【作 者】趙小玉，許俊杰

1 華中科技大學同濟醫(yī)學院附屬梨園醫(yī)院 器材科，武漢市，430077

2 武漢大學人民醫(yī)院，武漢市，430060

0 引言

隨著我國經(jīng)濟的快速發(fā)展，生命科學與生物技術(shù)成為我國發(fā)展最為迅速的領域之一，基因治療、疾病診斷和藥物研制的研究將對我國社會的發(fā)展產(chǎn)生深遠的影響。核酸和蛋白質(zhì)是生物體中重要的有機物。核酸是生命的最基本物質(zhì)之一，存儲生物體的全部遺傳信息，在遺傳、變異和生物體的合成中具有極其重要的作用[1]。蛋白質(zhì)是生命的物質(zhì)基礎，沒有蛋白質(zhì)就沒有生命[2]。核酸和蛋白質(zhì)的檢測在基因工程、生物醫(yī)藥、醫(yī)療診斷、遺傳研究、農(nóng)業(yè)化工及食品等相關領域發(fā)揮著越來越重要的作用[3]。核酸蛋白測定儀作為對核酸濃度、純度和蛋白濃度進行測定的儀器，對現(xiàn)代生命科學和生物技術(shù)的相關研究具有重要的意義[4]。

在已有的多種核酸蛋白檢測方法中，紫外分光光度法[5]與熒光染料法[6]、實時熒光定量PCR法[7]、數(shù)字PCR法[8]、流式細胞術(shù)[9]、共振光散射法[10]相比具有操作簡便、快速靈敏、選擇性好、精密度和準確度高、無污染、無樣品損耗等優(yōu)點，已經(jīng)在食品、醫(yī)療、化工等行業(yè)的定量分析、純度分析、結(jié)構(gòu)分析、動力學研究中得到了廣泛的應用。目前國內(nèi)外學者對核酸蛋白檢測技術(shù)進行了一些研究，樣品檢測量大都需要50～100 μL，不能進行1～5 μL的超微量檢測，大都采用干涉濾色片提供單色光作為檢測光源，只能固定幾個檢測波長，不能進行連續(xù)波長全光譜的分光光度檢測?，F(xiàn)有商用產(chǎn)品目前只有美國賽默飛世爾公司的NanoDrop系列和德國艾姆帕拉恩公司的NanoPhometer系列能夠?qū)崿F(xiàn)。因此，實現(xiàn)高效率、高靈敏度、高準確度的超微量連續(xù)波長全光譜分析測定是核酸蛋白檢測領域發(fā)展的最主要方向[5]。根據(jù)核酸蛋白超微量檢測的實際需求，我們基于紫外分光光度法設計了一種基于連續(xù)波長全光譜分析的超微量核酸蛋白測定儀，獲得了良好的效果。

1 超微量核酸蛋白測定儀的方案設計

根據(jù)紫外分光光度法的原理，物質(zhì)對光譜具有選擇性吸收的特性，在一定的實驗條件下，物質(zhì)的吸光度與溶液濃度和厚度的乘積成正比，因此可以根據(jù)物質(zhì)對不同波長單色光的吸收程度對物質(zhì)進行定性和定量分析[11]。我們設計的超微量核酸蛋白測定儀采用紫外分光光度法，利用核酸和蛋白質(zhì)分別對260 nm和280 nm的紫外光具有特征吸收的特點，可用260 nm和280 nm的吸光度比值評估核酸純度，用260 nm和280 nm的吸收差法對含有核酸的蛋白質(zhì)溶液的蛋白質(zhì)含量進行測量[12]。

采用紫外分光光度法進行核酸蛋白測定時，主要流程分為單色光生成、樣品檢測、結(jié)果輸出三部分。針對傳統(tǒng)核酸蛋白檢測儀需開機預熱、檢測范圍窄、檢測樣品量偏大、檢測波長固定的缺點，針對性設計了聚四氟乙烯圓柱形樣品池、嵌入光纖下載板，滿足超微量樣品檢測的需要，最低檢測容量為1 μL。以氙燈光源代替?zhèn)鹘y(tǒng)的鎢鹵素燈，無需預熱，即插即用。設計了光電信號檢測模塊，實現(xiàn)微弱光信號的采集。超微量核酸蛋白測定儀的設計方案如圖1所示。單色光發(fā)生器采用Czerny-Turner光學結(jié)[13]，由雙通道平面光柵、狹縫、準直鏡、凹鏡、平面鏡構(gòu)成，光柵轉(zhuǎn)盤采用步進電機驅(qū)動。光電信號檢測模塊采用高靈敏度光電傳感器和低噪聲、高帶寬運算放大器、高精度A/D轉(zhuǎn)換器設計。人機交互控制系統(tǒng)采用觸摸屏設計。渦旋混勻器采用高轉(zhuǎn)速直流無刷電機驅(qū)動，保證樣品均勻性。測試結(jié)果采用觸摸屏輸出。整個系統(tǒng)由嵌入式中央控制器控制。

圖1 超微量核酸蛋白測定儀的設計方案Fig.1 Design scheme of ultra-micro nucleic acid protein analyzer

2 核酸蛋白測定儀的硬件系統(tǒng)設計

根據(jù)設計方案，核酸蛋白測定儀的硬件系統(tǒng)結(jié)構(gòu)框架如圖2所示。

圖2 核酸蛋白測定儀的硬件系統(tǒng)結(jié)構(gòu)框架Fig.2 Hardware system block diagram of nucleic acid protein analyzer

硬件系統(tǒng)由電源模塊、嵌入式中央控制器模塊、光電信號檢測模塊、光柵轉(zhuǎn)盤控制模塊、渦旋混勻器控制模塊、觸摸屏模塊等部分組成。

紫外單色光發(fā)生器產(chǎn)生的單色光經(jīng)石英光纖照射到樣品池嵌入式光纖下載板的樣品上，高靈敏度的光電傳感器將經(jīng)過樣品的透射光信號轉(zhuǎn)化為微弱電流信號。光電信號檢測模塊將微弱電流信號進行放大、濾波、模數(shù)轉(zhuǎn)換后傳輸?shù)角度胧街醒肟刂破鳌Ｇ度胧街醒肟刂破鹘Y(jié)合外圍電路控制光電信號檢測模塊實現(xiàn)透射光強度采集，結(jié)合軟件算法進行核酸蛋白濃度和純度評估。其他功能如樣品混勻、人機交互、結(jié)果輸出等由嵌入式中央控制器控制相應模塊實現(xiàn)。

2.1 嵌入式中央控制模塊設計

嵌入式中央控制模塊是核酸蛋白測定儀的核心，用于對光柵轉(zhuǎn)盤、渦旋混勻器、顯示屏、通信、數(shù)據(jù)存儲進行控制，同時還要對光電信號檢測模塊采集的傳感器數(shù)據(jù)進行數(shù)據(jù)運算和軟件檢測算法處理。為了保證各模塊能夠正常穩(wěn)定工作且測定結(jié)果快速準確，對嵌入式中央控制模塊采用的MCU提出了較高要求。STM32F407系列單片機是ST公司推出的高集成度、高性能的醫(yī)療、工業(yè)與消費應用的32位處理器單片機。它具有工作頻率為168 MHz的CortexTM-M4內(nèi)核，512 kB～1 MB Flash和192 kB SRAM，且具有浮點單元，具有6個速度高達11.25 Mb/s的USART、3個速度高達45 Mb/s的SPI、3個I2C、2個CAN和1個SDIO[14]。選用STM32F407系列的STM32F407VGT6芯片作為嵌入式中央控制模塊的MCU，該芯片滿足測定儀對直流電機、步進電機的PWM控制、觸摸屏串口控制、數(shù)據(jù)采集和運算的要求。

2.2 光電信號檢測模塊設計

核酸蛋白測定儀的關鍵技術(shù)是對透射樣品的微弱光信號進行采集和處理，經(jīng)MCU對采集的數(shù)據(jù)輔助測定算法進行分析，才能準確地檢測出核酸蛋白的濃度和純度。選用日本濱松公司生產(chǎn)的硅光電二極管S1226-18BQ為光電傳感器，該傳感器具有1.21 mm2的感光面積，190～1000 nm的光譜響應范圍，最大暗電流為2 pA，響應上升時間僅需0.15 μs。所設計核酸蛋白測定儀需要的紫外檢測波長范圍為190～400 nm，該傳感器在此波段范圍內(nèi)靈敏度最小為0.1 A/W，典型值為0.36 A/W，具有優(yōu)越的紫外光檢測能力。因其具有響應快、靈敏度高、性能穩(wěn)定、測量線性好、噪聲低的特點，極大降低了電路設計的難度和提高了準確性。

經(jīng)過樣品的透射光是微弱信號，經(jīng)過硅光電二極管采集轉(zhuǎn)換后也很弱，通常只有微安級別，很難測量。因此要高精度、不失真的采集和分析硅光電二極管產(chǎn)生的電流信號，必須有后續(xù)的檢測電路設計[15]。

我們設計的光電檢測模塊采用I/V轉(zhuǎn)換電路將硅光電二極管采集的微弱電流信號轉(zhuǎn)換為電壓信號，再經(jīng)差動運放電路進行放大，之后經(jīng)可編程增益放大器再次放大，通過外圍電路進行濾波去噪，然后通過AD轉(zhuǎn)換電路變成數(shù)字信號送STM32F407VGT6單片機進行處理和分析，得到待測樣品的濃度和純度。圖3為光電信號檢測模塊功能結(jié)構(gòu)框架。

圖3 光電信號檢測模塊功能結(jié)構(gòu)框架Fig.3 Functional structure block diagram of photoelectric signal detection module

對透射樣品的微弱光信號進行檢測，需考慮電路的帶寬增益積、信噪比和穩(wěn)定性，元器件的選型對電路的抗干擾設計和噪聲抑制至關重要。I/V轉(zhuǎn)換芯片選用TI公司的LMP2011，它是一款低噪聲、低輸入偏置電流、低失調(diào)電壓、高帶寬、高共模抑制比的的單路、軌到軌運放，可滿足需求。后置放大采用LMP2011和可編程增益放大器PGA112，PGA112是一款低偏置電壓、低噪聲、誤差小的可編程運算放大器，采用SPI通信方式對增益進行調(diào)整。AD轉(zhuǎn)換芯片選用TI公司的16位高精度、低功耗、微型CMOS轉(zhuǎn)換芯片TLC4545ID，該芯片采樣率為200 kSPS，采用3 Vpp/V噪聲、3 ppm/oC漂移精密電壓基準芯片REF5025提供2.5 V參考電壓，采用SPI串行接口協(xié)議與STM32F407VGT6通信。

基于以上分析，利用Altium Designer軟件設計出一種具有低噪聲、高穩(wěn)定性的光電信號檢測電路，能夠?qū)⒐韫怆姸O管SS1296-18BQ輸出的幾個微安的光電流信號轉(zhuǎn)換為A/D轉(zhuǎn)換器能夠識別的電壓，主要電路，如圖4所示。

圖4 光電信號檢測模塊主要電路Fig.4 Main circuit of photoelectric signal detection module

2.3 光柵轉(zhuǎn)盤控制模塊設計

步進電機作為光柵轉(zhuǎn)盤的執(zhí)行機構(gòu)，需要專門的運動控制器和驅(qū)動器進行驅(qū)動。采用德國Trinamic公司的電機運動控制芯片TMC4210和電機驅(qū)動芯片TMC2660對光柵轉(zhuǎn)盤兩相步進電機進行控制。TMC4210運動控制器內(nèi)設存儲器和寄存器，通過四線SPI接口與STM32F07VGT6進行通信，TMC2660集成預驅(qū)動器和功率MOSFET管，峰值輸出電流最大能夠達到4 A，芯片參數(shù)由STM32F407VGT6通過SPI進行配置，通過Step/Dir方式驅(qū)動最大能夠?qū)崿F(xiàn)256細分，能夠?qū)崿F(xiàn)高精度電機控制。光柵轉(zhuǎn)盤控制模塊電路框圖，如圖5所示。

圖5 光柵轉(zhuǎn)盤控制模塊電路框圖Fig.5 Block diagram of raster turntable control module circuit

2.4 渦旋混勻器控制模塊設計

無刷直流電機作為渦旋混勻器的執(zhí)行機構(gòu)，由德國Elmos公司的高集成度三相直流無刷電機控制芯片E523.52進行驅(qū)動。該芯片集成16位RISC微控制器、4 kB RAM，硬件MAC及電壓分壓監(jiān)測電路，柵極驅(qū)動器，可驅(qū)動三相全橋MOSFET，每一相最大驅(qū)動電流達200 mA，集成1 Mbps的12位ADC自主采樣序列引擎，可以對內(nèi)存直接存取，實現(xiàn)和PWM同步。得益于E523.52的高集成度，結(jié)合由6個MOS管構(gòu)成的電機驅(qū)動橋、1個采用電阻及必要的基礎器件，系統(tǒng)通過STM32F407VGT6產(chǎn)生6個獨立PWM對渦旋混勻器的無刷直流電機進行控制，實現(xiàn)樣品混勻功能，其控制電路框架，如圖6所示。

圖6 渦旋混勻器控制模塊電路框架Fig.6 Block diagram of vortex mixer control module circuit

2.5 顯示模塊設計

采用5.6 in的TFT串口觸摸屏實現(xiàn)人機交互和測定結(jié)果顯示，顯示屏通過UART接口與STM32F407VGT6相連，能夠?qū)崿F(xiàn)文本、GUI、圖片、GIF動畫的顯示和觸控功能，滿足測定儀人機交互控制設計需求。

2.6 電源模塊設計

電源模塊用來給儀器供電，該模塊由直流隔離模塊和穩(wěn)壓模塊組成。在系統(tǒng)電路設計中，電源采用12 V開關電源為主電源，采用穩(wěn)壓芯片ADM7170提供5 V的穩(wěn)壓輸出?？刂乒鈻呸D(zhuǎn)盤的步進電機和渦旋混勻器的無刷直流電機采用12 V供電，嵌入式中央控制模、光電信號檢測模塊、步進電機和直流電機控制器、驅(qū)動器采用5 V供電。

3 核酸蛋白測定儀的軟件系統(tǒng)設計

軟件設計包括測定儀觸摸操作主程序、系統(tǒng)初始化程序、測定流程控制程序、光柵轉(zhuǎn)盤控制程序、渦旋混均器控制程序、光電信號信號檢測程序、觸摸屏串口控制程序、定時程序、中斷程序、數(shù)據(jù)存儲程序、AD數(shù)據(jù)采集程序、濃度純度計算程序等。系統(tǒng)軟件程序流程圖如圖7所示。

圖7 軟件程序流程圖Fig.7 Software program flow chart

根據(jù)實際測定流程編寫程序流程，程序運行開始時進行系統(tǒng)初始化，包括STM32F407VGT6的時鐘系統(tǒng)、IO端口、直流電機模塊、步進電機模塊、霍爾限位開關引腳定義、串行通信接口、SPI通信接口等的初始化。初始化完成后，系統(tǒng)根據(jù)用戶在觸摸屏上操作對樣品進行測定。測定時，根據(jù)朗伯比爾定律A=kcl（A為吸光度，k為消光系數(shù)，l為光程），已知物質(zhì)的消光系數(shù)，液層的厚度（固定的樣品室），就能利用其吸光度來計算出物質(zhì)的濃度。與此同時，還能通過計算A260/A280和A260/A230的數(shù)值，估計核酸的純度。

4 系統(tǒng)測試與結(jié)果

4.1 實驗設計

系統(tǒng)測試主要分為樣機功能性測試、穩(wěn)定性測試和準確性測試。功能性測試對所設計儀器是否能夠進行核酸和蛋白質(zhì)的濃度進行測量進行評估。穩(wěn)定性測試對同一樣本在不同時刻多次測量的情況進行評估。準確性測試對不同樣本多次測量的情況進行評估。在準確性測試時通過同時使用德國IMPLEN NanoPhotometer商用核酸蛋白測定儀和設計的核酸蛋白測定儀進行對比實驗，對儀器性能進行評估。

4.2 穩(wěn)定性測試

儀器的精度是建立在儀器的穩(wěn)定性之上的，穩(wěn)定性是評價其可靠性的基礎。用所設計核酸蛋白測定儀對同一濃度樣品在不同時間進行重復測量，每種樣品各儀器測量9次，計算相對標準偏差。相對標準偏差不大于1%認為無統(tǒng)計差異，儀器測試結(jié)果穩(wěn)定。

以為dsDNA為待測樣品，用移液器將2 μL樣品加入樣品池中，每間隔10 s用儀器對其濃度進行測試。不同時刻測得的濃度曲線如圖8所示，重復測量濃度值無顯著變化。經(jīng)計算，相對標準偏差RSD為0.25%，儀器具有較好的穩(wěn)定性。

圖8 樣品在不同時刻的濃度Fig.8 The concentration of the sample at different times

4.3 準確性測試

通過對10種濃度標準樣品同時使用IMPLEN NanoPhotometer商用核酸蛋白測定儀和設計的核酸蛋白測定儀進行測定對比實驗。圖9為兩種儀器在不同濃度下的誤差曲線。

圖9 測試誤差對比曲線Fig.9 Test error comparison curve

如圖9所示，兩款核酸蛋白測定儀對不同濃度樣品的測定結(jié)果表明，所設計核酸蛋白測定儀和商用核酸蛋白測定儀在低濃度時誤差偏大，但均小于3%，在樣品濃度較高時，誤差小于1%，儀器具有較好的準確性。

5 結(jié)論

核酸蛋白測定儀已經(jīng)廣泛應用于醫(yī)學研究、生命科學研究、化工、食品科學等行業(yè)。設計的核酸蛋白測定儀，根據(jù)紫外分光光度法及核酸蛋白測定原理，對儀器的紫外單色光模塊、光電信號檢測模塊、嵌入式中央控制器等方面進行了研究，搭建了相關實驗平臺，給出了儀器的設計與實現(xiàn)方法。通過對比測試實驗，對儀器的穩(wěn)定性和準確性進行了測試，實驗結(jié)果與市場上相對成熟的核酸蛋白測定儀具有良好的一致性。所設計的儀器具有使用靈活、操作簡單、靈敏度高、檢測效率高的特點，為核酸蛋白測定儀的設計和制造提供了參考價值。不過該檢測儀還需進一步優(yōu)化結(jié)構(gòu)設計，進一步提高穩(wěn)定性和準確性，使其具有產(chǎn)品應用價值。