朱廣成，楊慧，路風(fēng)銀，韓俊豪，王童

（河南省農(nóng)業(yè)科學(xué)院農(nóng)副產(chǎn)品加工研究中心，河南鄭州450002）

蘆筍（Asparagus officinalis）為百合科植物，又名石刁柏、龍須菜。其柔軟多汁，風(fēng)味獨(dú)特，營(yíng)養(yǎng)價(jià)值高，富含18種氨基酸、15種礦物質(zhì)元素及多糖、膽堿、甾皂苷、葉酸、黃酮、蘆丁等生物活性物質(zhì)[1-2]，能夠調(diào)節(jié)基體代謝，提高免疫力，對(duì)高血壓、心臟病、白血病、膽結(jié)石、各種腫瘤等都有很好的預(yù)防和治療作用，具有很高的醫(yī)療保健功能[3-5]，是名副其實(shí)的藥食兩用名貴蔬菜，享有“蔬菜之王”美稱。據(jù)聯(lián)合國(guó)糧食及農(nóng)業(yè)組織（Food and Agriculture Organization of the United Nations，F(xiàn)AO）顯示，我國(guó)蘆筍收獲面積和總產(chǎn)量常年位列世界第一，產(chǎn)值超過(guò)100億元，已發(fā)展成為我國(guó)主要經(jīng)濟(jì)支柱產(chǎn)業(yè)[6]。

目前國(guó)內(nèi)外對(duì)蘆筍的營(yíng)養(yǎng)價(jià)值和藥理作用進(jìn)行了廣泛的研究，提出了蘆筍的綜合利用，在蘆筍深加工方面已開(kāi)發(fā)出速溶蘆筍粉、蘆筍飲料、蘆筍膠囊等產(chǎn)品，然而蘆筍制品的質(zhì)量穩(wěn)定性和成品率常受到本身膳食纖維的限制[7]。膳食纖維根據(jù)溶解性的不同，可分為可溶性膳食纖維（soluble dieary fibre，SDF）和不溶性膳食纖維（insoluble dietary fiber，IDF）[8]，其中可溶性膳食纖維比不溶性膳食纖維有著更強(qiáng)的生理功能，如對(duì)結(jié)腸癌的防治效果、降低血液膽固醇含量等，且用途也更廣[9-10]。目前常用提取可溶性膳食的方法主要有化學(xué)法（如酸堿處理[11]）、物理法（如擠壓膨化法[12]、高壓均質(zhì)法[13]）、酶法[14]和發(fā)酵法[15]，其中酶法提取率較高且更為溫和，符合發(fā)展環(huán)境友好型社會(huì)的主題，所以成為提取可溶性膳食纖維研究的熱點(diǎn)方向。張少穎[7]、楊曉寬等[8]、田星等[16]、周馳[9]均采用酶法對(duì)蘆筍中可溶性膳食纖維的酶解工藝進(jìn)行了研究，然而近年來(lái)逐漸發(fā)展一些輔助方法，包括微波、超聲、加壓、超臨界等物理技術(shù)[17]，其中超聲波細(xì)胞破碎技術(shù)可以將電能通過(guò)換能器轉(zhuǎn)換為聲能，這種能量通過(guò)液體介質(zhì)而變成一個(gè)個(gè)密集的小氣泡，這些小氣泡迅速炸裂，從而起到破碎細(xì)胞、提高可溶性膳食纖維素得率，縮短提取時(shí)間，提高工作效率的目的[18]。以此為創(chuàng)新點(diǎn)和突破點(diǎn)，本試驗(yàn)采用超聲波-酶法協(xié)同提取綠蘆筍中可溶性膳食纖維，通過(guò)Box-Behnken試驗(yàn)設(shè)計(jì)和響應(yīng)面分析，獲得最佳提取工藝條件，以期為綠蘆筍資源的綜合利用提供數(shù)據(jù)依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 材料及試劑

綠蘆筍：漯河市億康工貿(mào)有限公司；氫氧化鈉、檸檬酸、苯酚、濃硫酸（均為分析純）：煙臺(tái)市雙雙化工有限公司；纖維素酶（酶活力≥5 000.0 U/g）：索萊寶生物科技有限公司。

1.2 儀器與設(shè)備

i9雙光束紫外可見(jiàn)分光光度計(jì)：濟(jì)南海能儀器股份有限公司；KQ-300DE型數(shù)控超聲波清洗器：昆山市超聲儀器有限公司；FiveEasy Plus FE28 pH計(jì)：梅特勒-托利多國(guó)際貿(mào)易（上海）有限公司；SHB-Ш循環(huán)水式真空泵：鄭州長(zhǎng)城科工貿(mào)有限公司。

1.3 試驗(yàn)方法

1.3.1 綠蘆筍可溶性膳食纖維提取及測(cè)定

1.3.1.1 粗可溶性膳食纖維的提取工藝

參考劉秀鳳等[19]方法，略作修改。提取粗可溶性膳食纖維，具體工藝流程如下：

原料挑選、清洗→打漿→調(diào)節(jié)pH值→協(xié)同酶解→抽濾→醇沉→離心→沉淀物用80%乙醇洗滌3次→干燥→粗可溶性膳食纖維

操作要點(diǎn)：（1）原料挑選和清洗：挑選無(wú)彎曲畸形、無(wú)損傷、無(wú)病蟲(chóng)害、長(zhǎng)度在20 cm左右，直徑1.0 cm～1.5 cm的綠蘆筍為試驗(yàn)材料，清洗干凈后備用。（2）打漿∶按綠蘆筍與水料液比1∶2（g/mL）進(jìn)行打漿，當(dāng)原料呈細(xì)小的纖維狀，料液不黏，可均勻流動(dòng)時(shí)停止攪打。（3）調(diào)節(jié)pH值：用2 mol/L檸檬酸逐滴加入至所需pH值，邊加邊振蕩，將檸檬酸溶液與漿液混勻，避免局部酸性偏高影響結(jié)果的準(zhǔn)確性。（4）酶解：向調(diào)pH值后的漿液中加入纖維素酶，放入超聲波清洗機(jī)中，一定時(shí)間后取出得到酶解液。（5）醇沉：在上述酶解液中按照體積比1∶1加入0.5%氫氧化鈉溶液，放入70℃水浴加熱210 min，抽濾后往濾液中加入4倍體積的無(wú)水乙醇，充分混合后靜置過(guò)夜，絮狀沉淀析出。（6）洗滌：用80%乙醇溶液洗滌沉淀，去除殘留還原糖[20]。

1.3.1.2 去蛋白

參考劉秀鳳等[19]方法，采用Sevag法[21]去蛋白。

1.3.1.3 可溶性膳食纖維的測(cè)定

采用苯酚－硫酸法測(cè)定。

1）標(biāo)準(zhǔn)曲線的繪制：參考周馳等[9]方法。分別量取濃度為 0.25 mg/mL的葡萄糖標(biāo)準(zhǔn)溶液 0、0.2、0.4、0.6、0.8、1.0 mL置于10 mL具塞試管中，蒸餾水定容至1.0 mL。加入5%苯酚溶液1.0 mL，振蕩搖勻，加硫酸5.0 mL，搖勻，室溫（25±1）℃放置 30 min，定容至10 mL，搖勻，于490 nm波長(zhǎng)下測(cè)定吸光度。計(jì)算得標(biāo)準(zhǔn)曲線回歸方程為：Y=35.249X-0.037 1（R2=0.993）。

2）可溶性膳食纖維樣液的制備：用適量蒸餾水溶解去蛋白的可溶性膳食纖維，并定容到250 mL，備用。

3）可溶性膳食纖維樣液的測(cè)定：取1 mL待測(cè)樣液，加入1 mL 5%苯酚，搖勻，加入5 mL濃硫酸，靜置30 min，定容至10 mL，在490 nm處測(cè)定吸光值，根據(jù)標(biāo)準(zhǔn)曲線計(jì)算可溶性膳食纖維含量。

1.3.2 超聲-酶法協(xié)同提取可溶性膳食纖維條件的確定

1.3.2.1 單因素試驗(yàn)

1）纖維素酶添加量對(duì)SDF含量的影響

固定超聲功率270 W，酶解時(shí)間60 min，酶解溫度50℃，pH值4.5，考察纖維素酶添加量（0%、0.02%、0.04%、0.06%、0.08%、0.10%、0.12%、0.14%、0.16%）對(duì)SDF含量的影響，每組試驗(yàn)重復(fù)3次。

2）超聲時(shí)間對(duì)SDF含量的影響

固定酶添加量0.06%、微波功率270 W、酶解溫度50 ℃、pH 值 4.5，考察超聲時(shí)間（0、20、40、60、80、100、120、140、160、180 min）對(duì) SDF 含量的影響，每組試驗(yàn)重復(fù)3次。

3）pH值對(duì)SDF含量的影響

固定酶添加量0.06%、超聲功率270 W、酶解時(shí)間120 min，酶解溫度 50 ℃，考察 pH 值（3.0、3.5、4.0、4.5、5.0、5.5、6.0、6.5、7.0、7.5、8.0）對(duì) SDF 含量的影響，每組試驗(yàn)重復(fù)3次。

4）微波功率對(duì)SDF含量的影響

固定酶添加量0.06%、酶解時(shí)間120 min、酶解溫度 50 ℃、pH 值 4.5，考察微波功率（0、120、150、180、210、240、270、300 W）對(duì) SDF 含量的影響，每組試驗(yàn)重復(fù)3次。

1.3.2.2 響應(yīng)面優(yōu)化試驗(yàn)設(shè)計(jì)

根據(jù)單因素試驗(yàn)結(jié)果，選取纖維素酶添加量、超聲時(shí)間、pH值、超聲功率為考察因子，SDF含量為響應(yīng)值，利用Design Expert進(jìn)行Box-Behnken試驗(yàn)設(shè)計(jì)，優(yōu)化超聲協(xié)同酶解工藝條件。

1.4 數(shù)據(jù)分析

數(shù)據(jù)為3次重復(fù)的平均值。采用Origin8.6軟件作圖，使用Design-Expert 8.0軟件進(jìn)行響應(yīng)面試驗(yàn)數(shù)據(jù)處理及結(jié)果分析。

2 結(jié)果與分析

2.1 單因素試驗(yàn)

2.1.1 纖維素酶添加量對(duì)SDF含量的影響

纖維素酶添加量對(duì)SDF含量的影響見(jiàn)圖1。

圖1 纖維素酶添加量對(duì)SDF含量的影響Fig.1 Effects of cellulase addition on SDF content

由圖1可知，隨著纖維素酶添加量的增加，SDF含量呈先上升后下降趨勢(shì)，當(dāng)纖維素酶添加量為0.06%時(shí)，SDF含量達(dá)到最大值7.135 mg/g。SDF含量隨著纖維素酶添加量的繼續(xù)增加呈下降趨勢(shì)，此與田星等[16]研究的一致，可能是加入過(guò)量酶液導(dǎo)致一些SDF含量會(huì)被水解[16，22]的緣故。故確定纖維素酶最佳添加量為0.06%。

2.1.2 超聲時(shí)間對(duì)SDF含量的影響

超聲時(shí)間對(duì)SDF含量的影響見(jiàn)圖2。

圖2 超聲時(shí)間對(duì)SDF含量的影響Fig.2 Effects of ultrasonic time on SDF content

由圖2可知，隨著超聲時(shí)間的延長(zhǎng)，SDF含量呈先上升后下降趨勢(shì)，當(dāng)超聲時(shí)間達(dá)120 min時(shí)，SDF含量達(dá)到最大值6.236 mg/g。下降的原因可能是隨著超聲時(shí)間的延長(zhǎng)，超聲波產(chǎn)生的剪切和空化作用切斷SDF之間相連的鍵，使部分SDF降解[23]，生成不易被乙醇沉淀的小分子物質(zhì)[24]，導(dǎo)致SDF含量下降。故確定最佳酶解時(shí)間為120 min。

2.1.3 pH值對(duì)SDF含量的影響

pH值對(duì)SDF含量的影響見(jiàn)圖3。

圖3 pH值對(duì)SDF含量的影響Fig.3 Effects of pH on SDF content

由圖3可知，隨著pH值的增加，SDF含量呈先上升后下降趨勢(shì)，并在pH值為5時(shí)，SDF含量達(dá)到最大值6.305 mg/g。故確定最佳酶解pH值為5.0。

2.1.4 超聲功率對(duì)SDF含量的影響

超聲功率對(duì)SDF含量的影響見(jiàn)圖4。

圖4 超聲功率對(duì)SDF含量的影響Fig.4 Effects of ultrasonic power on SDF content

由圖4可知，隨著超聲功率的增大，SDF含量呈先上升后下降的趨勢(shì)，并在超聲功率為150 W時(shí)，SDF含量達(dá)到最高6.034mg/g。當(dāng)功率超過(guò)150 W時(shí)SDF呈下降的趨勢(shì)，可能由于超聲作用鈍化了酶的活性，甚至造成酶失活[25]，同時(shí)超聲的空化作用可能破壞SDF的結(jié)構(gòu)[26]，從而影響了SDF含量。故確定最佳超聲功率為150 W。

2.2 響應(yīng)面優(yōu)化試驗(yàn)

2.2.1 響應(yīng)面試驗(yàn)設(shè)計(jì)與結(jié)果

根據(jù)單因素試驗(yàn)結(jié)果，選取纖維素酶添加量（X1）、超聲時(shí)間（X2）、pH 值（X3）、超聲功率（X4）為考察因子，SDF含量為響應(yīng)值，根據(jù)Box-Benhnken原理設(shè)計(jì)并進(jìn)行響應(yīng)面試驗(yàn)。試驗(yàn)因素水平設(shè)計(jì)見(jiàn)表1，試驗(yàn)方案及結(jié)果見(jiàn)表2。

表1 Box Behnken分析因素與水平Table 1 Factors and levels of Box-Behnken design

表2 Box Behnken試驗(yàn)方案與結(jié)果Table 2 Box-Behnken design matrix and corresponding results

2.2.2 回歸模型的建立及顯著性檢驗(yàn)

利用Design Expert 8.0軟件對(duì)試驗(yàn)數(shù)據(jù)進(jìn)行多元回歸擬合，得到可溶性膳食纖維含量，對(duì)以上4個(gè)因素的二次多項(xiàng)回歸方程為：

為說(shuō)明回歸方程的有效性以及各因素對(duì)響應(yīng)值（Y）影響程度，因此對(duì)回歸方程進(jìn)行方差分析，結(jié)果如表3所示。

表3 回歸方程方差分析Table 3 Variance analysis for regression equation

由表3可知，模型P<0.000 1，表明回歸模型高度顯著；失擬項(xiàng)P=0.407>0.05，表明模擬失擬項(xiàng)不顯著，表明模型合適，即試驗(yàn)數(shù)據(jù)有意義。決定系數(shù)R2是參數(shù)變量和總變量的比值，也是檢測(cè)數(shù)據(jù)合理性的指標(biāo)。當(dāng)R2接近1時(shí)，表明模型與真實(shí)數(shù)據(jù)擬合度好[27]。本試驗(yàn)?zāi)Ｐ突貧w相關(guān)系數(shù)R2=0.954 6，說(shuō)明相關(guān)性較好；矯正決定系數(shù)R2Adj=0.909 2，表明90.92%的試驗(yàn)數(shù)據(jù)的變異性可用此回歸模型來(lái)解釋，可用此模型對(duì)SDF含量進(jìn)行分析和預(yù)測(cè)。回歸方程系數(shù)的顯著性分析：X1、X12、X22、X42對(duì) SDF 含量的影響達(dá)到高度顯著水平，X2、X3、X1X2對(duì) SDF 含量的影響達(dá)到極顯著水平，X1X4對(duì)SDF含量的影響達(dá)到顯著水平。各試驗(yàn)因素的主效應(yīng)關(guān)系依次是：酶添加量（X1）＞pH 值（X3）＞超聲時(shí)間（X2）＞超聲功率（X4）。

2.2.3 響應(yīng)面交互作用分析

由表3可知，交互項(xiàng)X1X2、X1X4P值分別為0.0051、0.015 4，表明酶添加量與超聲時(shí)間之間的交互影響達(dá)到極顯著水平，酶添加量與超聲功率之間的交互影響達(dá)到顯著水平。圖5和圖6分別是根據(jù)上述回歸方程繪出的響應(yīng)曲面圖及等高線圖。

圖5 酶添加量（X1）和超聲時(shí)間（X2）對(duì)SDF含量影響的響應(yīng)面及等高線圖Fig.5 Response surface and contour map of the effects of cellulase addition（X1）and ultrasound time（X2）on SDF content

圖6 酶添加量（X1）和超聲功率（X4）對(duì)SDF含量影響的響應(yīng)面及等高線圖Fig.6 Response surface and contour map of the effects of cellulase addition（X1）and ultrasonic power（X4）on SDF content

響應(yīng)曲面圖直觀地反映了這些因素對(duì)綠蘆筍SDF含量的影響。等高線的形狀可反映出交互效應(yīng)的強(qiáng)弱[27]，兩因素交互作用越強(qiáng)，等高線越接近橢圓，而圓形則表示交互作用不明顯，且等高線越密集表明該因素的影響效果越大[28]。由圖5和圖6可看出，各影響因素對(duì)SDF含量的影響不是簡(jiǎn)單的線性關(guān)系，各等高線均呈橢圓形，表明兩因素間的相互影響較顯著。從圖5可以看出，隨著酶添加量和超聲時(shí)間的增加，SDF含量呈先快速增高后逐漸降低的趨勢(shì)，且酶添加量的響應(yīng)面曲面較超聲時(shí)間陡峭，表明酶添加量比超聲時(shí)間影響大；從圖6中可以看出，隨著酶添加量和超聲功率的增加，SDF含量呈先增加后降低的趨勢(shì)，同樣酶添加量曲面較陡峭，影響大于超聲功率。

2.2.4 響應(yīng)面因素水平優(yōu)化結(jié)果及模型驗(yàn)證

通過(guò)回歸模型，采用Design Expert8.0軟件優(yōu)化酶解工藝，得到最佳條件為：纖維素酶添加量0.066%、超聲113.59 min，pH5.48，超聲功率 171.58 W，預(yù)測(cè)蘆筍可溶性膳食纖維含量可達(dá)到8.825 mg/g。

為檢測(cè)響應(yīng)面法所得結(jié)果的可靠性，根據(jù)試劑操作和設(shè)備性能，將上述最優(yōu)條件修正為：纖維素酶添加量0.065%、超聲114 min，pH5.50，超聲功率180 W，進(jìn)行3次重復(fù)試驗(yàn)，在此條件下實(shí)際測(cè)得蘆筍可溶性膳食纖維含量為（8.807±0.014）mg/g，比預(yù)測(cè)值稍低，但該值落在響應(yīng)值的95%預(yù)測(cè)區(qū)間 [8.384 mg/g，9.266 mg/g]內(nèi)，表明所建回歸模型具有良好的預(yù)測(cè)效果。

3 結(jié)論

本研究采用超聲-酶法協(xié)同提取綠蘆筍可溶性膳食纖維工藝，基于單因素試驗(yàn)，采用Box-Behnken試驗(yàn)設(shè)計(jì)和響應(yīng)面分析法，擬合了酶添加量、超聲時(shí)間、pH值、超聲功率等4個(gè)因素對(duì)綠蘆筍可溶性膳食纖維含量的回歸模型。最終得到影響蘆筍可溶性膳食纖維含量的主次因素依次為：酶添加量＞pH值＞超聲時(shí)間＞超聲功率。根據(jù)模型及響應(yīng)面分析，進(jìn)行修正后的最佳提取工藝為：纖維素酶添加量0.065%、超聲時(shí)間114 min，pH 5.50，超聲功率180 W。在此條件下，提取蘆筍可溶性膳食纖維得率最高，驗(yàn)證試驗(yàn)得到的得率為8.807 mg/g。綠蘆筍可溶性膳食纖維提取工藝的優(yōu)化，為綠蘆筍廢棄老莖的綜合利用提供較好的理論依據(jù)和數(shù)據(jù)參考。