王業(yè)建，楊 杰，梁曉玲，阿布來提·阿布拉，韓登旭，郗浩江，劉俊，李銘東

(新疆農(nóng)業(yè)科學(xué)院糧食作物研究所，烏魯木齊 830091)

0 引 言

【研究意義】玉米是我國三大糧食作物之一，生長期較長，需水較多、對干旱比較敏感。而我國的干旱、半干旱地區(qū)約占全國土地面積的1/2，半濕潤、甚至濕潤地區(qū)也常會有周期性的、季節(jié)性的或臨時性的干早，干旱成為影響玉米產(chǎn)量的重要限制因子，一般可使玉米減產(chǎn)20%～30%[1]，研究玉米響應(yīng)干旱脅迫的機理對提高玉米的耐旱能力有實際意義?！厩叭搜芯窟M展】耐旱性是一個極其復(fù)雜的生物學(xué)過程，涉及形態(tài)結(jié)構(gòu)、生理生化代謝、基因表達調(diào)控等方面的適應(yīng)性變化。在玉米抗旱性鑒定的方法與指標(biāo)[2]，耐旱相關(guān)性狀QTLs的挖掘[3-5]，耐旱相關(guān)的功能基因和調(diào)控基因的克隆等取得了一定進展。李鳳海[2]采用盆栽、田間和實驗室模擬水分脅迫等手段, 選用不同雜交種和自交系，分別測定形態(tài)學(xué)、生理學(xué)、產(chǎn)量等指標(biāo)，借助灰色關(guān)聯(lián)度分析法、隸屬函數(shù)值法等科學(xué)統(tǒng)計分析方法，對玉米抗旱性進行了系統(tǒng)研究, 建立了玉米抗旱性的評價體系。李春輝[5]以包含11個RIL群體、2 000個家系的溫帶玉米巢式關(guān)聯(lián)作圖群體(CN-NAM);與包含25個組合、5 000個家系的美國NAM群體(US-NAM)為研究材料, 采用田間干旱脅迫和正常水分處理，對包括ASI、株高、單株產(chǎn)量、穗重、穗長、行粒數(shù)和百粒重等耐旱相關(guān)性狀進行連鎖分析，發(fā)現(xiàn)CN-NAM群體的7個耐旱相關(guān)性狀在正常水分條件下定位到108個QTL、在干旱脅迫下定位到91個QTL;US-NAM群體的7個耐旱相關(guān)性狀在正常水分條件下定位到112個QTL、在干旱脅迫下檢測91個QTL。CN-NAM與US-NAM在正常水分環(huán)境和干旱脅迫環(huán)境下的一致性QTL分別為32和18個。Mao H等[6]利用全球不同地區(qū)的368份玉米自交系組成的自然變異群體，在幼苗期進行干旱脅迫，運用全基因組關(guān)聯(lián)分析，研究發(fā)現(xiàn)位于玉米第10號染色體上的一個編碼NAC轉(zhuǎn)錄因子的基因ZmNAC111對玉米耐旱性起到了重要作用。Wang X等[7]利用全基因組關(guān)聯(lián)分析，結(jié)合候選基因分析策略，對玉米苗期的抗旱QTLs進行掃描，克隆了一個定位于液泡膜上的質(zhì)子泵-焦磷酸水解酶基因ZmVPP1，過表達該基因的植株在干旱脅迫下，耐旱性顯著提高?！颈狙芯壳腥朦c】由于玉米耐旱性的響應(yīng)機制相當(dāng)復(fù)雜，目前有關(guān)玉米耐旱性研究還未完全詮釋在干旱脅迫下玉米基因表達調(diào)控網(wǎng)絡(luò)。隨著2代測序技術(shù)的快速發(fā)展和廣泛應(yīng)用，轉(zhuǎn)錄組測序成為了研究基因表達變化和基因表達調(diào)控網(wǎng)絡(luò)的有效手段，已有一些報道其在水稻[8]、大豆[9]、小麥[10]、和玉米[11-13]的抗旱研究上應(yīng)用。如Kaahumanu等使用轉(zhuǎn)錄組測序的方法發(fā)現(xiàn)玉米雌穗受到干旱脅迫后與細胞分裂相關(guān)的基因和ABA信號通路相關(guān)的基因表達增加，而與碳水化合物代謝、蔗糖和淀粉代謝相關(guān)的基因表達減少。但應(yīng)用在玉米雄穗干旱脅迫的報道較少。開花期在玉米整個生育期中是對干旱脅迫最敏感，而從減數(shù)分裂到四分體花粉母細胞的時期又是開花期中最敏感的時期，這時的干旱脅迫可引起雄配子的發(fā)育不良，影響最終產(chǎn)量。但這一時期玉米響應(yīng)干旱脅迫的基因表達調(diào)控網(wǎng)絡(luò)依然不清楚?！緮M解決的關(guān)鍵問題】研究利用RNA-seq對干旱脅迫下耐旱自交系“PHBA6”和干旱敏感自交系“吉63”花器官分化期的雄穗轉(zhuǎn)錄組表達情況進行研究，結(jié)合生物信息學(xué)分析，挖掘可能參與耐旱調(diào)控相關(guān)的基因，研究玉米耐旱的分子機理，克隆耐旱相關(guān)基因，為開展玉米耐旱遺傳改良提供新的理論和技術(shù)依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 材 料

材料為耐旱自交“PHBA6”(PHZ51×PHG47)和干旱敏感自交系“吉63”[(127-32×鐵84)(W24×W20)輻)], 由新疆農(nóng)業(yè)科學(xué)院糧食作物研究所提供。

于2017年在新疆農(nóng)科院海南三亞科技示范園基地大棚分期播種，前期進行正常的滴灌澆水處理，待這2個自交系的雄穗處于花器官分花期時進行干旱脅迫處理，同時進行正常滴灌澆水處理作為對照，干旱處理15 d后，分別取干旱處理的“PHBA6”和“吉63”的雄穗(分別命名為PDST15和JDST15)，以及對照處理的“PHBA6”和“吉63”的雄穗(命名為PNTT15和JNTT15)，迅速包好放入液氮中, 于-80℃保存。

1.2 方 法

1.2.1 雄穗花器官RNA的提取

根據(jù)試劑盒說明書，使用Trizol試劑(Invitrogen，USA)從每個樣本中提取總RNA。使用NanoPhotometer分光光度計(IMPLEN,USA)和Bioanalyzer2100系統(tǒng)(Agilent Technologies, USA)檢測RNA的純度和完整性，質(zhì)量符合標(biāo)準(zhǔn) OD260/280 >2.0、OD260/230>1.0、RNA濃度>240 ng/μL和RIN>7.5的RNA樣品進行后續(xù)的測序文庫構(gòu)建。

1.2.2 測序文庫構(gòu)建和測序

將所有的總RNA樣品在杭州聯(lián)川生物測序。將poly-A + RNA剪切成約200 bp的短片段，并使用隨機六聚體引物和逆轉(zhuǎn)錄酶(Qiagen，Duesseldorf，Germany)將切割的RNA片段復(fù)制到第一鏈cDNA中。在含有DNA聚合酶I，RNaseH，緩沖液和dNTP(TransGen Biotech，北京)的反應(yīng)體系中合成第二鏈cDNA。使用AMPure XP珠(Beckman Coulter，USA)純化cDNA片段。通過PCR在反應(yīng)中富集銜接子連接cDNA以產(chǎn)生最終的cDNA文庫。在Illumina HiSeq 2000平臺(Illumina，USA)上對文庫進行測序。

1.2.3 測序數(shù)據(jù)的質(zhì)量控制和序列比對

各樣品中測序產(chǎn)生的原始數(shù)據(jù)Raw reads去除帶有接頭序列的 reads，包含 poly-N的reads，低質(zhì)量的reads，最終得到clean reads。這些預(yù)處理得到的clean reads進行參考基因組比對，首先從Ensembl Plants 數(shù)據(jù)庫中下載玉米參考基因組(B73_RefGen_v4)的序列文件和基因注釋文件，使用Bowtie v2.2.3 軟件建立序列比對參考基因組的索引，然后使用 TopHat v2.0.12 軟件進行測序序列的比對。

1.2.4 干旱脅迫下差異mRNA篩選及功能富集

根據(jù)比對到參考基因組的測序結(jié)果，利用R語言的DESeq包計算基因在各樣品中的表達豐度，表達豐度用FPKM值來衡量，其計算公式為：

其中Xi為i基因所測得的reads數(shù)，Li為該基因的長度，N為所測得的總reads數(shù),采用|log2foldchange|≥1，P<0.05，F(xiàn)DR≤0.001篩選出樣本間的差異表達基因。對篩選出的差異基因進行GO功能注釋和pathway顯著性富集分析，其中GO功能注釋使用 Gene Ontology 數(shù)據(jù)庫(www.geneontolgy.org)來預(yù)測差異表達基因的生物學(xué)功能，pathway顯著性富集分析使用使用KEEG數(shù)據(jù)庫來確定差異表達基因參與的最主要生化代謝途徑和信號轉(zhuǎn)導(dǎo)途徑。

2 結(jié)果與分析

2.1 轉(zhuǎn)錄組測序質(zhì)控和序列比對

研究表明，對4個轉(zhuǎn)錄組文庫測序數(shù)據(jù)數(shù)據(jù)過濾和質(zhì)量控制后，共產(chǎn)生2.27 billion 的 clean reads，除了PNTT15外，其余3組Clean reads 的總數(shù)均達到了 57 millions以上,堿基質(zhì)量值是衡量測序準(zhǔn)確度的指標(biāo),在4個文庫中測序堿基質(zhì)量大于Q30(測序錯誤率小于0.001)所占比例都均高于93%，測序結(jié)果準(zhǔn)確可靠。分別將各庫中的 clean reads 比對到玉米參考基因組，均有超過82%的 clean reads能夠比對上，其中比對率最高的為JDST15，有 87.86%的 clean reads 能夠比對上參考基因組。而能比對到了參考基因組的唯一位置(uniquely mapped)的clean reads平均占到能比對到參考基因組的69%，這些clean reads用于后續(xù)的表達分析。表1

表1 文庫測序數(shù)據(jù)比對

2.2 干旱脅迫下差異表達基因鑒定

研究表明，得到2組差異表達基因集：JDST15-JNTT15和PDST15-PNTT15。與正常水分處理相比，干旱敏感自交系“吉63”(JDST15-JNTT15)在干旱脅迫下有1 300個差異表達基因(|log2(fold change)|>1，F(xiàn)DR<0.001)，其中上調(diào)表達的有691個，下調(diào)表達的有609個；耐旱自交“PHBA6”(PDST15-PNTT15)有1 394個差異表達基因，其中上調(diào)表達的有778個，下調(diào)表達的有616個；比較2個自交系中干旱和正常水分之間的差異表達基因，發(fā)現(xiàn)2個自交系中共有差異表達基因831個，其中共同上調(diào)表達的有425個，而共同下調(diào)的基因397個，這822個基因在干旱脅迫下的2個自交系中的上下調(diào)表達趨勢是一致的，這些基因在參與玉米干旱脅迫響應(yīng)時的表達模式保守，另外還有9個基因在2個自交系中具有相反的表達模式。除這些基因外，耐旱自交“PHBA6”和敏感自交系“吉63” 各自分別還有563個和469個基因型特異的干旱響應(yīng)基因。表2

表2 干旱脅迫差異表達基因

2.3 差異表達基因的Gene Ontology富集

研究表明，在耐旱自交“PHBA6”中，563個特異干旱響應(yīng)基因顯著富集在175個GO條目上，其中富集在生物學(xué)途徑121個；分子功能5個；細胞組件49 個。在生物學(xué)途徑中，與脅迫相關(guān)的許多GO條目被富集，包括“response to abiotic stimulus”，“response to cadmium ion”，“response to heat”，“response to osmotic stress”，“response to oxidative stress” 等，其他富集的GO條目還包括與碳水化合物代謝(“carbohydrate metabolic process”)，有機氮化合物代謝(“organonitrogen compound metabolic process”)，細胞壁改變(“cell wall organization or biogenesis”)，激素合成調(diào)控(“brassinosteroid biosynthetic process”)，氧化還原酶活性調(diào)控(“positive regulation of oxidoreductase activity”)，分子功能主要包括“structural constituent of ribosome” , “unfolded protein binding”, 細胞組件主要包括“vacuolar membrane”, “ribosome”, “nucleolus”, “cell wall”,而在敏感自交系“吉63”中，469個特異干旱響應(yīng)基因顯著富集在195個GO條目上，其中富集在生物學(xué)途徑143個；分子功能5個；細胞組件47 個。在生物學(xué)途徑中，與脅迫相關(guān)許多GO條目也被富集，包括“response to abiotic stimulus”，“response to cadmium ion”，“response to biotic stimulus”，“response to osmotic stress”，“response to hormone” 等，其他富集的GO條目還包括與細胞壁改變(“cell wall organization or biogenesis”)，光合作用(“photosynthesis”)，形態(tài)建成(“anatomical structure formation involved in morphogenesis”)，分子功能主要包括“structural molecule activity” , “hydrolase activity”, “chlorophyll binding”，細胞組件主要包括“chloroplast thylakoid membrane”, “vacuole”, “cell wall”。圖1

A：PHBA6 B：吉63

對耐旱自交“PHBA6”和干旱敏感自交系“吉63”共有的831個干旱響應(yīng)基因中(JDST15-JNTT15和PDST15-PNTT15差異表達基因集)，9個基因具有相反表達模式，其中5個基因在干旱敏感自交系 “吉63” 中上調(diào)表達而在耐旱自交“PHBA6”中下調(diào)表達，包括脫水素基因(Zm00001d051420)，非特異性脂轉(zhuǎn)移蛋白基因(Zm00001d023343)，光系統(tǒng)I反應(yīng)中心亞基V基因(Zm00001d020877), 蛋白激酶C受體蛋白基因(Zm00001d009480), 6-磷酸葡萄糖酸內(nèi)酯酶基因(Zm00001d006185)，4個基因在干旱敏感自交系 “吉63” 中下調(diào)表達而在耐旱自交“PHBA6”中上調(diào)表達，包括60S核糖體蛋白L21基因(Zm00001d048382), 硫胺素合成酶基因(Zm00001d044228)，肽酰脯氨酰順反異構(gòu)酶基因(Zm00001d025062), 酸性核糖體蛋白P3基因(Zm00001d014679)。表3

表3 干旱脅迫下2個自交系中表達趨勢相反的基因

2.4 差異表達基因的KEGG通路

在生物體內(nèi)，不同基因相互協(xié)調(diào)行使其生物學(xué)功能，通過KEGG Pathway 顯著性富集能確定各基因參與的主要代謝途徑和信號轉(zhuǎn)導(dǎo)途徑。對同一材料不同處理條件下耐旱自交“PHBA6”的563個基因型特異的干旱響應(yīng)基因進行KEGG Pathway分析，發(fā)現(xiàn)這些基因可以比對注釋到116類 KEGG 的代謝通路中，其中6個代謝通路富集達到差異顯著(P<0.05)，主要包括Ribosome，Phagosome，Citrate cycle，Biotin metabolism，Protein processing in endoplasmic reticulum和Amino sugar and nucleotide sugar metabolism，而敏感自交系“吉63” 的469個基因型特異干旱響應(yīng)基因的KEGG Pathway分析表明，這些基因可以比對注釋到 97類 KEGG 的代謝通路中，其中15個代謝通路富集達到差異顯著(P<0.05)，主要包括Starch and sucrose metabolism, Ribosome, Phenylpropanoid biosynthesis, Amino sugar and nucleotide sugar metabolism, Oxidative phosphorylation和Pentose and glucuronate interconversions。圖2

A：PHBA6 B：吉63 ji:63

3 討 論

3.1 PHBA6和吉63 對干旱脅迫的響應(yīng)存在差異

玉米雄穗花器官分化期是玉米對干旱脅迫最敏感的時期，遭受干旱脅迫會對玉米產(chǎn)量造成嚴(yán)重影響，因而在長期的進化過程中，玉米會形成適應(yīng)性的響應(yīng)機制。干旱脅迫下，玉米會發(fā)生多種生理生化反應(yīng)，誘導(dǎo)或抑制各種調(diào)節(jié)蛋白和功能蛋白表達，從而對水分脅迫作出響應(yīng)。在研究中，在耐旱自交“PHBA6”和干旱敏感自交系“吉63”在干旱脅迫下分別有1 394和1 300個顯著差異表達基因，而且上下調(diào)表達趨勢一致的共有差異表達基因822個，通過功能分析發(fā)現(xiàn)很多基因是與非生物脅迫，細胞壁形態(tài)改變，核糖體組裝，氣孔運動，碳水化合物代謝相關(guān)的，表明這些基因是干旱脅迫下保守的響應(yīng)基因，其參與的代謝途徑也是玉米響應(yīng)干旱脅迫所必須的。這與一些前人研究玉米干旱脅迫下轉(zhuǎn)錄組的變化一致，郝陸洋[14]對大田持續(xù)干旱處理的耐旱材料 H082183和不耐旱材料Lv28進行轉(zhuǎn)錄組分析，發(fā)現(xiàn)2個材料共有的差異表達基因顯著富集于脅迫響應(yīng)、代謝通路、細胞壁改變和胞外區(qū)中。

除了這些共有差異表達基因外，耐旱自交系“PHBA6”和干旱敏感自交系“吉63”分別還有563個和469個基因型特異的干旱響應(yīng)基因，通過GO功能和KEGG通路富集分析，發(fā)現(xiàn)這些基因功能和參與的代謝通路不盡相同，在耐旱自交“PHBA6”中響應(yīng)鈣離子的基因不僅比干旱敏感自交系“吉63”多，而且絕大部分上調(diào)表達，而在干旱敏感自交系“吉63”中，上下調(diào)的基因數(shù)相差不多，另外在共有差異表達基因中，還存在10個基因具有相反的表達模式，這表明耐旱耐旱自交系“PHBA6”存在與干旱敏感自交系“吉63”不同的干旱響應(yīng)機制。

3.2 與干旱脅迫相關(guān)的脫水蛋白

脫水素(dehydrin,DHN)屬于LEA蛋白第二家族成員, 具有熱穩(wěn)定性和高親水性，同時也具有類似分子伴侶的特性，能夠穩(wěn)定蛋白質(zhì)的結(jié)構(gòu)，是一種植物中廣泛存在的親水性蛋白。Bonhomme等[15]發(fā)現(xiàn)在玉米中脫水蛋白的磷酸化水平在干旱脅迫下顯著提高,其磷酸化有利于其與Ca2+結(jié)合，可以對Ca2+起到緩沖的作用，具有鈣依賴類分子伴侶的活性，與鈣網(wǎng)蛋白和鈣聯(lián)結(jié)蛋白相似。在研究中，一個編碼脫水素的基因Zm00001d051420干旱脅迫下在吉63中上升表達，而在PHBA6中下調(diào)表達，而PHBA6中特有的編碼脫水素差異表達基因Zm00001d037894和Zm00001d012776 一個下調(diào)表達，一個上調(diào)表達，表明脫水蛋白在PHBA6響應(yīng)干旱脅迫中具有重要作用。

3.3 與干旱脅迫相關(guān)的轉(zhuǎn)錄因子

轉(zhuǎn)錄因子在植物響應(yīng)干旱脅迫的信號轉(zhuǎn)導(dǎo)通路中具有不可取代的作用。對耐旱自交系PHBA6中的干旱脅迫特異差異表達基因的功能進一步分析，發(fā)現(xiàn)MYB、bZIP和ERF轉(zhuǎn)錄因子各1個。MYB轉(zhuǎn)錄因子氨基酸序列中通常含有 1～4 個串聯(lián)的 MYB 結(jié)構(gòu)域，可以與 DNA 分子結(jié)合。一些MYB轉(zhuǎn)錄因子也可以響應(yīng)干旱等逆境脅迫，Wang等[16]研究發(fā)現(xiàn)，ZmMYB48在轉(zhuǎn)基因擬南芥中過表達會增強擬南芥耐旱性，進一步證明該基因參與雄穗耐旱調(diào)控，研究中一個編碼MYB轉(zhuǎn)錄因子的基因Zm00001d032206在耐旱自交系PHBA6受干旱脅迫后表達量上升。bZIP轉(zhuǎn)錄因子包括一個保守的 bZIP 結(jié)構(gòu)域，其中 DNA 結(jié)合結(jié)構(gòu)域能與其靶基因啟動子中的順式作用元件 ACGT 序列特異結(jié)合。bZIP 轉(zhuǎn)錄因子家族成員不僅能夠調(diào)控植物的生長發(fā)育，而且還能夠積極的參與植物的生物和非生物脅迫響應(yīng)。Ying等[17]發(fā)現(xiàn)ZmbZIP72 被高鹽和干旱脅迫誘導(dǎo)表達，且能夠通過ABA 依賴途徑積極調(diào)控轉(zhuǎn)基因植株的耐鹽性和耐旱性。研究發(fā)現(xiàn)的一個編碼bZIP轉(zhuǎn)錄因子的基因Zm00001d039383在耐旱自交系PHBA6受干旱脅迫后表達量下降。ERF轉(zhuǎn)錄因子是AP2/ERF轉(zhuǎn)錄因子家族的一個亞家族，可以識別含GCC盒(AGCCGCC)的序列，參與應(yīng)答生物脅迫，但在植物響應(yīng)非生物脅迫中也具有一定的作用。Wang等[18]發(fā)現(xiàn)ERF轉(zhuǎn)錄因子GRMZM2G380377通過結(jié)合脫水響應(yīng)元件發(fā)揮作用，過表達該基因的擬南芥植株對干旱脅迫和冷脅迫的抵抗能力增強。研究中一個編碼bZIP轉(zhuǎn)錄因子的基因Zm00001d015759在耐旱自交系PHBA6受干旱脅迫后表達量上升。

4 結(jié) 論

玉米雄穗花器官分化期干旱脅迫是造成玉米減產(chǎn)的重要因素，耐旱相關(guān)的調(diào)控基因和功能基因在玉米耐旱性適應(yīng)機制上起到重要作用。耐旱自交“PHBA6”和干旱敏感自交系“吉63” 分別有1 394和1 300個基因在干旱脅迫下表達量差異顯著，并且耐旱自交“PHBA6”還具有563個基因型特異的干旱響應(yīng)基因，這些基因富集分析發(fā)現(xiàn)參與非生物脅迫，細胞壁形態(tài)改變，核糖體組裝，氣孔運動，碳水化合物代謝等生物學(xué)過程，并篩選出耐旱自交“PHBA6”中在干旱脅迫下差異表達的3個脫水素基因和3個特有差異表達的bZIP、MYB和ERF轉(zhuǎn)錄因子。