李宛津 戴偉 盧正義 畢相東 董少杰 衛(wèi)鵬 唐皇

摘 ? ?要：為探討飼料中添加藍(lán)藻和超聲波脫毒藍(lán)藻對(duì)草金魚(yú)生長(zhǎng)、體色和微囊藻毒素（MCs）含量的影響，分別用添加0（對(duì)照組）、50%藍(lán)藻藻泥、50%脫毒藍(lán)藻藻泥、67%藍(lán)藻藻泥和67%脫毒藍(lán)藻藻泥飼料飼喂草金魚(yú)60 d。結(jié)果顯示：飼料中添加藍(lán)藻藻泥能夠顯著促進(jìn)草金魚(yú)生長(zhǎng)（P<0.05），而經(jīng)超聲脫毒藍(lán)藻未表現(xiàn)出促生長(zhǎng)作用。與對(duì)照組相比，飼喂添加67%藍(lán)藻藻泥飼料組草金魚(yú)皮膚a*紅度值、b*黃度值和類(lèi)胡蘿卜素含量均顯著升高（P<0.05），飼料中添加67%藍(lán)藻藻泥增色效果最佳。對(duì)照組草金魚(yú)內(nèi)臟和肌肉內(nèi)均未檢測(cè)到微囊藻毒素RR（MC-RR）和微囊藻毒素LR（MC-LR）存在。飼喂添加藍(lán)藻藻泥飼料或脫毒藍(lán)藻藻泥飼料后，草金魚(yú)肌肉和內(nèi)臟內(nèi)均有MC-RR蓄積，且藍(lán)藻藻泥添加組和脫毒藍(lán)藻藻泥添加組間無(wú)顯著差異（P>0.05），草金魚(yú)內(nèi)臟內(nèi)檢測(cè)到MC-LR蓄積，二者間差異亦不顯著（P>0.05），僅在飼喂添加67%藍(lán)藻藻泥草金魚(yú)肌肉內(nèi)檢測(cè)到MC-LR蓄積。

關(guān)鍵詞：草金魚(yú);藍(lán)藻;脫毒藍(lán)藻;生長(zhǎng);體色;MCs含量

中圖分類(lèi)號(hào)：S917.4 ? ? ? ? ? ? 文獻(xiàn)標(biāo)志碼：A ? ? ? ? ? DOI 編碼：10.3969/j.issn.1006-6500.2020.07.007

Abstract： To investigate effects of feeds added with cyanobacteria and detoxified cyanobacteria with ultrasonic on the growth， body color and microcystins （MCs） contents of goldfish， goldfish were fed with feeds supplemented with 0 （control）， 50% cyanobacteria mud， 50% detoxified cyanobacteria mud， 67% cyanobacteria mud and 67% detoxified cyanobacteria mud for 60 d. The results showed that cyanobacteria supplementation could stimulate goldfish growth significantly（P<0.05）， and cyanobacteria with ultrasonic detoxification had no stimulatory effects on the growth. As compared with the control， redness （a*）， yellowness （b*） and carotenoid content of the fish fed with 67% cyanobacteria mud increased significantly（P<0.05）， suggesting adding 67% cyanobacteria mud into the feed had the best effects on improving fish body color. Both microcystin-RR （MC-RR） and microcystin-LR （MC-LR） were not detected in the viscera and muscles of the control group fish. After being fed with cyanobacteria and detoxified cyanobacteria mud， MC-RR accumulations were detected in the viscera and muscles of goldfish， and insignificant difference was observed between fish fed with cyanobacteria and detoxified cyanobacteria mud（P>0.05）. MC-LR accumulation was detected in the viscera， there was no significant difference between fish fed with cyanobacteria and detoxified cyanobacteria mud（P>0.05）. The accumulation of MC-LR was only detected in goldfish muscle fed with 67% cyanobacteria mud.

Key words：goldfish; cyanobacteria; detoxified cyanobacteria; growth; body color; MCs content

近幾十年來(lái)，因水體富營(yíng)養(yǎng)化造成藍(lán)藻水華頻發(fā)，已經(jīng)成為存在于淡水生態(tài)系統(tǒng)的世界性難題。目前，藍(lán)藻水華治理主要有物理消除、生物防控和化學(xué)抑殺3種方式[1]，其中機(jī)械打撈（物理消除）是現(xiàn)階段降低藍(lán)藻再次爆發(fā)強(qiáng)度和減除其水污染危害的最直接有效的措施[2]。但大量打撈出來(lái)的藍(lán)藻若得不到及時(shí)有效處理，長(zhǎng)期堆積腐敗后會(huì)產(chǎn)生惡臭、釋放藍(lán)藻毒素、氮、磷營(yíng)養(yǎng)鹽，引發(fā)新的環(huán)境問(wèn)題[3-4]。因此，如何低成本、高效率地處置和利用水華藍(lán)藻已成為藍(lán)藻水華治理過(guò)程中亟待解決的問(wèn)題之一。

目前藍(lán)藻資源化利用主要有以下幾種方式：制備藍(lán)藻堆肥、制備藍(lán)藻沼肥、作為飼料原料、生物質(zhì)新能源等[5]。藍(lán)藻干物質(zhì)中含有約 30%～50%的蛋白質(zhì)[6]，將其作為養(yǎng)殖動(dòng)物飼料蛋白質(zhì)來(lái)源具有巨大的發(fā)展前景。另外，藍(lán)藻內(nèi)還富含多種微量元素、類(lèi)胡蘿卜素等，可以高效改善動(dòng)物體色[7]。但由于藍(lán)藻細(xì)胞內(nèi)藍(lán)藻毒素的存在，動(dòng)物攝食后毒素蓄積不僅影響其自身生長(zhǎng)，還會(huì)通過(guò)食物鏈最終危害人類(lèi)健康。藍(lán)藻毒素已成為藍(lán)藻飼料化利用的主要障礙，因此，應(yīng)對(duì)藍(lán)藻進(jìn)行適當(dāng)?shù)拿摱咎幚?，并尋找和篩選對(duì)藍(lán)藻耐受性比較高的養(yǎng)殖品種。

谷秀等[8]研究發(fā)現(xiàn)用超聲法處理藍(lán)藻，同時(shí)具有直接破壁滅藻、抑制未滅藻的生長(zhǎng)活性和降解藻毒素3種功效。而對(duì)于具有觀(guān)賞價(jià)值的水族動(dòng)物而言，藍(lán)藻毒素蓄積不存在通過(guò)食物鏈威脅人類(lèi)健康的風(fēng)險(xiǎn)。在觀(guān)賞水族動(dòng)物養(yǎng)殖中，藍(lán)藻飼料化利用更具優(yōu)勢(shì)。因此，本研究采用超聲波法對(duì)打撈藍(lán)藻進(jìn)行脫毒處理，并對(duì)比探究了添加藍(lán)藻飼料和脫毒藍(lán)藻飼料對(duì)草金魚(yú)生長(zhǎng)、體色和MCs含量的影響，以期為藍(lán)藻在觀(guān)賞魚(yú)養(yǎng)殖中的資源化利用提供理論依據(jù)。

1 材料和方法

1.1 試驗(yàn)材料

水華藍(lán)藻采集自天津市薊州區(qū)藍(lán)科水產(chǎn)養(yǎng)殖有限公司循環(huán)水渠，經(jīng)光鏡下鑒定銅綠微囊藻為優(yōu)勢(shì)種，真空抽濾直接制成藻泥或脫毒后真空抽濾制成藻泥保存于-20 ℃冰箱。試驗(yàn)用魚(yú)為觀(guān)賞用草金魚(yú)，由天津市薊州區(qū)藍(lán)科水產(chǎn)養(yǎng)殖有限公司提供，在實(shí)驗(yàn)室內(nèi)暫養(yǎng)1周后用于試驗(yàn)。

1.2 脫毒藍(lán)藻制備

根據(jù)谷秀等[8]的方法將采集的水華藍(lán)藻在120 W的超聲功率下冰浴超聲作用15 min進(jìn)行脫毒處理，然后真空抽濾制成藻泥保存于-20 ℃冰箱。

1.3 試驗(yàn)飼料

對(duì)照組：按照360 g商品飼料添加6 g粘合劑、2 g氯化鈣和5 mL水的比例制備而成;添加50%藍(lán)藻/脫毒藍(lán)藻藻泥飼料：按照180 g商品飼料添加180 g藍(lán)藻/脫毒藍(lán)藻藻泥、6 g粘合劑、2 g氯化鈣和5 mL水的比例制備而成;添加67%藍(lán)藻/脫毒藍(lán)藻藻泥飼料：按照180 g商品飼料添加360 g藍(lán)藻/脫毒藍(lán)藻藻泥、9 g粘合劑、3 g氯化鈣和5 mL水的比例制備而成。

1.4 試驗(yàn)動(dòng)物及飼養(yǎng)管理

挑選體格健壯、規(guī)格一致的600尾草金魚(yú)（3.3±0.5 g）隨機(jī)分成5組，每組3個(gè)重復(fù)，每個(gè)重復(fù)40尾，分別飼養(yǎng)于水族箱內(nèi)，水溫23 ℃。每日分別在9：00和17：00各投喂飼料1次，投喂量為魚(yú)體質(zhì)量3%左右，試驗(yàn)期60 d。試驗(yàn)結(jié)束后將試驗(yàn)魚(yú)空腹24 h，測(cè)定體質(zhì)量、體表色差值，并全部解剖采集樣本。

1.5 體表色差值的測(cè)定

用紗布將魚(yú)體表面的水分吸干，使用色差儀（CR-400，美能達(dá)）進(jìn)行體表色度測(cè)定。測(cè)定前先將色差儀調(diào)零，將色差儀的探頭垂直緊貼于魚(yú)體背部和腹部相同位置測(cè)定各試驗(yàn)魚(yú)體表白度值（L*）、紅度值（a*）和黃度值（b*）。

1.6 類(lèi)胡蘿卜素含量的測(cè)定

將草金魚(yú)魚(yú)體皮膚（帶鱗片）剪碎后準(zhǔn)確稱(chēng)取0.1 g，用丙酮定容至5 mL，隨后經(jīng)低溫超聲波震蕩40 min，4 500 rpm離心10 min后置4 ℃冰箱中靜置24 h獲得色素萃取液。以丙酮作為空白對(duì)照，然后將獲得的色素萃取液置于比色皿中（1 cm），先利用紫外分光光度計(jì)進(jìn)行掃描尋找最大吸收峰處波長(zhǎng)，然后在此最大吸收峰處波長(zhǎng)下測(cè)定各組色素萃取液的吸光度值。

類(lèi)胡蘿卜素含量根據(jù)以下公式計(jì)算：

類(lèi)胡蘿卜素含量（mg·kg-1）=（A*K*V）/（E*G）

式中，E為摩爾消光系數(shù)（2 500）;G為樣品質(zhì)量（g）;A為吸光度值;K為常數(shù)（104）;V為提取液體積（mL）。

1.7 MCs含量的測(cè)定

MCs的提取參考Xie等[9]方法。分別取試驗(yàn)魚(yú)內(nèi)臟和肌肉保存于-80 ℃冰箱用于MCs含量的測(cè)定。-80 ℃反復(fù)凍融5次后混勻、真空凍干。研磨干燥后的組織，稱(chēng)取1 g于離心管中，每種組織取3個(gè)平行。分2次（每次用20 mL，90%的甲醇提取液）進(jìn)行磁力攪拌（30 min）提取，10 000 r·min-1離心10 min取上清液，重復(fù)提取2次合并上清液，于旋蒸儀40 ℃蒸發(fā)至近1 mL，加入6 mL超純水分2次溶解。過(guò)預(yù)先活化的 C18 固相萃取小柱進(jìn)行萃取，先后用超純水和20%的甲醇各10 mL淋洗去雜質(zhì)，然后用10 mL含0.1%TFA甲醇洗脫，保留洗脫液，洗脫液旋蒸至近干，甲醇定容至1 mL。過(guò)0.22 μm濾膜過(guò)濾，使用安捷倫1260InfinityII高效液相色譜儀測(cè)定峰面積及確定每種毒素的出峰時(shí)間。

1.8 數(shù)據(jù)分析

采用SPSS19.0軟件進(jìn)行單因素方差分析（One-way ANOVA）。試驗(yàn)結(jié)果以平均值±標(biāo)準(zhǔn)差表示，以P<0.05為差異顯著性判斷標(biāo)準(zhǔn)。

2 結(jié)果與分析

2.1 飼喂添加藍(lán)藻藻泥飼料和脫毒藍(lán)藻藻泥飼料對(duì)草金魚(yú)生長(zhǎng)的影響

如圖1所示，與對(duì)照組草金魚(yú)相比，飼喂添加藍(lán)藻藻泥飼料組草金魚(yú)終末體質(zhì)量顯著升高（P<0.05），飼喂添加脫毒藍(lán)藻藻泥飼料組草金魚(yú)終末體重與對(duì)照組草金魚(yú)體終末質(zhì)量差異不顯著（P>0.05）。與飼喂添加脫毒藍(lán)藻藻泥飼料組草金魚(yú)相比，飼喂添加等量藍(lán)藻藻泥飼料組草金魚(yú)終末質(zhì)量顯著降低（P<0.05）。

2.2 添加藍(lán)藻藻泥飼料和脫毒藍(lán)藻藻泥飼料對(duì)草金魚(yú)體色和類(lèi)胡蘿卜素含量的影響

如表1所示，各試驗(yàn)組草金魚(yú)L*白度值均無(wú)顯著差異（P>0.05）;與對(duì)照組相比，飼喂添加藍(lán)藻藻泥飼料后，草金魚(yú)體表a*紅度值顯著升高（P<0.05），而飼喂添加脫毒藍(lán)藻藻泥飼料草金魚(yú)a*紅度值與對(duì)照組差異不顯著（P>0.05）;飼喂添加67%藍(lán)藻藻泥飼料草金魚(yú)b*黃度值顯著高于其余各試驗(yàn)組（P<0.05），其余各試驗(yàn)組間b*黃度值均無(wú)顯著差異（P>0.05）。皮膚中類(lèi)胡蘿卜素含量變化與b*黃度值變化一致，飼喂添加67%藍(lán)藻藻泥飼料草金魚(yú)類(lèi)胡蘿卜素含量顯著高于其余各試驗(yàn)組（P<0.05）。綜合比較草金魚(yú)皮膚中類(lèi)胡蘿卜素含量與體表色度指標(biāo)判定，添加67%藍(lán)藻藻泥飼料對(duì)改善試驗(yàn)魚(yú)體色效果最好。

2.3 添加藍(lán)藻藻泥飼料和脫毒藍(lán)藻藻泥飼料對(duì)草金魚(yú)組織中MCs含量的影響

如表2所示，對(duì)照組草金魚(yú)內(nèi)臟和肌肉內(nèi)均未檢測(cè)到MC-RR和MC-LR。飼喂添加藍(lán)藻藻泥飼料和脫毒藍(lán)藻藻泥飼料后，草金魚(yú)內(nèi)臟和肌肉內(nèi)均能檢測(cè)到MC-RR存在，其中飼喂添加67%藍(lán)藻藻泥飼料組草金魚(yú)組織內(nèi)MC-RR含量最高。與飼喂添加藍(lán)藻藻泥飼料草金魚(yú)相比，雖然飼喂等量脫毒藍(lán)藻藻泥飼料后草金魚(yú)組織內(nèi)MC-RR含量降低，但無(wú)顯著差異（P>0.05）。飼喂添加藍(lán)藻藻泥飼料和脫毒藍(lán)藻藻泥飼料后，草金魚(yú)內(nèi)臟內(nèi)均能檢測(cè)到MC-LR存在，且各添加組間差異不顯著（P>0.05），僅飼喂添加67%藍(lán)藻藻泥飼料組的草金魚(yú)肌肉內(nèi)檢查到了MC-LR。

3 ?結(jié)論與討論

微藻富含高蛋白、碳水化合物和脂類(lèi)，因此作為飼料添加劑具有高營(yíng)養(yǎng)價(jià)值，以其作為漁用營(yíng)養(yǎng)源應(yīng)用于水產(chǎn)養(yǎng)殖生產(chǎn)備受關(guān)注[10]。藍(lán)藻同樣富含蛋白質(zhì)、微量元素、類(lèi)胡蘿卜素等[6-7]，可作為漁用飼料蛋白源和增色劑應(yīng)用，但是藍(lán)藻細(xì)胞內(nèi)毒素的存在卻是限制其應(yīng)用價(jià)值的主要障礙。如何發(fā)揮藍(lán)藻的營(yíng)養(yǎng)作用，同時(shí)降低其潛在的毒性作用是藍(lán)藻飼料資源化利用時(shí)亟待解決的問(wèn)題。攝食含低劑量藻毒素的藍(lán)藻粉可提高魚(yú)類(lèi)的攝食率，同時(shí)飼料中的藍(lán)藻粉會(huì)降低魚(yú)類(lèi)的飼料轉(zhuǎn)化率和消化率[11-13]，并且不同魚(yú)類(lèi)對(duì)藻毒素的耐受性不同[14]。因此，我們選擇對(duì)藍(lán)藻進(jìn)行適當(dāng)?shù)某暶摱咎幚聿⒁杂^(guān)賞用草金魚(yú)作為試驗(yàn)對(duì)象，探討藍(lán)藻在觀(guān)賞魚(yú)養(yǎng)殖中作為飼料蛋白質(zhì)來(lái)源的潛在價(jià)值。通過(guò)機(jī)械打撈后的藍(lán)藻經(jīng)噴霧干燥法制成干粉代價(jià)昂貴，而晾曬除水則會(huì)導(dǎo)致?tīng)I(yíng)養(yǎng)成分流失。因此，為了降低前處理成本并最大限度地保留其營(yíng)養(yǎng)成分，本研究飼料中藍(lán)藻以真空抽濾后獲得藻泥形式進(jìn)行添加，制備的藍(lán)藻藻泥與干粉之間的質(zhì)量換算比例100∶1。

本試驗(yàn)打撈用藍(lán)藻主要為銅綠微囊藻，MC-LR和MC-RR是微囊藻中存在最普遍、含量最多兩種MCs異構(gòu)體，MC-LR的急性毒性強(qiáng)于MC-RR[14]。飼喂添加藍(lán)藻藻泥飼料和脫毒藍(lán)藻藻泥飼料后，草金魚(yú)肌肉和內(nèi)臟內(nèi)均有MC-RR蓄積，且在內(nèi)臟內(nèi)均檢測(cè)到MC-LR蓄積，肌肉內(nèi)僅在飼喂添加67%藍(lán)藻試驗(yàn)組內(nèi)檢測(cè)到MC-LR蓄積。雖然與飼喂67%藍(lán)藻草金魚(yú)相比，飼喂等量脫毒藍(lán)藻顯著降低了草金魚(yú)肌肉內(nèi)MC-LR含量，但內(nèi)臟中的MC-LR含量，以及肌肉和內(nèi)臟中的MC-RR含量并未受到藍(lán)藻脫毒的影響。分析其原因，可能在于超聲波處理雖然能夠有效降解胞外毒素[6，15]，但是對(duì)未釋放到胞外的胞內(nèi)毒素降解效果差。

飼料中添加藍(lán)藻藻泥能顯著促進(jìn)草金魚(yú)的生長(zhǎng)，但藍(lán)藻經(jīng)超聲脫毒后未發(fā)揮促生長(zhǎng)作用。草金魚(yú)對(duì)MCs耐受性較強(qiáng)，因此在2種藍(lán)藻添加量下，藍(lán)藻對(duì)草金魚(yú)的營(yíng)養(yǎng)物作用大于其潛在的毒性作用。另外，隨著藍(lán)藻添加量增大，MCs蓄積量增加，其潛在毒性作用增強(qiáng)，因此較低添加量（50%）藍(lán)藻促生長(zhǎng)效果更為明顯。而超聲脫毒處理可能破壞藍(lán)藻某些營(yíng)養(yǎng)成分，因而使得經(jīng)超聲脫毒藍(lán)藻未表現(xiàn)出顯著促生長(zhǎng)作用。

在觀(guān)賞魚(yú)體色呈現(xiàn)中，類(lèi)胡蘿卜素起到關(guān)鍵作用，但魚(yú)體自身不具備合成相關(guān)類(lèi)胡蘿卜素的能力，只能通過(guò)飼料添加方式從外界攝取[16]。因此，在飼料中添加增色劑促進(jìn)魚(yú)體增色，是提高觀(guān)賞性魚(yú)類(lèi)觀(guān)賞價(jià)值的可靠方法。白東清等[17]研究表明，在飼料中添加一定水平的鹽藻、裂壺藻以及玉米蛋白粉可提高魚(yú)體類(lèi)胡蘿卜素含量，提高魚(yú)體的黃度。劉夢(mèng)雨等[18]通過(guò)試驗(yàn)得出，投喂添加不同水平的螺旋藻、裂壺藻和大型溞粉組合飼料30或60 d后，經(jīng)檢測(cè)，皮膚、鱗片、鰭條中類(lèi)胡蘿卜素含量均隨著組合飼料添加水平的增加呈現(xiàn)先升后降的變化趨勢(shì)，飼料中含8%螺旋藻、2%裂壺藻、8%大型溞粉的組合飼料對(duì)改善試驗(yàn)魚(yú)體色效果較好。孫金輝等[19]的試驗(yàn)中，鹽藻組慈鯛皮膚中總類(lèi)胡蘿卜素的含量要顯著高于對(duì)照組、裂壺藻組和小球藻組，添加藻粉后各組鰭條中總類(lèi)胡蘿卜素的含量均顯著高于對(duì)照組（P<0.05），這表明鹽藻中的類(lèi)胡蘿卜素經(jīng)過(guò)代謝能夠在血艷紅慈鯛體內(nèi)得到有效轉(zhuǎn)化，從而起到增色效果。楊育凱等[20]研究發(fā)現(xiàn)飼料中添加鹽藻可以增加卵形鯧鲹b*，魚(yú)體體色更為金黃。王磊等[21]認(rèn)為飼料中添加一定量的雨生紅球藻粉對(duì)七彩神仙魚(yú)具有較好的著色效果，尤其是皮膚和鰭條的著色效果尤為顯著，并且低添加量組（3.33 g·kg-1和6.66 g·kg-1）相比于高添加劑量（9.99，13.32和16.65 g·kg-1）對(duì)七彩神仙魚(yú)皮膚和鰭條的增色效果顯著提高（P<0.05）。本研究結(jié)果證明飼料中添加適量藍(lán)藻同樣能夠改善試驗(yàn)魚(yú)體色，綜合比較草金魚(yú)皮膚中類(lèi)胡蘿卜素含量與體表色度指標(biāo)判定，添加67%藍(lán)藻藻泥飼料改善體色效果最好。上述試驗(yàn)結(jié)果表明，試驗(yàn)魚(yú)種類(lèi)及其對(duì)不同種類(lèi)微藻的耐受性都會(huì)影響微藻的體色改良效果。

綜上所述，草金魚(yú)對(duì)MCs有較強(qiáng)的耐受性，飼喂添加藍(lán)藻藻泥飼料既可以促進(jìn)草金魚(yú)生長(zhǎng)，亦會(huì)改善草金魚(yú)體色，但超聲波處理對(duì)藍(lán)藻胞內(nèi)毒素脫除效果不佳，并有可能破壞藍(lán)藻營(yíng)養(yǎng)成分，因此添加超聲脫毒藍(lán)藻未表現(xiàn)出明顯促生長(zhǎng)作用和增色效果。

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