，于37 ℃孵育30 min，再用預(yù)冷的JC-1染色緩沖液洗滌2次，冰上保存。熒光顯微鏡觀察、拍照。

1.7 DAPI熒光染色 取對數(shù)生長期的HNE1細(xì)胞，以每孔2×105細(xì)胞接種于6孔板，經(jīng)給藥換液(實驗分組同1.5)，繼續(xù)培養(yǎng)24 h，吸除培養(yǎng)液，PBS洗滌細(xì)胞2次，4%多聚甲醛室溫固定20 min，每孔加0.5 mL DAPI染色液，避光孵育5 min，棄上清，PBS洗滌2次，加2 mL PBS。用熒光顯微鏡觀察、拍照。

1.8 細(xì)胞內(nèi)ATP水平檢測 取對數(shù)生長期的HNE1細(xì)胞，以每孔2×105細(xì)胞接種于6孔板，每組3個復(fù)孔，經(jīng)給藥換液(實驗分組同1.5)，繼續(xù)培養(yǎng)24 h后收集細(xì)胞。根據(jù)ATP檢測試劑盒說明書進(jìn)行操作，以酶標(biāo)儀測定化學(xué)發(fā)光強(qiáng)度。用實驗組的化學(xué)發(fā)光強(qiáng)度與對照組的化學(xué)發(fā)光強(qiáng)度的比值確定各組細(xì)胞內(nèi)ATP水平。

1.9 Western blotting檢測蛋白表達(dá) 取對數(shù)生長期的HNE1細(xì)胞，以每孔2.5×105細(xì)胞接種于6孔板，經(jīng)給藥換液(實驗分組同1.5)，繼續(xù)培養(yǎng)24 h。收集細(xì)胞，冰上裂解30 min，4 ℃、12 000 r/min離心30 min，提取細(xì)胞總蛋白，BCA蛋白定量法測定各組蛋白濃度，加入SDS-PAGE蛋白上樣緩沖液，100 ℃煮沸5 min。每組取50 μg蛋白，10% SDS-PAGE電泳(80 V，30 min；120 V，100 min)；轉(zhuǎn)膜(200 mA，2～3 h)至PVDF膜；5%脫脂牛奶室溫封閉4 h(或4 ℃過夜)；一抗室溫孵育4 h(或4 ℃過夜)；TPBS洗滌3 次；二抗室溫孵育2 h；TPBS洗滌3次；ECL發(fā)光試劑盒發(fā)光，凝膠成像系統(tǒng)獲取圖像。

1.10 統(tǒng)計學(xué)方法 采用方差分析和q檢驗。

2 結(jié)果

2.1 3-BrPA、順鉑及3-BrPA聯(lián)用順鉑對HNE1細(xì)胞增殖的影響 3-BrPA(20、40、80、160、320 μmol/L)、順鉑(2、4、8、16、32 μmol/L)以及80 μmol/L 3-BrPA聯(lián)合不同濃度順鉑(2、4、8、16、32 μmol/L)都能明顯抑制HNE1細(xì)胞的體外增殖活性，與對照組比較，差異有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.01)(見表1、2)。

表1 3-BrPA、順鉑對HNE1細(xì)胞增殖的影響

2.2 3-BrPA、順鉑及3-BrPA聯(lián)用順鉑對HNE1細(xì)胞集落形成能力的影響 3-BrPA+順鉑組細(xì)胞集落數(shù)明顯低于3-BrPA、順鉑單獨(dú)處理組(P<0.01)；3-BrPA、順鉑單獨(dú)處理組細(xì)胞集落數(shù)明顯低于對照組(P<0.01)(見圖1、表3)。

表2 3-BrPA聯(lián)用順鉑對HNE1細(xì)胞增殖的影響

表3 3-BrPA、順鉑及二者聯(lián)用對HNE1細(xì)胞集落形成能力的影響

2.3 3-BrPA、順鉑及3-BrPA聯(lián)用順鉑對HNE1細(xì)胞線粒體膜電位的影響 3-BrPA聯(lián)用順鉑處理細(xì)胞24 h，與3-BrPA、順鉑單獨(dú)處理組相比，紅色熒光向綠色熒光轉(zhuǎn)變明顯(見圖2)。

2.4 3-BrPA、順鉑及3-BrPA聯(lián)用順鉑對HNE1細(xì)胞細(xì)胞核的影響 3-BrPA聯(lián)用順鉑處理細(xì)胞24 h，與3-BrPA、順鉑單獨(dú)處理組相比，核碎裂及核固縮明顯增多(見圖3)。

2.5 3-BrPA、順鉑及3-BrPA聯(lián)用順鉑對HNE1細(xì)胞凋亡的影響 3-BrPA聯(lián)用順鉑處理HNE1細(xì)胞24 h，細(xì)胞凋亡率明顯高于3-BrPA、順鉑單獨(dú)處理組(P<0.01)；3-BrPA、順鉑單獨(dú)處理組細(xì)胞凋亡率明顯高于對照組(P<0.01)(見圖4、表4)。

表4 3-BrPA、順鉑及二者聯(lián)用對HNE1細(xì)胞凋亡的影響

2.6 3-BrPA、順鉑及3-BrPA聯(lián)用順鉑對HNE1細(xì)胞內(nèi)ATP水平的影響 3-BrPA聯(lián)用順鉑處理細(xì)胞24 h，細(xì)胞內(nèi)ATP水平明顯低于3-BrPA、順鉑單獨(dú)處理組，3-BrPA、順鉑單獨(dú)處理組明顯低于對照組(P<0.01)(見表5)。

表5 3-BrPA、順鉑及二者聯(lián)用對HNE1細(xì)胞ATP水平的影響

2.7 3-BrPA、順鉑及3-BrPA聯(lián)用順鉑對HNE1細(xì)胞凋亡相關(guān)蛋白的影響 與對照組和3-BrPA、順鉑單獨(dú)處理組相比，3-BrPA+順鉑組抗凋亡蛋白Mcl-1和Bcl-2蛋白表達(dá)下調(diào)，促凋亡蛋白Bax和Bak蛋白表達(dá)上調(diào)，差異有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.05～P<0.01)(見圖5、表6)。

表6 3-BrPA、順鉑及二者聯(lián)用對HNE1細(xì)胞凋亡相關(guān)蛋白表達(dá)的影響

3 討論

腫瘤在形成和生長的過程中，其各種生物代謝過程與正常組織明顯不同[15-17]，能量代謝異常是腫瘤的典型特征之一[18-19]。3-BrPA是一種糖酵解抑制劑，能在體外抑制多種腫瘤細(xì)胞的生長[20-22]，它不僅可以靶向糖酵解過程，還可以抑制腫瘤細(xì)胞中線粒體氧化磷酸化和ATP的產(chǎn)生[23-25]。代謝改變被廣泛認(rèn)為是癌癥的標(biāo)志之一，其中惡性腫瘤細(xì)胞表現(xiàn)出Warburg效應(yīng)，這是加速ATP生成的主要糖酵解表型現(xiàn)象[26-27]。越來越多的證據(jù)表明，3-BrPA能通過靶向多種代謝分子，產(chǎn)生顯著的腫瘤特異性細(xì)胞毒性，主要通過其抑制ATP的生成[28]。由于腫瘤細(xì)胞增殖需要消耗大量能量來完成蛋白質(zhì)和RNA的合成、DNA復(fù)制和細(xì)胞質(zhì)分裂等[29]，因此，腫瘤細(xì)胞可能通過各種方式對ATP的消耗敏感。本研究結(jié)果顯示，3-BrPA聯(lián)用順鉑處理HNE1細(xì)胞后，其體外增殖明顯受抑制，且細(xì)胞內(nèi)ATP水平明顯降低。

Bcl-2家族蛋白通過線粒體途徑調(diào)節(jié)細(xì)胞凋亡[30]。Bcl-2蛋白作為細(xì)胞凋亡關(guān)鍵的抑制因子之一，使其成為一些藥物的有效作用靶點(diǎn)。Mcl-1與Bcl-2在結(jié)構(gòu)和功能上相似，能保護(hù)線粒體膜的完整性，在調(diào)節(jié)腫瘤細(xì)胞凋亡中起重要作用，Mcl-1已被證明是調(diào)節(jié)細(xì)胞凋亡的重要分子之一[31]。Bax和Bak蛋白主要通過調(diào)控各種凋亡誘導(dǎo)因子來發(fā)揮調(diào)節(jié)腫瘤細(xì)胞凋亡的作用[32]。本研究Western blotting結(jié)果表明，3-BrPA聯(lián)用順鉑處理HNE1細(xì)胞，相對于3-BrPA、順鉑單獨(dú)處理組，Bcl-2和Mcl-1蛋白表達(dá)下調(diào)，Bax和Bak蛋白表達(dá)上調(diào)，提示3-BrPA增強(qiáng)HNE1細(xì)胞對順鉑誘導(dǎo)凋亡的敏感性，其機(jī)制可能與調(diào)節(jié)凋亡相關(guān)蛋白的表達(dá)有關(guān)。

綜上所述，3-BrPA能誘導(dǎo)HNE1細(xì)胞凋亡，并能增強(qiáng)HNE1細(xì)胞對順鉑的敏感性，其機(jī)制可能與降低細(xì)胞內(nèi)ATP水平以及下調(diào)Mcl-1和Bcl-2表達(dá)，上調(diào)Bak和Bax蛋白的表達(dá)有關(guān)。