宋巖，關(guān)樺楠，劉博，龔德狀，張娜

（哈爾濱商業(yè)大學(xué)食品工程學(xué)院，黑龍江哈爾濱150076）

黃酮類化合物是最大的天然酚類產(chǎn)品之一[1]。葛根（puerariae lobatae radix，PLR）是豐富的異黃酮類化合物的來源，異黃酮類化合物的有益作用主要是由于其抗氧化的特性，PLR的營(yíng)養(yǎng)價(jià)值與其異黃酮衍生物密切相關(guān)，因此對(duì)葛根黃酮的深入研究日益成為人們關(guān)注的焦點(diǎn)[2-3]。傳統(tǒng)方法通常采用浸漬法、回流法、大孔樹脂吸附和酶解法等不同工藝從PLR中分離葛根素、大豆苷、大豆苷元等主要活性成分，或通過微波和超聲波進(jìn)行預(yù)處理，或輔助這些常規(guī)方法進(jìn)行工藝優(yōu)化[4-6]。一般來說，這些傳統(tǒng)技術(shù)需要大量的揮發(fā)性試劑和有害試劑，提取時(shí)間長(zhǎng)，能耗大、提取率低，限制了其在工業(yè)上的應(yīng)用。因此，開發(fā)一種高效安全的新技術(shù)應(yīng)用于食品與制藥工業(yè)中天然產(chǎn)物的提取具有重要的意義。

超聲輔助提取已被證明在輔助植物材料提取過程中可以顯著縮短提取時(shí)間和提高提取率。在超聲應(yīng)用過程中，會(huì)產(chǎn)生空化效應(yīng)和機(jī)械效應(yīng)，從而使溶劑更容易滲透到植物原料中，破壞植物細(xì)胞壁，促進(jìn)有效成分釋放[7-8]。離子液體（ionic liquids，ILs）被稱為“設(shè)計(jì)師溶劑”，可以通過不同陰離子和陽離子的各種偶聯(lián)進(jìn)行設(shè)計(jì)，可溶于水和有機(jī)溶劑，萃取能力強(qiáng)，穩(wěn)定性良好[9-11]。在超聲、微波和升高溫度等方法輔助下，可進(jìn)一步提升其提取效果[12]，并在從自然資源中提取類黃酮、酚酸、生物堿、萜類等化合物的應(yīng)用中取得了成功[13-15]。近年來，超聲波/微波輔助萃取技術(shù)得到了發(fā)展，并在萃取效率、經(jīng)濟(jì)成本等方面取得了顯著的進(jìn)展。因此，本文采用離子液體-超聲波輔助法，以葛根提取物為原料，以溴化-1-丁基-3-甲基咪唑（1-butyl-3-methylimidazolium bromide，[bmim]Br） 為提取劑，通過正交試驗(yàn)設(shè)計(jì)優(yōu)化提取工藝參數(shù)，同時(shí)對(duì)提取物的DPPH自由基清除效果進(jìn)行研究，為深入探索其綜合利用價(jià)值提供依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 材料與儀器

1.1.1 材料與試劑

葛根提取物：晨光生物科技集團(tuán)股份有限公司；葛根素標(biāo)準(zhǔn)品：酷爾化學(xué)科技（北京）有限公司；溴化-1-丁基-3-甲基咪唑：上海愛純生物科技有限公司；95%乙醇：天津市富宇精細(xì)化工有限公司；無水乙醇：天津新技術(shù)產(chǎn)業(yè)園區(qū)科茂化學(xué)試劑有限公司；DPPH：福州飛凈生物科技有限公司；抗壞血酸：天津市天力化學(xué)試劑有限公司。

1.1.2 儀器與設(shè)備

FA2004型電子天平：上海越平科學(xué)儀器有限公司；KQ-250E型超聲波清洗器：昆山市超聲儀器有限公司；TD5A型離心機(jī)：鹽城市凱特實(shí)驗(yàn)儀器有限公司；UV 5500PC型紫外分光光度計(jì)：上海元析儀器有限公司。

1.2 試驗(yàn)方法

1.2.1 葛根黃酮的提取

采用離子液體-超聲波輔助法提取葛根黃酮。

1.2.1.1 標(biāo)準(zhǔn)曲線的繪制

在電子天平上準(zhǔn)確稱取葛根素5 mg，用95%乙醇配成0.1 mg/mL的標(biāo)準(zhǔn)品溶液，從中精密吸取0.5、1.0、1.5、2.0、2.5、3.0 mL，用去離子水補(bǔ)充至 10 mL。取1.0 mL 95%乙醇加去離子水補(bǔ)充至10 mL作為空白對(duì)照溶液。分別在250 nm波長(zhǎng)處測(cè)定吸光度值，繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線圖，得到吸光度與葛根素濃度的回歸方程為y=72.834x+0.059 1，相關(guān)系數(shù)R2=0.997 4。在0～0.03 mg/mL范圍內(nèi)呈良好的線性相關(guān)。

1.2.1.2 葛根黃酮提取量的測(cè)定

準(zhǔn)確稱取一定質(zhì)量的葛根提取物，按一定固液比加入[bmim]Br，在一定溫度、功率和時(shí)間下，進(jìn)行超聲波輔助提取，將提取液離心取上層清液。在250 nm處測(cè)定樣品中總黃酮所對(duì)應(yīng)的吸光度值后，根據(jù)葛根素標(biāo)準(zhǔn)曲線，計(jì)算葛根黃酮提取量。計(jì)算公式如下：

式中：C為提取液中葛根黃酮的濃度，mg/mL；V為提取液定容體積，mL；M為葛根提取物質(zhì)量，g。

1.2.2 單因素試驗(yàn)

1）固液比對(duì)葛根黃酮提取量的影響：稱取0.5 g葛根提取物，按固液比1 ∶2、1 ∶5、1 ∶10、1 ∶15、1 ∶20、1∶30（g/mL）加入濃度為0.5 mol/L的離子液體，在溫度為70℃，超聲功率250 W，超聲作用時(shí)間25 min的條件下提取，考察固液比對(duì)黃酮提取量的影響。

2）離子液體濃度對(duì)葛根黃酮提取量的影響：稱取0.5 g葛根提取物，按固液比1∶10（g/mL）加入濃度為0.1、0.25、0.5、1.0、1.5、2.0 mol/L 的離子液體，在溫度為70℃，超聲功率250 W，超聲作用時(shí)間25 min的條件下提取，考察離子液體濃度對(duì)黃酮提取量的影響。

3）超聲作用時(shí)間對(duì)葛根黃酮提取量的影響：稱取0.5 g葛根提取物，按固液比1∶10（g/mL）加入濃度為0.5 mol/L的離子液體，在溫度為70℃，超聲功率250 W，超聲作用時(shí)間 10、15、25、30、35、40 min 的條件下提取，考察超聲作用時(shí)間對(duì)黃酮提取量的影響。

1.2.3 正交優(yōu)化試驗(yàn)

在單因素試驗(yàn)的基礎(chǔ)上，以固液比、離子液體濃度、超聲作用時(shí)間為試驗(yàn)因素，進(jìn)行正交優(yōu)化試驗(yàn)確定離子液體-超聲波輔助法提取葛根黃酮的最優(yōu)工藝參數(shù)。

1.2.4 DPPH自由基清除率的測(cè)定

采用最優(yōu)工藝參數(shù)提取葛根樣品中的黃酮，用去離子水稀釋提取液得到質(zhì)量濃度為 10、20、40、60、80、100 μg/mL的葛根黃酮溶液，各取2.0 mL于10 mL具塞刻度試管中。加入 0.04 g/L用無水乙醇配制的DPPH溶液2.0 mL，搖勻避光靜置30 min，離心后取上清液作為試驗(yàn)組，于517 nm波長(zhǎng)處測(cè)出吸光度值A(chǔ)1。再測(cè)出對(duì)照組（用2.0 mL無水乙醇替代試驗(yàn)組中2.0 mL DPPH溶液）以及空白組（用2.0 mL無水乙醇替代試驗(yàn)組中2.0 mL各濃度黃酮溶液）的吸光度值分別為A2、A0。按下式計(jì)算出DPPH自由基清除率：

2 結(jié)果與分析

2.1 單因素試驗(yàn)結(jié)果

2.1.1 固液比對(duì)葛根黃酮提取量的影響

保持其它因素條件不變，不同水平的固液比對(duì)葛根黃酮提取量的影響如圖1所示。

圖1 固液比對(duì)葛根黃酮提取量的影響Fig.1 The influence of soild-to-liquid ratio on the content of pueraria flavones

從圖 1 可以看出，固液比 1 ∶2（g/mL）～1 ∶15（g/mL）范圍內(nèi)，隨著離子液體用量的增加，黃酮提取量從607.02 mg/g提高到702.39 mg/g。而當(dāng)固液比為1 ∶15（g/mL）～1 ∶30（g/mL），黃酮提取量呈下降趨勢(shì)。得率提高的原因是較大的溶劑體積使得樣品與溶劑間的有效成分濃度差變大，可以加速萃取過程中的傳質(zhì)，促進(jìn)更多黃酮在溶質(zhì)介質(zhì)中的擴(kuò)散，而超聲場(chǎng)中的湍動(dòng)效應(yīng)也使得固液界面中傳質(zhì)邊界層變薄，從而增強(qiáng)了擴(kuò)散推動(dòng)力，提高了提取效率[16]。但當(dāng)固液比達(dá)到1∶15（g/mL）后，由于單位體積的料液接收的超聲能量變小，反而不利于黃酮的提取。因此，選擇合適的固液比為 1 ∶15（g/mL）。

2.1.2 離子液體濃度對(duì)葛根黃酮提取量的影響

保持其它因素條件不變，不同水平的離子液體濃度對(duì)葛根黃酮提取量的影響如圖2所示。

由圖2可知，當(dāng)離子液體濃度從0.1 mol/L提高至0.25 mol/L，提取液濃度的增加更容易萃取黃酮類化合物，黃酮提取量從506.24 mg/g提升至649.94 mg/g，大幅增加。當(dāng)[bmim]Br濃度由0.25 mol/L增加至0.5 mol/L，提取量隨之增加，但幅度較小，這說明即使繼續(xù)提高提取液濃度，黃酮提取量也不會(huì)有很大提高。繼續(xù)增大[bmim]Br濃度，當(dāng)濃度大于0.5 mol/L后，濃度的增加會(huì)導(dǎo)致提取液黏度的明顯增大，可能會(huì)影響超聲過程中空化效應(yīng)的作用，黃酮提取量呈下降趨勢(shì)，濃度達(dá)到1.0 mol/L，黃酮提取量趨于平穩(wěn)。因此本試驗(yàn)中0.5 mol/L是比較理想的提取液濃度。

圖2 離子液體濃度對(duì)葛根黃酮提取量的影響Fig.2 The influence of ionic liquid concentration on the content of pueraria flavones

2.1.3 超聲作用時(shí)間對(duì)葛根黃酮提取量的影響

保持其它因素條件不變，不同水平的超聲作用時(shí)間對(duì)葛根黃酮提取量的影響如圖3所示。

圖3 超聲作用時(shí)間對(duì)葛根黃酮提取量的影響Fig.3 The influence of ulatrasonic action time on the content of pueraria flavones

由圖3可見，在超聲作用時(shí)間為25 min時(shí)，黃酮提取量達(dá)到最大。當(dāng)超聲時(shí)間從10 min增加至25 min，黃酮提取量增加且幅度較大，這是由于超聲初期空化作用在一定程度上破壞了葛根的細(xì)胞壁，加之超聲場(chǎng)聚能效應(yīng)和高溫條件的存在，適當(dāng)?shù)匮娱L(zhǎng)提取時(shí)間使目標(biāo)化合物溶出更加充分。當(dāng)時(shí)間由25 min延長(zhǎng)至30 min，溶劑中細(xì)胞內(nèi)外的濃度差達(dá)到平衡，而細(xì)胞內(nèi)其他雜質(zhì)的溶解也會(huì)影響黃酮的浸出，黃酮提取量呈緩慢下降趨勢(shì)。黃酮類化合物本身具有抗氧化性，在溫度70℃的條件下，當(dāng)超聲作用時(shí)間達(dá)到35 min時(shí)，可能存在氧化破壞和蒸煮損失，提取量大幅下降。因此，選擇超聲作用時(shí)間為25 min。

2.2 正交試驗(yàn)結(jié)果

在單因素試驗(yàn)的基礎(chǔ)上，對(duì)固液比、離子液體濃度、超聲作用時(shí)間3個(gè)因素進(jìn)行正交試驗(yàn)，不考慮因素間的交互影響。正交試驗(yàn)因素水平如表1所示，正交試驗(yàn)結(jié)果如表2所示。

表1 正交試驗(yàn)因素水平表Table 1 The factor and level table of orthogonal experiment

表2 正交試驗(yàn)結(jié)果Table 2 Result of orthogonal experiment

由表2中R值看出，各因素對(duì)葛根黃酮提取量的影響大小順序依次為：D＞B＞A，即超聲作用時(shí)間＞離子液體濃度＞固液比，其中超聲作用時(shí)間、離子液體濃度、固液比的極差均大于空白列的極差，說明這3個(gè)因素對(duì)葛根黃酮含量都有影響。通過分析可知，離子液體-超聲波輔助法提取葛根黃酮較佳的提取條件為：A1B2D3，即固液比 1 ∶10（g/mL）、離子液體濃度 0.5 mol/L、超聲作用時(shí)間30 min。在最優(yōu)提取條件下進(jìn)行驗(yàn)證試驗(yàn)，測(cè)得葛根黃酮提取量為774.95 mg/g，高于正交表中最優(yōu)的試驗(yàn)結(jié)果，優(yōu)選案與試驗(yàn)分析結(jié)論相符。

2.3 抗氧化活性研究

植物黃酮對(duì)自由基具有一定的清除能力。葛根黃酮提取物對(duì)DPPH自由基清除率如圖4所示。

圖4 DPPH自由基清除率Fig.4 The scavenging rate to DPPH radical

由圖4可知，以VC為陽性對(duì)照，一定濃度的黃酮提取物對(duì)DPPH自由基具有較強(qiáng)的清除能力，且其清除自由基的能力隨葛根黃酮質(zhì)量濃度的提高而增強(qiáng)，量效關(guān)系良好。葛根黃酮的多環(huán)多酚結(jié)構(gòu)具有自由基捕獲能力，當(dāng)提取物濃度達(dá)到80 μg/mL和100 μg/mL時(shí)，清除率分別達(dá)到了67.7%和78.2%。

3 討論與結(jié)論

離子液體-超聲輔助提取是一種高效、綠色的提取方法，超聲空化效應(yīng)和熱效應(yīng)的輔助促進(jìn)了有效成分的溶出，節(jié)省時(shí)間，降低能耗的同時(shí)，提高了葛根黃酮的提取量。本試驗(yàn)對(duì)離子液體-超聲輔助提取中的固液比、離子液體濃度和超聲作用時(shí)間3個(gè)因素進(jìn)行正交試驗(yàn)條件優(yōu)化，最優(yōu)工藝條件為：固液比1∶10（g/mL）、離子液體濃度0.5 mol/L、超聲作用時(shí)間30 min。在此條件下，葛根黃酮提取量為774.95 mg/g。并考察了葛根黃酮提取物的抗氧化活性，結(jié)果表明一定濃度的黃酮提取物對(duì)DPPH自由基具有顯著的清除能力。與傳統(tǒng)方法相比提取過程簡(jiǎn)單，省時(shí)，且成本較低，為葛根的綜合利用提供參考。