王雷雷　戴勤學(xué)

[摘要] 目的 探討人參皂苷Rb1是否可以增加腦缺血再灌注損傷小鼠腦梗死半暗帶區(qū)LncRNA Malat1的表達(dá)。方法 將30只C57/B6小鼠按隨機(jī)數(shù)字表法分成假手術(shù)組、模型+生理鹽水對(duì)照組、模型+人參皂Rb1組，每組10只。采用大腦中動(dòng)脈閉塞（MCAO）法建立小鼠腦缺血再灌注損傷模型。人參皂苷Rb1組和模型組大鼠在制模后即刻分別腹腔注射人參皂苷Rb1（40 mg/kg）和等量生理鹽水。再灌注損傷后24 h觀察各組小鼠的神經(jīng)行為學(xué)評(píng)分、腦梗死體積、Bcl-2蛋白表達(dá)量和LncRNA Malat1含量。 結(jié)果 與假手術(shù)組相比，模型組小鼠神經(jīng)行為學(xué)評(píng)分和腦梗死體積明顯增加（P<0.05），Bcl-2蛋白表達(dá)量和LncRNA Malat1表達(dá)水平明顯增加（P<0.05）;與模型組相比，人參皂苷Rb1組小鼠神經(jīng)行為學(xué)評(píng)分和腦梗死體積明顯減少（P<0.05），Bcl-2蛋白表達(dá)量和LncRNA Malat1表達(dá)水平進(jìn)一步增加（P<0.05）。 結(jié)論 人參皂苷Rb1可以改善MCAO小鼠的神經(jīng)行為學(xué)評(píng)分、減小腦梗死體積和增加Bcl-2蛋白表達(dá)量。人參皂苷Rb1具有腦保護(hù)作用，其可能的機(jī)制與增加小鼠腦梗死半暗帶區(qū)LncRNA Malat1的表達(dá)有關(guān)。

[關(guān)鍵詞] 人參皂苷Rb1;腦缺血再灌注損傷;LncRNA Malat1;MCAO

[中圖分類號(hào)] R285.5 ? ? ? ? ?[文獻(xiàn)標(biāo)識(shí)碼] A ? ? ? ? ?[文章編號(hào)] 1673-9701（2020）23-0041-04

Regulation effect of ginsenoside Rb1 on the expression of LncRNA Malat1 in mice with cerebral ischemia-reperfusion injury

WANG Leilei ? DAI Qinxue

The First Affiliated Hospital of Wenzhou Medical University， Wenzhou ? 325800， China

[Abstract] Objective To investigate whether ginsenoside Rb1 can increase the expression of LncRNA Malat1 in the penumbra of cerebral infarction in mice with cerebral ischemia-reperfusion injury. Methods Thirty C57/B6 mice were divided into sham operation group， model+normal saline control group， model+ginsenoside Rb1 group according to random number table method， with 10 mice in each group. The cerebral ischemia-reperfusion injury model in mice was established by using middle cerebral artery occlusion（MCAO） method. Rats in the ginsenoside Rb1 group and model group were injected intraperitoneally with ginsenoside Rb1（40 mg/kg） and the same amount of normal saline immediately after modeling. The neuroethology score， cerebral infarction volume， Bcl-2 protein expression and LncRNA Malat1 content of mice in each group were observed 24 hours after reperfusion injury. Results Compared with those of the sham operation group， the neurobehavior score and cerebral infarction volume of the model group were significantly increased（P<0.05）， the expression levels of Bcl-2 protein and LncRNA Malat1 were significantly increased（P<0.05）. Compared with those of the model group， the neurobehavioral score and cerebral infarction volume of the ginsenoside Rb1 group were significantly reduced（P<0.05）， and the expression levels of Bcl-2 protein and LncRNA Malat1 were further increased（P<0.05）. Conclusion Ginsenoside Rb1 can improve the neuroethology， reduce the volume of cerebral infarction and increase the expression of Bcl-2 protein in MCAO mice. Ginsenoside Rb1 has a protective effect， and its possible mechanism is related to the increased expression of LncRNA Malat1 in the penumbra of cerebral infarction in mice.

[Key words] Ginsenoside Rb1; Cerebral ischemia-reperfusion injury; LncRNA Malat1; MCAO

中風(fēng)是全球死亡的主要原因之一，也是長(zhǎng)期致殘的主要原因[1]。盡管許多中風(fēng)治療的臨床試驗(yàn)已經(jīng)完成，但迄今為止唯一有效的治療方法是溶栓治療，其僅在狹窄的時(shí)間窗內(nèi)有效。臨床環(huán)境中有效治療的發(fā)展受到多種原因的嚴(yán)重限制，包括缺血后腦損傷的快速發(fā)展、信號(hào)通路之間復(fù)雜的相互作用以及特定靶標(biāo)的治療窗口[2]。人參皂苷是一類特殊的三萜皂苷，可治療多種炎癥信號(hào)通路失調(diào)的疾病。人參皂苷Rb1，是從人參提取出的最豐富的生物活性形式[3]，具有腦保護(hù)作用[4，5]。長(zhǎng)鏈非編碼RNA Malat1是研究最廣泛的LncRNA之一。Malat1 RNA的3'末端形成獨(dú)特的三螺旋結(jié)構(gòu)，能夠保護(hù)其3'末端免受3'-5'外切核酸酶的影響[6]。研究報(bào)道LncRNA Malat1在糖氧剝奪后培養(yǎng)的腦微血管內(nèi)皮細(xì)胞和缺血性卒中后的小鼠中發(fā)揮抗凋亡和抗炎作用[7]。另有研究報(bào)道，LncRNA Malat1通過調(diào)節(jié)MDM2和p53信號(hào)通路影響缺血性卒中，為缺血性卒中患者提供更有效的臨床治療策略[8]。總的來說，這些結(jié)果表明Malat1在缺血性卒中中起著重要的保護(hù)作用。然而人參皂苷Rb1對(duì)LncRNA的調(diào)控效應(yīng)近年來未有報(bào)道。本實(shí)驗(yàn)觀察人參皂苷Rb1對(duì)MCAO小鼠腦梗死半暗帶區(qū)LncRNA Malat1的表達(dá)，為人參皂苷Rb1的腦保護(hù)機(jī)制探討新的機(jī)制，現(xiàn)報(bào)道如下。

1 材料與方法

1.1儀器與試劑

人參皂苷Rb1（上海同田生物技術(shù)有限公司，批號(hào)：10073425）;2，3，5-氯化三苯基四氮唑（2，3，5-triphenyltetrazolium chloride，TTC） 溶液（美國(guó)Sigma化學(xué)試劑公司）;蛋白定量 BCA 試劑盒（Thermo 科技公司）;多波長(zhǎng)酶標(biāo)儀（美國(guó) Bio-TEK 公司）;0.9%氯化鈉溶液;4%水合氯醛;PCR試劑盒（美國(guó)賽默飛世爾科技）。

1.2 動(dòng)物選擇與分組

健康雄性C57/B6小鼠48只，體重（22±3）g，動(dòng)物編碼：2017010422641。由溫州醫(yī)科大學(xué)動(dòng)物房提供，飼養(yǎng)于標(biāo)準(zhǔn)動(dòng)物房中并自由覓食。手術(shù)前一日禁食但不禁飲。將30只小鼠按隨機(jī)區(qū)組的原則分為三組：假手術(shù)組、模型+生理鹽水對(duì)照組、模型+人參皂苷Rb1組，每組10只。

1.3 小鼠局灶性腦缺血模型

雄性C57/B6小鼠，由溫州醫(yī)科大學(xué)實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心提供，動(dòng)物使用許可證號(hào)：SYXK（浙）2015-0009。將小鼠圈養(yǎng)在環(huán)境受控的室內(nèi)，在12 h光照/黑暗循環(huán)下，隨意自由獲取食物和水。按照大腦中動(dòng)脈栓塞（Middle cerebral artery occlusion，MCAO）法建立小鼠腦缺血再灌注損傷模型[9]，小鼠全身麻醉（10%水合氯醛，0.3 mL/100g，i.p.）后仰臥位固定，取出頸部毛發(fā)后，頸部正中切口，逐步分離右側(cè)頸內(nèi)動(dòng)脈與頸外動(dòng)脈，并將頸外動(dòng)脈結(jié)扎并剪斷，然后再拉直頸內(nèi)動(dòng)脈與頸外動(dòng)脈成一條直線。將專用的線栓（線頭直徑為0.32 mm）由頸外動(dòng)脈斷端處插入，經(jīng)頸總動(dòng)脈進(jìn)入大腦中動(dòng)脈起始處。栓塞1 h后拔出線栓，形成缺血再灌注損傷模型，切口處結(jié)扎縫合。當(dāng)小鼠蘇醒后進(jìn)行神經(jīng)行為學(xué)評(píng)分（標(biāo)準(zhǔn)見1.5），評(píng)分≥1分則視為制模成功。假手術(shù)組動(dòng)物接受與MCAO相同的頸動(dòng)脈手術(shù)暴露。再灌注24 h后取出小鼠的腦梗死半暗帶區(qū)和腦組織用于進(jìn)一步分析。

1.4 人參皂苷Rb1給藥方法

將人參皂苷Rb1粉末溶解于生理鹽水中配置成2 mg/mL注射液。人參皂苷Rb1組的小鼠在模型建立成功后立刻注射人參皂苷Rb1注射液（40 mg/kg，i.p.）[10]，假手術(shù)組的小鼠腹腔注射等量生理鹽水，其他操作同模型組小鼠。

1.5 神經(jīng)行為學(xué)評(píng)分

采用單盲法在腦缺血再灌注損傷24 h時(shí)對(duì)各組小鼠行神經(jīng)行為學(xué)評(píng)分[9]。具體評(píng)分標(biāo)準(zhǔn)：0分：無功能障礙;1分：造模對(duì)側(cè)前肢不能伸展;2分：向左側(cè)旋轉(zhuǎn)圈;3分：左側(cè)傾倒;4分：沒有自主活動(dòng)并伴有意識(shí)障礙。

1.6 小鼠腦梗死體積測(cè)定方法

再灌注24 h時(shí)，小鼠麻醉斷頭處理，在冰面上取出腦組織，將腦組織放置在腦模具中進(jìn)行冠狀切片，置于氯化三苯四唑（TTC）溶液中常溫浸泡20 min，未染色部分（白色）為腦梗死區(qū)域，染色為紅色的部分為正常組織。用照相機(jī)拍照后存儲(chǔ)于電腦上，再用Image-Plus 6.0軟件進(jìn)行分析。腦梗死體積（%）=腦梗死體積/全腦體積×100%。

1.7 定量實(shí)時(shí)PCR

用Trizol法從小鼠腦梗死半暗帶區(qū)（1 mL/100 mg）提取總RNA。在測(cè)量單鏈RNA的濃度后，使用隨機(jī)六聚體（Thermo fisher scientific）在以下條件下合成cDNA：25℃下5 min，42℃下60 min和70℃下5 min。使用iTap Universal SYBR Green supermix（Bio-Rad）和以下引物進(jìn)行實(shí)時(shí)RT-PCR： Malat1 forward（5'-GGCGGAATTGCTGGTAGTTT-3'）; Malat1 reverse（5'-AGCATAGCAGTACACGCCTT-3'）;GAPDH forward（5'-GGTTGTCTCCTGCGACTTCA-3'）;GAPDH reverse（5'-TGGTCCAGGGTTTCTTACTCC-3'）。使用以下條件進(jìn)行PCR反應(yīng)：95℃3 min，39個(gè)循環(huán)95℃10 s，55℃30 s。在CFX96實(shí)時(shí)PCR檢測(cè)系統(tǒng)（Bio-Rad）上進(jìn)行反應(yīng)，并用CFX Manager軟件（Bio-Rad）分析結(jié)果。采用相對(duì)定量法（△△Ct法）進(jìn)行半定量分析，目的基因的相對(duì)表達(dá)量用2-△△Ct數(shù)值表示。

1.8 Western Blot法檢測(cè)腦梗死半暗帶區(qū)Bcl-2蛋白表達(dá)量

各組大鼠再灌注損傷24 h時(shí)處死取出腦梗死半暗帶區(qū)?？偟鞍椎奶崛〔捎眉?xì)胞蛋白提取試劑盒，按照說明書的步驟操作。等量樣品經(jīng)聚偏二氟乙烯膜分離蛋白轉(zhuǎn)移至NC膜上，轉(zhuǎn)移后的NC膜經(jīng)BSA孵育1 h，再封閉后，分別加入Bcl-2抗體單克隆抗體，4℃孵育12 h。室溫下?lián)u床沖洗，再孵育二抗后顯影、成像。β-actin作為內(nèi)參對(duì)照。應(yīng)用Alphaimager 2200凝膠圖像處理系統(tǒng)分析目的蛋白。蛋白表達(dá)水平用目的蛋白條帶光密度值與β-actin條帶光密度值的比值來表示。

1.9 統(tǒng)計(jì)學(xué)分析

使用GraphPad Prism 7.0軟件分析，計(jì)量資料以均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差（x±s）表示。使用單向ANOVA和雙向ANOVA，然后進(jìn)行方差分析檢驗(yàn)。神經(jīng)行為學(xué)評(píng)分采用中位數(shù)（范圍）表示，組間比較采用非參數(shù)秩和檢驗(yàn) Kruskal-Wallis法，兩兩比較用Nemenyi法。P<0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 人參皂苷 Rb1可以改善MCAO小鼠神經(jīng)行為學(xué)評(píng)分

評(píng)估再灌注后24 h時(shí)MCAO小鼠神經(jīng)行為學(xué)評(píng)分。與假手術(shù)組相比，模型組小鼠神經(jīng)行為學(xué)評(píng)分明顯增加，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P<0.05）;與模型組相比，人參皂苷Rb1組小鼠神經(jīng)行為學(xué)評(píng)分明顯減少，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P<0.05），見表1。

2.2 人參皂苷 Rb1減少M(fèi)CAO小鼠腦梗死體積

評(píng)估再灌注后24 h時(shí)MCAO小鼠腦梗死體積。與假手術(shù)組相比，模型組小鼠腦梗死體積明顯增加，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P<0.05）;與模型組相比，人參皂苷Rb1組小鼠腦梗死體積明顯減少，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P<0.05），見表2、封三圖7。

2.3 人參皂苷Rb1增加MCAO小鼠腦梗死半暗帶區(qū)Bcl-2蛋白表達(dá)量

評(píng)估再灌注后24 h后小鼠腦梗死半暗帶區(qū)Bcl-2蛋白表達(dá)量。與假手術(shù)組相比，模型組Bcl-2蛋白表達(dá)量增加，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P<0.05）;人參皂苷Rb1組Bcl-2蛋白表達(dá)量較模型組明顯增加，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P<0.05），見表2、圖1。

2.4人參皂苷 Rb1增加MCAO小鼠腦梗死半暗帶區(qū)LncRNA Malat1的表達(dá)

評(píng)估再灌注后24 h后小鼠腦梗死半暗帶區(qū)LncRNA Malat1的表達(dá)。與假手術(shù)組相比，模型組LncRNA Malat1表達(dá)水平增加，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P<0.05）;人參皂苷Rb1組LncRNA Malat1表達(dá)水平較模型組明顯增加，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P<0.05），見表2。

表2 ? 各組小鼠腦梗死體積、Bcl-2蛋白表達(dá)量、LncRNA Malat1表達(dá)水平比較（x±s）

注：與假手術(shù)組比較，*P<0.05;與模型組比較，#P<0.05

3 討論

越來越多的證據(jù)表明LncRNAs是生理和病理反應(yīng)的重要調(diào)節(jié)因子[11，12]。最近，表觀基因組學(xué)的進(jìn)展正集中于缺血性卒中LncRNAs的神經(jīng)保護(hù)作用[13]。據(jù)研究報(bào)道成年大鼠經(jīng)短暫MCAO后LncRNA FosDT表達(dá)增加，且LncRNA FosDT 敲除后可顯著改善缺血后運(yùn)動(dòng)障礙，并減少梗死體積[14]。LncRNA Malat1首次報(bào)道是與肺腫瘤的轉(zhuǎn)移相關(guān);Ji P等[15]發(fā)現(xiàn)，Malat1的表達(dá)與非小細(xì)胞肺癌患者的轉(zhuǎn)移顯著相關(guān)。在一項(xiàng)RNA測(cè)序研究中，Malat1首次報(bào)道參與了腦微血管缺血損傷后的保護(hù)作用;體外模擬缺血性卒中條件的缺氧-葡萄糖剝奪（OGD）后，培養(yǎng)的腦血管內(nèi)皮細(xì)胞（BMECs）中Malat1水平升高;短暫MCAO 1 h和再灌注24 h后，小鼠大腦微血管中的Malat1水平也升高[14]。Malat1敲除顯著增加糖氧剝奪誘導(dǎo)的內(nèi)皮細(xì)胞死亡，且Malat1敲除顯著增加小鼠局灶性缺血后梗死體積，加重神經(jīng)功能缺損[7]。結(jié)果表明LncRNA Malat1在開發(fā)新的卒中治療具有巨大的潛力。

人參皂苷是人參根中主要的生物活性化合物，具有抗氧化、免疫調(diào)節(jié)和抗炎活性。大量的研究證實(shí)人參皂苷Rb1腦保護(hù)作用的存在。人參皂苷Rb1通過激活PI3K/Akt通路抑制自噬有助于保護(hù)神經(jīng)元免受缺血性損傷[16]。血腦屏障可使腦組織少受甚至不受循環(huán)血液中有害物質(zhì)的損害，從而保持腦組織內(nèi)環(huán)境的基本穩(wěn)定，對(duì)維持中樞神經(jīng)系統(tǒng)正常生理狀態(tài)具有重要的生物學(xué)意義[17]。Chen W等[18]發(fā)現(xiàn)ICR小鼠接受MCAO并在再灌注后3 h通過腹膜內(nèi)注射接受GS-Rb1，可抑制血腦屏障的破壞，增加緊密連接蛋白（跨膜蛋白、細(xì)胞質(zhì)輔助蛋白）的表達(dá)，抑制MMP-9和NOX4衍生的自由基來保護(hù)缺血性卒中血腦屏障完整性的喪失，發(fā)揮腦損傷治療作用。本研究顯示人參皂苷Rb1可以改善MCAO小鼠的神經(jīng)行為學(xué)評(píng)分、減少腦梗死體積以及增加腦梗死半暗帶區(qū)Bcl-2蛋白表達(dá)量，說明人參皂苷Rb1對(duì)MCAO小鼠具有腦保護(hù)作用，但具體的機(jī)制并不完全明確。

本研究顯示，人參皂苷Rb1增加腦缺血再灌注損傷小鼠腦梗死半暗帶區(qū)LncRNA Malat1的表達(dá)水平。因此，人參皂苷Rb1對(duì)腦缺血再灌注損傷小鼠的腦保護(hù)作用可能是通過上調(diào)LncRNA Malat1表達(dá)來實(shí)現(xiàn)的。但本研究也有不足之處，對(duì)其下游分子未做進(jìn)一步研究。Xu Y等[19]報(bào)道LncRNA Malat1可通過下調(diào)miR-145和上調(diào)SOX9來促進(jìn)結(jié)直腸癌細(xì)胞的增殖、侵襲和遷移，并抑制細(xì)胞周期和凋亡。徐慧等[20]報(bào)道人參皂苷Rb1可以通過減少M(fèi)CAO大鼠腦組織中miR-145含量，從而上調(diào)SOD活性，最終對(duì)MCAO大鼠產(chǎn)生腦保護(hù)作用。因此，人參皂苷Rb1可能通過上調(diào)LncRNA Malat1含量，競(jìng)爭(zhēng)性結(jié)合miR-145發(fā)揮海綿作用，從而增加MCAO小鼠腦組織SOD活性，進(jìn)而產(chǎn)生腦保護(hù)作用。但其結(jié)論還有待進(jìn)一步研究。

綜上所述，人參皂苷Rb1可以改善MCAO小鼠的神經(jīng)行為學(xué)評(píng)分、減小腦梗死體積以及增加腦梗死半暗帶區(qū)Bcl-2蛋白表達(dá)量。人參皂苷Rb1具有腦保護(hù)作用，其可能的機(jī)制與增加小鼠腦梗死半暗帶區(qū)LncRNA Malat1的表達(dá)有關(guān)。

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（收稿日期：2020-03-27）