李羚榕　劉玉梅　匙峰　陳真勇

[摘要] 干細(xì)胞因來源廣泛、可自我更新、擁有多向分化潛能等優(yōu)點(diǎn)，目前已廣泛用于組織修復(fù)實(shí)驗(yàn)和臨床研究，特別是在骨缺損修復(fù)中展現(xiàn)出良好的應(yīng)用前景。在骨組織工程中，干細(xì)胞作為缺損修復(fù)支架的組成要素，為缺損修復(fù)提供細(xì)胞來源和活性基礎(chǔ)，因此探究骨缺損修復(fù)中干細(xì)胞成骨分化的主要調(diào)控因素尤為重要。本文將從支架的材料組成、材料表面微觀結(jié)構(gòu)、空間宏觀結(jié)構(gòu)、外源性藥物、體外刺激等因素綜述骨組織工程中干細(xì)胞成骨分化調(diào)控因素、作用機(jī)理與研究進(jìn)展，為骨缺損修復(fù)的基礎(chǔ)研究與臨床應(yīng)用提供新思路。

[關(guān)鍵字] 骨缺損修復(fù);干細(xì)胞;成骨分化;支架;刺激

[中圖分類號] R318 ? ? ? ? ?[文獻(xiàn)標(biāo)識碼] A ? ? ? ? ?[文章編號] 1673-9701（2020）23-0186-07

Research progress of regulatory factors of osteogenic differentiation of stem cells in repairing bone defects

LI Lingrong1， 2 LIU Yumei1， 3 SHI Feng1， 2 CHEN Zhenyong1， 2

1.West China Normal University， Collaborative Innovation Center for Organization and Repair Materials Engineering Technology， Nanchong ? 637009， China; 2.School of Life Science， West China Normal University， Nanchong ? 637009， China; 3.School of Environmental Science and Engineering， West China Normal University， Nanchong ? 637009， China

[Abstract] Stem cells have been widely used in tissue repair experiments and clinical research specially showing good application prospects in bone defect repair， due to their advantages of wide source， self-renewal， and multi-directional differentiation potential. In bone tissue engineering， stem cells， as a component of defect repair scaffolds， provide cell source and active basis for defect repair. Therefore， it is particularly important to explore the main regulatory factors of stem cell osteogenic differentiation in bone defect repair. In this article， we will review the regulatory factors， mechanism and research progress of osteogenic differentiation of stem cells in bone tissue engineering from the factors such as the material composition of the scaffold， the microstructure of the surface of the material， the macroscopic structure of the space， the exogenous drugs， and in vitro stimulation. This provides a new idea for the basic research and clinical applications of bone defect repair.

[Key words] Bone defect repair; Stem cells; Osteogenic differentiation; Scaffold; Stimulation

因骨腫瘤疾病、交通意外創(chuàng)傷、人口老齡化等原因?qū)е碌墓侨睋p使臨床對修復(fù)材料的需求巨大[1]。自體骨、異體骨和人工骨等材料被骨科醫(yī)生用來修復(fù)骨缺損。自體骨由于其良好的骨誘導(dǎo)和骨整合能力，是骨移植的“金標(biāo)準(zhǔn)”，但自體骨供應(yīng)有限，二次手術(shù)中易出現(xiàn)額外的失血量和潛在的并發(fā)癥，使感染風(fēng)險和手術(shù)并發(fā)癥的機(jī)率上升，導(dǎo)致住院時間和康復(fù)時間延長;而異體骨作為自體骨的替代，本身的免疫原性可能會導(dǎo)致免疫排斥，還會造成延遲愈合和感染等并發(fā)癥[2]。臨床骨缺損修復(fù)材料需求不斷增加和供應(yīng)量的明顯不足間矛盾，推動了利用骨組織工程技術(shù)研發(fā)人工骨材料的發(fā)展，為骨缺損修復(fù)提供替代方案[3]。

骨組織工程的核心三要素為生物支架、活性因子和種子細(xì)胞。其中，種子細(xì)胞是骨組織工程中具有生命活性的因素，一方面作為骨組織再生的細(xì)胞基礎(chǔ)，為骨缺損修復(fù)提供細(xì)胞來源，分泌骨相關(guān)細(xì)胞外基質(zhì)，加速骨愈合過程;另一方面作為骨組織再生過程中作用對象，受到支架、活性因子、外界刺激等因素調(diào)控，向成骨、成軟骨等方向轉(zhuǎn)化。干細(xì)胞因來源廣泛、可自我更新、具有多向分化潛能等優(yōu)勢，成為骨組織工程最主要的種子細(xì)胞來源[4]。在骨組織工程中，作為種子細(xì)胞的干細(xì)胞主要通過增殖并分化為成骨細(xì)胞，分泌相關(guān)細(xì)胞外基質(zhì)和活性因子為骨缺損修復(fù)提供活性來源和物質(zhì)基礎(chǔ)。近年來，如何誘導(dǎo)干細(xì)胞向成骨細(xì)胞分化，促進(jìn)骨缺損修復(fù)是骨組織工程研究的熱點(diǎn)之一[5]。利用骨組織工程技術(shù)修復(fù)骨缺損的過程中，干細(xì)胞的成骨分化不僅受到支架載體、成骨誘導(dǎo)因子等調(diào)控，而且會受到體內(nèi)炎癥細(xì)胞、破骨細(xì)胞等細(xì)胞間調(diào)節(jié)作用影響。此外，體外外加微振動、磁場等物理刺激被譽(yù)為骨組織工程的第四因素，也具有一定促進(jìn)作用[6]。本文針對骨組織工程中干細(xì)胞成骨分化的諸多調(diào)控因素進(jìn)行分類整理并探討其影響機(jī)制。

1 生物支架

利用干細(xì)胞構(gòu)建骨修復(fù)材料，需要適宜的轉(zhuǎn)運(yùn)載體。生物支架作為骨缺損填充的物理結(jié)構(gòu)，一方面作為干細(xì)胞的載體，承載并保護(hù)干細(xì)胞植入患者缺損處，為干細(xì)胞的黏附生長提供適宜的空間結(jié)構(gòu)，另一方面通過支架材料組成、支架表面微觀結(jié)構(gòu)和支架空間宏觀孔隙等因素調(diào)控干細(xì)胞的分化。

1.1 支架材料組成

目前用于骨組織工程的生物支架材料主要包括金屬、高分子和無機(jī)陶瓷。其中無機(jī)陶瓷材料，特別是磷酸鈣陶瓷材料如羥基磷灰石（Hydroxyapatite，HA）、磷酸三鈣（Tricalcium phosphate，TCP）、雙相磷酸鈣（Biphasic calcium phosphate，BCP）等與體內(nèi)骨無機(jī)成分近似受到廣泛關(guān)注[7]。大量研究表明干細(xì)胞成骨分化受到支架材料化學(xué)特性的影響。首先，支架材料的表面電荷以靜電作用力利于干細(xì)胞的表面黏附和富集，還促進(jìn)體內(nèi)骨相關(guān)生長因子的吸附，提高局部因子濃度，誘導(dǎo)材料表面黏附的干細(xì)胞的成骨分化[8];其次，支架材料降解，特別是磷酸鈣材料產(chǎn)生的Ca2+、PO43-離子，一方面為骨重建提供無機(jī)離子，另一方面通過細(xì)胞的鈣敏感受體、蛋白激酶C及細(xì)胞外信號調(diào)節(jié)激酶1/2等信號通路刺激其成骨分化[9]。

為增強(qiáng)材料的生物活性，可采用離子摻雜等手段將具有生物活性鎂、鈷、硼等離子引入磷酸鈣材料內(nèi)?；钚噪x子在植入部位的緩慢釋放可刺激干細(xì)胞分化。張芝祥等[10]將鎂離子引入骨水泥體系中，發(fā)現(xiàn)鎂的摻入未改變骨水泥的理化性能，且鎂可促進(jìn)細(xì)胞的增殖和成骨分化，利于骨組織修復(fù)。

1.2 支架自身硬度

由于材料性質(zhì)差異，導(dǎo)致材料硬度有所不同。干細(xì)胞在其表面生長、增殖和成骨分化必然與材料間存在著生物-材料硬度作用[11]。Engler AJ等[12]通過將骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞（Bone marrow mesenchymal stem cells，BMSCs）培養(yǎng)于聚丙烯酰胺水凝膠表面，調(diào)節(jié)水凝膠交聯(lián)情況，改變干細(xì)胞感受的硬度（25～40 kPa），在沒有誘導(dǎo)因子的條件下發(fā)現(xiàn)，BMSCs在類骨質(zhì)硬度環(huán)境中呈現(xiàn)與成骨細(xì)胞相似的多角形，并且成骨細(xì)胞標(biāo)志分子Runt相關(guān)轉(zhuǎn)錄因子（Runt-related transcription factor 2，RUNX2）表達(dá)水平上調(diào)，結(jié)果表明基底硬度對骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞成骨分化有一定調(diào)控作用。Xue R等[13]也通過類似實(shí)驗(yàn)，發(fā)現(xiàn)（40.0±3.6）kPa的硬基底上成骨分化相關(guān)基因堿性磷酸酶、膠原蛋白和Runx2的基因表達(dá)水平明顯升高，進(jìn)一步證實(shí)了基底硬度對BMSCs的成骨分化有一定調(diào)控作用。

1.3 生物支架表面微觀結(jié)構(gòu)

干細(xì)胞在支架內(nèi)黏附、生長和成骨分化，首先是與生物支架的表面相接觸。支架表面微觀結(jié)構(gòu)可為干細(xì)胞的黏附、生長提供特異性接觸位點(diǎn)，在微納米尺度范圍內(nèi)與單個或數(shù)個細(xì)胞直接接觸，直接影響干細(xì)胞個體的成骨分化，最終影響整體骨修復(fù)材料的成骨效果[14]。通過生物支架表面構(gòu)建微觀結(jié)構(gòu)，一方面可增加材料自身的比表面積，利于材料內(nèi)有效離子溶出和促成骨生長因子吸附，促進(jìn)干細(xì)胞成骨分化;另一方面改變細(xì)胞微觀形狀、微觀受力等刺激，經(jīng)信號通路傳導(dǎo)至細(xì)胞內(nèi)，影響干細(xì)胞成骨分化。生物支架表面微觀結(jié)構(gòu)主要包括微孔結(jié)構(gòu)、粗糙度結(jié)構(gòu)、微納米結(jié)構(gòu)和微圖形結(jié)構(gòu)。

1.3.1 微孔結(jié)構(gòu) ?天然骨組織內(nèi)部分布眾多微孔結(jié)構(gòu)，研究者從仿生角度出發(fā)，在支架內(nèi)部構(gòu)建微孔結(jié)構(gòu)以獲得更優(yōu)的骨修復(fù)效果。Anselme K等[14]發(fā)現(xiàn)大孔BCP支架中引入微孔結(jié)構(gòu)，可以促進(jìn)體內(nèi)骨誘導(dǎo)效果，認(rèn)為是微孔引起的毛細(xì)作用影響體內(nèi)骨的生長。Polak SJ等[15]采用高分子海綿法為模板，采用不同粒徑的BCP納米顆粒漿料涂覆制備支架，然后在二次涂敷使調(diào)節(jié)BCP混合顆粒比例和燒結(jié)溫度，可以構(gòu)建出不同密度的微孔結(jié)構(gòu)。成骨細(xì)胞的體外研究表明，具有微孔結(jié)構(gòu)支架提高了細(xì)胞的擴(kuò)散、增殖和分化的能力，并優(yōu)選出最適宜的微孔直徑范圍為1～5 μm。Polak SJ等[15]發(fā)現(xiàn)材料表面微孔結(jié)構(gòu)被溶液封閉時，對細(xì)胞黏附、增殖和分化的促進(jìn)作用會減弱，且體內(nèi)實(shí)驗(yàn)也表明封閉材料表面微孔結(jié)構(gòu)會減弱其成骨效果。雖然微孔促進(jìn)干細(xì)胞成骨分化和新骨形成的確切機(jī)制仍不明確，但可能的相關(guān)機(jī)制有以下幾種[15，16]。首先，微孔可顯著提高支架的比表面積，提高支架的滲透性，提供更多的蛋白吸附位點(diǎn)，促進(jìn)支架的降解。其次，支架的表面粗糙度、表面自由能、表面電荷、化學(xué)功能等表面性質(zhì)在干細(xì)胞的成骨分化中也起著重要作用。第三，微孔產(chǎn)生的毛細(xì)管力可將干細(xì)胞錨定在基質(zhì)表面，使細(xì)胞變形并將其拉入比細(xì)胞更小的微孔中。適當(dāng)?shù)奈⒖茁士纱龠M(jìn)干細(xì)胞的成骨分化，但過高會影響支架的力學(xué)性能[17]。宏孔與微孔結(jié)合對干細(xì)胞的分化具有協(xié)同促進(jìn)作用，但現(xiàn)有制備工藝和方法難以在支架表面構(gòu)建理想可控的微孔結(jié)構(gòu)，是目前亟待解決的問題之一。

1.3.2 粗糙度結(jié)構(gòu) ?骨與植入支架成功融合與支架材料的表面粗糙度結(jié)構(gòu)有很大的關(guān)系，支架材料表面粗糙結(jié)構(gòu)可調(diào)節(jié)間充質(zhì)干細(xì)胞的骨橋蛋白、骨鈣素的基因表達(dá)，促進(jìn)其成骨分化。Yang W等[18]用不同型號的砂紙打磨HA片表面，制得不同粗糙度表面，接種干細(xì)胞發(fā)現(xiàn)相比光滑表面，粗糙表面一方面促進(jìn)干細(xì)胞的黏附和鋪展，另一方面刺激相關(guān)信號通路促進(jìn)干細(xì)胞成骨分化。Wu F等[19]發(fā)現(xiàn)材料表面粗糙度到納米級別可影響材料表面的電荷分布，從而引起表面吸附的纖連蛋白構(gòu)象改變，進(jìn)而影響細(xì)胞的黏附程度和細(xì)胞因子的分泌。

1.3.3 微納米結(jié)構(gòu) ?微納米復(fù)合結(jié)構(gòu)是一種通過模擬骨基質(zhì)的三維結(jié)構(gòu)促進(jìn)干細(xì)胞成骨分化的生物材料特性。Xia L等[20]以α-TCP或HA支架為前驅(qū)體，利用鈣磷溶液水熱處理制作成表面納米片、納米棒和微納米棒組合結(jié)構(gòu)形貌修飾HA材料，研究以上支架材料對BMSCs成骨分化的影響，結(jié)果發(fā)現(xiàn)多級微納米棒復(fù)合結(jié)構(gòu)形貌相比其他兩組納米結(jié)構(gòu)明顯促進(jìn)干細(xì)胞成骨分化。本課題組前期采用有機(jī)小分子和無機(jī)銅離子共同調(diào)控HA形貌，得到微納米雜化結(jié)構(gòu)，采用細(xì)胞學(xué)研究發(fā)現(xiàn)其可促進(jìn)細(xì)胞成骨分化[21]。

1.3.4 微圖形結(jié)構(gòu) ?根據(jù)仿生原理，研究者提出“接觸引導(dǎo)”，即細(xì)胞接觸到納米到微米尺度的圖案時，會根據(jù)圖案結(jié)構(gòu)特性調(diào)控自身沿著圖案的方向定向生長。Kilian KA等[22]制備了與微米級的矩形、星形、五邊形等圖形，控制接種方法，并確保圖形內(nèi)單個干細(xì)胞黏附鋪展，發(fā)現(xiàn)細(xì)胞隨圖形形狀而改變自身形狀，并伴隨肌動蛋白等細(xì)胞骨架受力刺激細(xì)胞外調(diào)節(jié)蛋白激酶等信號通路影響細(xì)胞核內(nèi)基因表達(dá)。Zhao C等[23]采用不同目數(shù)的尼龍網(wǎng)篩為模具得到表面微米尺寸可控的HA表面，與傳統(tǒng)的表面平整的HA生物陶瓷相比，有序微米圖案化結(jié)構(gòu)的HA生物陶瓷具有更好的潤濕性和更高的表面能，顯著促進(jìn)BMSCs的粘附、增殖和成骨分化，且圖案化尺寸與細(xì)胞直徑最為接近時促干細(xì)胞成骨分化能力最好。

1.4 生物支架空間宏觀孔隙

干細(xì)胞在生物支架內(nèi)生長，還會受到支架空間孔隙結(jié)構(gòu)的影響。生物支架作為骨組織再生的場所，首先為細(xì)胞、血管、組織的新生和代謝提供三維空間位置和支撐，其次允許營養(yǎng)物質(zhì)、氧氣及代謝產(chǎn)物隨體液和血液循環(huán)貫穿整個支架，為干細(xì)胞生命活動提供基礎(chǔ)。總體來說，支架宏觀孔隙結(jié)構(gòu)可影響干細(xì)胞在體內(nèi)所處的微環(huán)境，進(jìn)而影響干細(xì)胞分化，最終影響其體內(nèi)成骨情況[7]。生物支架空間宏觀孔隙包括支架孔徑、孔隙率、孔形態(tài)、貫通性等，但這些方面并不是獨(dú)立存在的，而是相互影響、互有穿插。

1.4.1 孔徑 ?支架孔徑為細(xì)胞和血管向支架內(nèi)部的長入提供空間和通道，一方面影響新生血管長入，改善營養(yǎng)物質(zhì)傳輸，另一方面影響物質(zhì)擴(kuò)散，改變局部離子濃度及因子濃度，綜合影響干細(xì)胞的成骨分化和體內(nèi)骨的發(fā)育，然而最適宜的支架孔徑尚無定論。劉楠等[24]將體外原代培養(yǎng)BMSCs細(xì)胞懸液接種于孔隙率近似、孔徑范圍不同（187～830 μm）的圓盤狀多孔β-TCP材料中，發(fā)現(xiàn)不同孔徑的多孔β-TCP對體外BMSCs的成骨分化均有促進(jìn)作用，其中500～750 μm孔徑的促進(jìn)作用最為明顯。為進(jìn)一步探討孔徑因素對細(xì)胞成骨分化和骨再生的作用機(jī)制，本課題組前期采用孔隙率、貫通性近似但宏孔孔徑不同的HA支架接種BMSCs，在體外構(gòu)建動態(tài)灌流裝置以模擬體內(nèi)動態(tài)微循環(huán)環(huán)境內(nèi)研究孔徑對細(xì)胞分化影響，結(jié)果表明支架孔徑差異可調(diào)整支架內(nèi)微流場環(huán)境，從而使局部細(xì)胞感受的流體剪切力不同，通過細(xì)胞表面力學(xué)感受器傳到至細(xì)胞內(nèi)部，調(diào)節(jié)細(xì)胞分化差異[9]。

1.4.2 孔隙率和貫通性 ?孔隙率指支架內(nèi)孔隙總體積所占支架總體積的比例，通常支架孔隙率增大，其貫通性有所改善。支架良好貫通結(jié)構(gòu)是骨組織工程材料的前提，保證貫通性才能確保支架內(nèi)外成骨的一致?？紫堵试诟杉?xì)胞成骨分化中同樣扮演著重要角色，Ardeshirylajmi A等[25]利用明膠為制孔劑制備了10%、15%、20%三種孔隙率的殼聚糖支架，發(fā)現(xiàn)三種孔隙率的殼聚糖支架均促進(jìn)干細(xì)胞的增殖和分化，但孔隙率較低的支架材料（10%）成骨標(biāo)志物表達(dá)顯著高于其他孔隙率和對照組，可更好地促進(jìn)干細(xì)胞聚集釋放鈣沉積和成骨分化。推測是低孔隙率支架提高細(xì)胞密度，增加細(xì)胞間信號傳遞和細(xì)胞交流，促進(jìn)干細(xì)胞成骨分化。但并不是說孔隙率越低越好，因?yàn)樯镏Ъ艿目紫稙榧?xì)胞的生長提供空間，孔隙率過低細(xì)胞無法長入支架內(nèi)部，造成局部骨再生不足。

1.4.3 孔形態(tài) ?當(dāng)細(xì)胞在支架孔隙結(jié)構(gòu)中黏附、鋪展，直接接觸細(xì)胞的平面鋪展和空間折疊形態(tài)會受到依附的支架內(nèi)壁形態(tài)限制和改變，進(jìn)而通過生物級聯(lián)作用向孔隙中央細(xì)胞和組織傳遞刺激信號。Chu TMG等[26]對比交叉形和輻射形兩種孔形態(tài)的磷酸鈣支架在體內(nèi)成骨情況，結(jié)果表明支架孔隙形貌影響體內(nèi)成骨分布。研究發(fā)現(xiàn)，支架孔形態(tài)差異對細(xì)胞影響主要是孔內(nèi)壁的曲率半徑差異導(dǎo)致細(xì)胞受力和細(xì)胞形態(tài)改變，影響細(xì)胞的分化性能[27]。傳統(tǒng)制備方法中，支架的孔形態(tài)主要受到制備方法限制：模板法制備的支架孔形態(tài)取決于模板（如糖球/水凝膠球模板為球形孔隙[28]、鹽顆粒為方形孔隙[29]），凍干法制備的支架孔形態(tài)取決于凍干參數(shù)[30]等。而3D打印技術(shù)在支架制備中的應(yīng)用，極大的拓展了支架孔形態(tài)的樣式和分布[31]。由于制備方法差異，對于最佳孔形態(tài)無統(tǒng)一標(biāo)準(zhǔn)。

2 活性藥物

干細(xì)胞周圍的微環(huán)境與干細(xì)胞的成骨分化密切相關(guān)。支架上負(fù)載活性藥物，在缺損處具有緩控釋效果，能夠調(diào)節(jié)干細(xì)胞所處的微環(huán)境，影響干細(xì)胞的成骨分化?；钚运幬镏饕ㄉL因子、外源性藥物等。

2.1 生長因子

生物材料與生長因子結(jié)合已被證實(shí)是一種有效的方法用于骨組織修復(fù)與再生，局部應(yīng)用生長因子在早期可促進(jìn)干細(xì)胞成骨分化，但難以持續(xù)發(fā)揮其作用，故研究主要集中在新型緩釋生長因子的支架材料。目前研究較多生長因子的包括：骨形成蛋白（Bone morphogenetic protein，BMP）家族、基質(zhì)細(xì)胞源性趨化因子-1（Stromal cell-derived factor-1，SDF-1）、成纖維細(xì)胞生長因子、轉(zhuǎn)化生長因子等。其中，BMP-2是BMP家族研究最廣泛，有明確誘導(dǎo)干細(xì)胞成骨分化作用的生長因子[32]。但生長因子屬于蛋白質(zhì)類藥物，生產(chǎn)成本較高，穩(wěn)定性較差，保存條件較為苛刻，在支架裝載過程中容易變性失活，且外源性蛋白質(zhì)對于細(xì)胞分子水平的調(diào)控機(jī)制未確切了解，無法精確控制，有導(dǎo)致免疫反應(yīng)、無限增殖癌變等隱患。

2.2 外源性藥物

生長因子屬于蛋白質(zhì)類藥物，生產(chǎn)成本較高，穩(wěn)定性較差，保存條件較為苛刻，且外源性蛋白質(zhì)對于細(xì)胞分子水平的調(diào)控機(jī)制未確切了解，無法精確控制，有導(dǎo)致免疫反應(yīng)、無限增殖癌變等隱患。故另有研究者從事其他類活性藥物的應(yīng)用研究，例如地塞米松、中藥淫羊藿中提取的淫羊藿苷等。中藥作為我國傳統(tǒng)醫(yī)學(xué)和文化的瑰寶，蘊(yùn)含豐富的資源，其中有很多對骨修復(fù)有確切療效藥物亟待開發(fā)?，F(xiàn)代藥理學(xué)研究表明，淫羊藿中提取的黃酮成分淫羊藿苷具有雌性激素樣作用，可促進(jìn)成骨、保護(hù)心血管、抗炎抗病毒、抑菌抗氧化、延緩衰老、調(diào)節(jié)免疫功能等[33]。Xie Y等[34]通過將淫羊藿載入無機(jī)/有機(jī)復(fù)合的多孔支架內(nèi)，發(fā)現(xiàn)載藥支架通過對淫羊藿的局部緩控釋促進(jìn)成骨細(xì)胞成骨分化、抑制破骨細(xì)胞、促血管發(fā)生等功效，可用于骨缺損填充、股骨頭壞死治療。

近幾年，多種藥物協(xié)同作用誘導(dǎo)成骨引起了人們的廣泛關(guān)注。Zhang B等[35]利用糖球模板法制備了類似于骨小梁結(jié)構(gòu)的HA支架，利用交聯(lián)的海藻酸鈉將負(fù)載地塞米松和SDF-1的β-環(huán)糊精微球固定在HA表面，由此構(gòu)建的支架可按需釋放兩種藥物，SDF-1和地塞米松的協(xié)同作用加速促進(jìn)干細(xì)胞的成骨分化，藥物協(xié)同效果跟藥物釋放情況緊密相關(guān)。

3 體外刺激

骨骼作為人體力學(xué)支撐和保護(hù)結(jié)構(gòu)，在日常活動中會受到力、振動等生物物理性外加作用的影響。細(xì)胞作為骨骼內(nèi)重要組成，必然也承受相應(yīng)的刺激影響。生物物理性刺激（包括振動刺激、載荷、電場或磁場等）作為一種有效促進(jìn)骨缺損修復(fù)且經(jīng)濟(jì)、安全的物理輔助療法，近年來引起許多學(xué)者廣泛關(guān)注[6]。

3.1 振動刺激

振動刺激，特別是低振幅（小于50 μm）、低強(qiáng)度（1 g）、振動頻率1～100 Hz的微振動刺激模擬生理運(yùn)動狀態(tài)，促進(jìn)骨組織內(nèi)部組織液的運(yùn)動，具有良好的促進(jìn)骨組織再生效果[36，37]。Halonen HT等[38]系統(tǒng)研究了垂直振動、水平振動與復(fù)合振動對干細(xì)胞的刺激效果，結(jié)果發(fā)現(xiàn)水平振動促進(jìn)干細(xì)胞成骨分化，而垂直振動抑制干細(xì)胞的成骨分化。結(jié)合細(xì)胞內(nèi)肌動蛋白和細(xì)胞核熒光圖像分析結(jié)果，發(fā)現(xiàn)振動刺激通過肌動蛋白應(yīng)力引起細(xì)胞核的形變，從而刺激干細(xì)胞分化差異。利用合成多孔支架修復(fù)體內(nèi)骨缺損，結(jié)合振動刺激可加速新骨的形成和組織的融合[39]。

3.2 力學(xué)載荷刺激

目前，力學(xué)因素影響B(tài)MSCs成骨分化的調(diào)控機(jī)制是許多研究人員者深入研究的問題，但其調(diào)控機(jī)制仍未明確[40]。李曉亮等[41]通過對BMSCs加載不同大小機(jī)械離心力，探討機(jī)械應(yīng)力刺激對BMSCs成骨分化的影響。研究發(fā)現(xiàn)BMSCs在170～250 g間歇性機(jī)械離心力加載下堿性磷酸酶活性增高、細(xì)胞骨鈣素和Runx2等成骨相關(guān)的基因的相對表達(dá)量明顯上調(diào)，說明間歇性機(jī)械離心力大小對BMSCs的成骨分化有一定調(diào)控效果，但力學(xué)載荷需要控制在適宜范圍內(nèi)。Baumgartner W等[42]通過增加剪切力和額外的壓縮應(yīng)變對脂肪干細(xì)胞進(jìn)行過高的機(jī)械刺激，發(fā)現(xiàn)反而會引起脂肪干細(xì)胞的成脂分化。

3.3 磁場刺激

脈沖電磁場作為一種物理刺激，具有穿透能力，應(yīng)用方便，成骨作用是其最為熟知的生物學(xué)特性。Xia Y等[43]等開發(fā)出一種用于骨組織工程的新型磁性粒子-磷酸鈣骨水泥復(fù)合支架材料，在支架上植入人牙髓干細(xì)胞，研究中度磁場條件下干細(xì)胞的增殖、成骨分化情況。研究結(jié)果發(fā)現(xiàn)磁場刺激條件增強(qiáng)了新型磁性離子-骨水泥的生物相容性，堿性磷酸酶活性更高，成骨標(biāo)記基因的表達(dá)明顯上調(diào)，與純骨水泥對照和非磁性離子-骨水泥材料相比，磁性粒子的添加使大鼠下頜骨缺損的成骨活性明顯高于對照組?，F(xiàn)目前，認(rèn)為脈沖磁場影響B(tài)MSCs成骨分化的調(diào)控機(jī)制主要與激活離子通道[44]、改變骨形態(tài)發(fā)生蛋白以及激活Wnt/β-catenin信號通路等有關(guān)[45]。

3.4 電刺激

20世紀(jì)50年代發(fā)現(xiàn)骨的生物電特性以來，電刺激療法已被應(yīng)用于臨床，作為促進(jìn)骨折愈合和增強(qiáng)脊柱融合的輔助手段[46]。電刺激可有效調(diào)節(jié)細(xì)胞和組織（包括骨組織）的生長行為，電刺激對BMSCs的成骨分化也有促進(jìn)作用。但骨組織工程支架中，無機(jī)陶瓷或普通高分子材料導(dǎo)電性質(zhì)欠佳，需要額外引入介質(zhì)增加支架的導(dǎo)電能力。Ravikumar K等[47]通過在HA中加入CaTiO3，制備了導(dǎo)電HA支架，研究電刺激體外人體干細(xì)胞的分化性能。研究結(jié)果發(fā)現(xiàn)堿性磷酸酶、I型膠原和骨鈣素在電刺激下表達(dá)明顯上調(diào)。研究證實(shí)了導(dǎo)電HA-CaTiO3復(fù)合材料與間歇性電刺激能對hMSCs成骨分化具有積極影響。

4 小結(jié)

基于干細(xì)胞的骨組織工程技術(shù)是一項具有巨大應(yīng)用前景的新興技術(shù)，在骨缺損修復(fù)中促進(jìn)干細(xì)胞定向成骨分化尤為重要。盡管對于干細(xì)胞的成骨分化已經(jīng)取得一部分成果，但大多數(shù)分化研究局限于體外細(xì)胞培養(yǎng)或單一因素調(diào)控研究，缺乏綜合因素在體內(nèi)如何協(xié)同調(diào)控干細(xì)胞的成骨分化機(jī)制目尚未明確。干細(xì)胞在骨組織工程中應(yīng)用依托支架材料，但研究集中于支架的單純仿生制備卻限制了骨缺損修復(fù)速率的提高，綜合利用體內(nèi)活性因子、藥物或體外機(jī)械、磁場刺激等因素，協(xié)同提高干細(xì)胞成骨分化效果，加速骨再生能力具有巨大的研究和應(yīng)用價值。

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（收稿日期：2020-05-08）