李鵬昊 郝敬鵬 史剛剛 王暉

天津醫(yī)科大學(xué)第二醫(yī)院肛腸外科300211

0 引 言

結(jié)直腸癌作為高發(fā)的惡性腫瘤，在2018年全球新發(fā)的1 810萬(wàn)例惡性腫瘤中占6.1%，卻造成了9.1%的腫瘤死亡病例。發(fā)達(dá)國(guó)家中，結(jié)直腸癌的平均發(fā)病率為30.3例/10萬(wàn)人（列腫瘤第3位），死亡率為12.8例/10萬(wàn)人（列腫瘤第4位）；發(fā)展中國(guó)家中，結(jié)直腸癌的平均發(fā)病率為8.4例/10萬(wàn)人（列腫瘤第4位），死亡率為5.7例/10萬(wàn)人（列腫瘤第5位）[1]。2015年，我國(guó)結(jié)直腸癌發(fā)病率為28.2例/10萬(wàn)人（列腫瘤第3位），死亡率為13.61例/10萬(wàn)人（列腫瘤第5位），其中城市人口比農(nóng)村人口有更高的發(fā)病率和死亡率[2]。

隨著生活水平及城市化率的提高，我國(guó)結(jié)直腸癌的發(fā)病率及死亡率逐年升高，因此尋找結(jié)直腸癌的特異性標(biāo)志物，以便對(duì)其早期診治顯得尤為重要。胸苷激酶（thymidine kinase，TK）是一種參與DNA合成的細(xì)胞酶，分為TK1和TK2。TK1存在于分裂細(xì)胞的細(xì)胞質(zhì)中，而TK2位于不增殖細(xì)胞的線粒體內(nèi)[3]。TK1被認(rèn)為是一種反映腫瘤增殖的生物學(xué)標(biāo)志物，其參與細(xì)胞增殖的核苷酸回收途徑，在增殖細(xì)胞和惡性腫瘤細(xì)胞中高表達(dá)[4-5]。研究結(jié)果表明，TK1的高表達(dá)與腫瘤的分期、分級(jí)和大小有關(guān)[6]。由于TK1幾乎不存在于靜態(tài)細(xì)胞中，它被用于監(jiān)測(cè)腫瘤的預(yù)后和治療效果[7]。目前，TK1已被用于早期宮頸上皮內(nèi)瘤變及早期肺癌的診斷[8-9]。臨床上，癌胚抗原（carcinoembryonic antigen，CEA）、糖類抗原（carbohydrate antigen，CA）19-9、CA15-3 和 CA72-4已被用于結(jié)直腸腫瘤的診斷，以提高診斷敏感性和特異性。本研究中，評(píng)估TK1水平與結(jié)直腸癌患者臨床病理特征及預(yù)后的關(guān)系，并探討TK1、CEA、CA19-9、CA15-3和CA72-4在結(jié)直腸腫瘤中的表達(dá)及其臨床意義。

1 資料與方法

1.1 臨床資料

選擇2017年1月1日至2018年4月30日在天津醫(yī)科大學(xué)第二醫(yī)院就診的124例結(jié)直腸癌患者，其中男 70例，女 54例，年齡（63.33±7.88）歲。所有結(jié)直腸癌患者均行根治手術(shù)切除，按照中國(guó)結(jié)直腸癌診療規(guī)范進(jìn)行治療，并排除合并干擾性疾病因素。統(tǒng)計(jì)所有結(jié)直腸癌患者的TK1水平，收集患者的性別、年齡、臨床分期、淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移情況、遠(yuǎn)端轉(zhuǎn)移情況、腫瘤分化程度等信息。對(duì)所有結(jié)直腸癌患者進(jìn)行電話隨訪，隨訪截止日期為2020年4月30日或患者死亡日期。

選擇同時(shí)期在天津醫(yī)科大學(xué)第二醫(yī)院就診（或查體）的52例結(jié)直腸癌前病變患者，其中男30例，女 22例，年齡（64.19±8.18）歲，其病理表現(xiàn)為高級(jí)上皮內(nèi)瘤變、鋸齒狀腺瘤；154例結(jié)直腸腺瘤樣息肉患者，其中男 80例，女 74例，年齡（63.88±6.37）歲，其病理表現(xiàn)為管狀腺瘤、絨毛狀管狀腺瘤、炎性息肉；106名中老年健康受試者（年齡范圍為50～80歲），其中男 62名，女 44名，年齡（63.36±7.36）歲，所有健康受試者的體檢報(bào)告均未見嚴(yán)重的感染或疾病。所有入組者均簽署知情同意書。

1.2 主要材料與儀器

胸苷激酶1(TK1)細(xì)胞周期分析試劑盒（華瑞同康生物技術(shù)有限公司）。Immulite 2000全自動(dòng)化學(xué)發(fā)光免疫分析儀（德國(guó)西門子公司）。

1.3 方法

1.3.1 實(shí)驗(yàn)分組

采用單盲法隨機(jī)分組。其中，106名健康受試者入健康組，154例結(jié)直腸腺瘤樣息肉患者入良性組，52例結(jié)直腸癌前病變患者入癌前病變組，124例結(jié)直腸癌患者入結(jié)直腸癌組。上述4組中，入組者的性別及年齡等的差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（均P＞0.05）。

1.3.2 血清TK1水平檢測(cè)方法

于清晨采集所有受試者的空腹血樣至不含肝素的抽血管中，室溫靜置30～60 min至血液凝固；以3 500 r/min離心10 min，收集上清液進(jìn)行酶聯(lián)免疫吸附測(cè)定 （enzyme linked immunosorbent assay，ELISA）。使用TK1細(xì)胞周期分析試劑盒并根據(jù)試劑盒的使用說(shuō)明書檢測(cè)血清TK1水平。檢測(cè)方法為雙抗體夾心法，具體原理為：?jiǎn)慰寺】贵wTK1制作成固相抗體；于微孔板中加入內(nèi)含TK1的質(zhì)控物、校準(zhǔn)物、待測(cè)樣品、TK1酶結(jié)合物及TK1結(jié)合抗體；適宜溫度下培育后，形成抗原及抗體復(fù)合物，經(jīng)過洗滌顯色，終止反應(yīng)后測(cè)定450 nm處的吸光度值；該吸光度值與TK1值正相關(guān)，通過校準(zhǔn)品校準(zhǔn)后計(jì)算樣本的TK1水平。

具體檢測(cè)步驟為：室溫下（約25°）將微孔條固定于板架上并標(biāo)記；先加入50 μl樣品、TK1質(zhì)控品和TK1校準(zhǔn)品，再加入50 μl TK1抗體混勻，留置空白孔；用封口膜封閉條板，在37℃下孵育30 min；拿出反應(yīng)板，去掉其中液體，用洗滌液清洗5次，甩干，小心避免氣泡生成；除空白孔外，每孔加入100 μl TK1酶復(fù)合物。封閉好后37℃孵育30 min；用洗滌液清洗5次；各個(gè)孔內(nèi)依次加入50 μl A、B顯色劑，小心混勻，37℃下孵育15 min；在各孔內(nèi)加入終止液50 μl，混勻；采用酶標(biāo)儀測(cè)定450 nm處的吸光度值，再計(jì)算出TK1的水平。TK1的正常參考值為0～2.0 pmol/L。

1.3.3 結(jié)直腸癌標(biāo)志物的檢測(cè)方法

在天津醫(yī)科大學(xué)第二醫(yī)院核醫(yī)學(xué)科，使用電化學(xué)發(fā)光免疫分析（electrochemiluminescence immunoassay，ECLIA）法定量測(cè)定所有受試者血樣中的CEA、CA19-9、CA15-3和CA72-4水平。

CEA、CA19-9、CA15-3和 CA72-4的正常參考值分別為 0～5 ng/mL、0～37 U/ml、0～35 U/mL 和 0～6.9 U/ml。

1.4 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法

采用SPSS22.0軟件進(jìn)行統(tǒng)計(jì)學(xué)分析，計(jì)量資料以均值±標(biāo)準(zhǔn)差（Mean±SD）表示，兩組間比較采用t檢驗(yàn)，通過卡方（χ2）檢驗(yàn)比較臨床病理特征與TK1蛋白表達(dá)水平之間的相關(guān)性。以P＜0.05為差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié) 果

2.1 TK1水平與臨床病理特征的關(guān)系

根據(jù)TK1的正常參考值0～2.0 pmol/L，將所有受試者分為TK1陰性組（＜2 pmol/L）和TK1陽(yáng)性組（≥2 pmol/L）。

如表1，結(jié)直腸癌患者的血清TK1水平與性別的相關(guān)性無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＞0.05），但TK1水平與患者年齡、臨床分期、淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移情況、遠(yuǎn)端轉(zhuǎn)移情況、腫瘤分化程度相關(guān)（均P＜0.05）。此外，受試者血清TK1水平隨結(jié)直腸癌患者年齡增大而降低（P＜0.05）；Ⅲ、Ⅳ期患者的血清TK1水平高于Ⅰ、Ⅱ期患者（P＜0.05）；有淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移的患者，其血清TK1水平更高（P＜0.05）；而低分化或黏液腺癌的患者，其血清TK1水平明顯高于中、高分化的患者（P＜0.05）。

2.2 TK1表達(dá)與患者生存期的關(guān)系

血清TK1水平＜2 pmol/L和≥2 pmol/L的結(jié)直腸癌患者的生存曲線如圖1所示。結(jié)果表明，TK1水平＜2 pmol/L的患者，其生存期明顯長(zhǎng)于TK1水平≥2 pmol/L的患者（P＜0.01），提示 TK1可作為結(jié)直腸癌患者預(yù)后的預(yù)測(cè)指標(biāo)。

圖1 不同TK1水平的結(jié)直腸癌患者的生存曲線

2.3 各組TK1和其他結(jié)直腸癌標(biāo)志物的水平

各組的血清 TK1、CEA、CA19-9、CA15-3 和 CA72-4水平見表2。結(jié)果顯示，結(jié)直腸癌患者的血清TK1水平最高，癌前病變組其次，良性病變組及健康組最低（均P＜0.05）。對(duì)于CEA、CA19-9、CA15-3和CA72-4水平，健康組與癌前病變組及結(jié)直腸癌組之間的差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（均P＜0.05）；而良性病變組與健康組之間的差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（均P＞0.05）。

2.4 各結(jié)直腸癌標(biāo)志物的診斷效能

TK1、CEA、CA19-9、CA15-3 和 CA72-4 的獨(dú)立檢測(cè)和聯(lián)合檢測(cè)對(duì)結(jié)直腸癌的診斷效能見表3。結(jié)果顯示，聯(lián)合檢測(cè)的診斷效能明顯高于獨(dú)立檢測(cè)，且聯(lián)合檢測(cè)的項(xiàng)目越多，敏感性、特異性、準(zhǔn)確率越高。

表1 TK1水平與結(jié)直腸癌患者的臨床及病理資料的關(guān)系

表2 不同人群的血清TK1、CEA、CA19-9、CA15-3和CA72-4水平

表3 不同標(biāo)志物的聯(lián)合檢測(cè)與獨(dú)立檢測(cè)對(duì)結(jié)直腸癌的診斷效能

3 討論與結(jié)論

2015年，我國(guó)有結(jié)直腸癌新發(fā)病例49 800例，結(jié)直腸癌死亡病例19 100例[10]。早期結(jié)直腸癌的癥狀很隱匿，在結(jié)腸鏡篩查未普及的背景下，尋找診斷效能高的標(biāo)志物非常重要。雖然，臨床上已發(fā)現(xiàn)一些相關(guān)的腫瘤標(biāo)志物，但其敏感性及特異性仍較低。在細(xì)胞周期中，TK1在嘧啶脫氧核苷酸的合成中起關(guān)鍵作用。血清TK1檢測(cè)已被用于多種實(shí)體腫瘤的診斷和預(yù)后分析，包括肺癌、乳腺癌、結(jié)直腸癌[11-13]。Weagel等[14]發(fā)現(xiàn)結(jié)直腸癌患者的血清TK1水平較健康人明顯升高，本研究結(jié)果與其一致。另有研究結(jié)果表明，在結(jié)腸癌患者中，TK1只在惡性腫瘤細(xì)胞的細(xì)胞膜上表達(dá)，而在正常細(xì)胞的細(xì)胞膜上不表達(dá)，提示TK1特異性定位于腫瘤細(xì)胞膜上。在血液系統(tǒng)腫瘤中，也有類似的發(fā)現(xiàn)[15]。癌癥患者血清中，TK1的高表達(dá)提示TK1可能是一種與腫瘤生長(zhǎng)相關(guān)的標(biāo)志物，并可預(yù)測(cè)其進(jìn)展情況。本研究中，分析了124例結(jié)直腸癌患者的血清TK1水平與其臨床病理特征之間的關(guān)系。結(jié)果表明，TK1可用于結(jié)直腸癌患者的早期診斷和腫瘤進(jìn)展評(píng)估。

此前的研究結(jié)果表明，部分診斷效能高的腫瘤標(biāo)志物在腫瘤中表達(dá)穩(wěn)定，尤其在腫瘤細(xì)胞的細(xì)胞膜上過表達(dá)，而在正常細(xì)胞或正常組織中低表達(dá)[16]。例如，人表皮生長(zhǎng)因子受體2（human epidermal growth factor receptor 2，HER2）在乳腺癌、結(jié)直腸癌、胰腺癌中過表達(dá)[17]。對(duì)于HER2呈陽(yáng)性的腫瘤，臨床上是通過靶向細(xì)胞膜上的HER2來(lái)治療的[17-18]。也有研究者發(fā)現(xiàn)，TK1在乳腺癌和結(jié)腸癌細(xì)胞系中高表達(dá)[19-20]。TK1水平升高表明腫瘤增殖活躍。Calzado等[21]發(fā)現(xiàn)Ⅱ期非小細(xì)胞肺腺癌患者的血清TK1水平高于Ⅰ期患者。Cho等[22]在對(duì)胃癌患者進(jìn)行相關(guān)研究后發(fā)現(xiàn)，Ⅲ、Ⅳ期患者的TK1水平明顯高于Ⅰ、Ⅱ期患者。Wang等[23]發(fā)現(xiàn)，對(duì)于同等大小的肺癌、胃癌及甲狀腺癌腫瘤，TK1水平越高，患者的預(yù)后越差。Xu等[24]發(fā)現(xiàn)，TK1表達(dá)水平與肺癌的病理分期相關(guān)。McCartney[25]等則認(rèn)為血清TK1水平升高是乳腺癌等高惡性腫瘤無(wú)法被完整切除的危險(xiǎn)因素。

CEA、CA19-9、CA15-3和CA72-4是消化道腫瘤的常見標(biāo)志物。CEA是一種最早從胚胎和結(jié)腸腺癌組織中提取到的糖蛋白，在包括結(jié)直腸癌的很多消化道腫瘤中高表達(dá)[26]。CEA的優(yōu)勢(shì)是判斷腫瘤的性質(zhì)，而非反映腫瘤增生的活躍度[27]。CA19-9是從大腸細(xì)胞中提取的糖類蛋白，其對(duì)于結(jié)直腸癌的診斷特異性較高，但敏感性較差。而CA15-3更多地用于乳腺癌的診斷，但其水平在結(jié)直腸癌、胰腺癌等消化道腫瘤中也有不同程度升高。CA72-4用于胃腸道腫瘤診斷時(shí)，敏感性較高，但單獨(dú)作為標(biāo)志物還不能滿足相關(guān)腫瘤的臨床診斷需求[28]。本研究結(jié)果表明，TK1、CEA、CA19-9、CA15-3 和 CA72-4 聯(lián)合檢測(cè)的診斷效能較好，敏感性、特異性、準(zhǔn)確率分別為93.5%、93.0%和93.1%。

綜上，聯(lián)合檢測(cè) TK1、CEA、CA19-9、CA15-3 和CA72-4可獲得較好的結(jié)直腸癌診斷敏感度和特異度；較高血清TK1水平，提示更差的預(yù)后；血清TK1有望作為一個(gè)獨(dú)立的結(jié)直腸癌標(biāo)志物，其在結(jié)直腸癌的臨床診斷及預(yù)后預(yù)測(cè)中具有應(yīng)用潛力。

利益沖突 所有作者均聲明不存在利益沖突