趙國(guó)秀，楊鑫茹，孫廣仁，劉艷秋

（北華大學(xué)林學(xué)院，吉林吉林132013）

昆蟲作為自然界最龐大的群體，如黃粉蟲[1]、蠶蛹[2-4]、蚯蚓、竹蜂、螞蚱、蜂蛹等，因體內(nèi)含有豐富的蛋白質(zhì)、脂肪及其他營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)逐漸走進(jìn)人們的視野[5-6]，被越來(lái)越多的人接受。此外，飼養(yǎng)、收獲和加工昆蟲蛋白的消耗和對(duì)環(huán)境的影響也要遠(yuǎn)遠(yuǎn)小于傳統(tǒng)的蛋白質(zhì)來(lái)源[7]。

目前全球被發(fā)現(xiàn)的昆蟲品種已達(dá)1 000萬(wàn)，已知可食用的昆蟲也已達(dá)3 650多種。對(duì)此，聯(lián)合國(guó)糧食及農(nóng)業(yè)組織曾在2013年發(fā)表報(bào)告倡導(dǎo)將昆蟲作為未來(lái)主要的食品來(lái)源，這一倡導(dǎo)也使得全球昆蟲食品行業(yè)進(jìn)入前所未有的發(fā)展黃金期。

豆天蛾（Clanis bilineata tsingtauiica Mell）又稱大豆天蛾或豆青蟲，不僅擁有高于雞蛋、牛奶、大豆的蛋白質(zhì)含量，還含有豐富的不飽和脂肪酸，其中以亞麻酸為主。幼蟲中海藻多糖的含量更是哺乳動(dòng)物的10倍以上，還含有豐富的VE、VB1、VB2等多種維生素以及 K、Zn、P等礦質(zhì)元素，可以有效延緩衰老[8]、降低血脂、血壓、抗癌和提高智力等。檸檬（Citrus lemon L.）富含多種功效成分如檸檬酸[9]、類黃酮[10-12]、D-檸檬烯[13-16]，可以有效提高人體免疫力，預(yù)防癌癥、壞血癥、心臟病、中風(fēng)、心血管硬化和口腔潰瘍[17-19]等多種慢性疾病。尤為重要的是，檸檬所提供的獨(dú)特芳香氣味可以很好的掩蓋豆天蛾食品帶來(lái)的蟲腥味。

本文正是基于檸檬對(duì)豆天蛾蛹?xì)馕读己玫恼诒涡Ч?，通過(guò)單因素和正交試驗(yàn)確定豆天蛾蛹最佳的酶解反應(yīng)條件，再進(jìn)行配方優(yōu)化，最終制得一款富含氨基酸的果汁飲料，為昆蟲食品行業(yè)的進(jìn)一步發(fā)展提供了嶄新的思路。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

干豆天蛾蛹、檸檬：市售；風(fēng)味蛋白酶（10萬(wàn)U/g）：浙江一諾生物科技有限公司。

1.2 主要儀器

SOX406型脂肪測(cè)定儀：海能儀器股份有限公司；DHG-9245A型電熱鼓風(fēng)干燥箱、HWS-12型電熱恒溫水浴鍋：上海一恒科學(xué)儀器有限公司；TU-1810型紫外分光光度計(jì)：北京普析通用儀器有限公司；ME204型電子天平：格特勒-托利多儀器（上海）有限公司；TGL-24 M型離心機(jī)：湖南湘鑫儀器儀表有限公司；PHS-3C型pH計(jì)：上海雷磁公司；JYL-CO2 OE型破壁機(jī)：九陽(yáng)股份有限公司。

1.3 試驗(yàn)方法

1.3.1 工藝流程

1.3.2 指標(biāo)檢測(cè)方法

1.3.2.1 理化指標(biāo)

氨基酸態(tài)氮含量按照GB 5009.235-2016《食品安全國(guó)家標(biāo)準(zhǔn)食品中氨基酸態(tài)氮的測(cè)定》檢測(cè)；葡萄皮及VC的DPPH自由基清除率的測(cè)定參考郭文莉[16]的方法進(jìn)行。

1.3.2.2 感官指標(biāo)

設(shè)計(jì)豆天蛾蛹飲料的感官評(píng)定標(biāo)準(zhǔn)，確定其感官評(píng)價(jià)由色澤、香氣、滋味和組織狀態(tài)4個(gè)因素組成。選取30人小組進(jìn)行評(píng)分，總分設(shè)定為100分，其中包括色澤30分、蟲味遮蔽效果40分、滋味15分以及組織狀態(tài)15分。評(píng)定標(biāo)準(zhǔn)見(jiàn)表1。

表1 豆天蛾蛹飲料感官評(píng)定標(biāo)準(zhǔn)Table 1 Sensory evaluation criteria for pupa beverage of Clanis bilineata tsingtauica Mell

1.3.3 豆天蛾蛹脫脂率的確定

以乙醚為溶劑，使豆天蛾蛹粉在40℃下索氏提取4 h，烘干后稱量粉重，確定豆天蛾蛹中脂肪含量。

1.3.4 豆天蛾蛹酶解條件的確定

1.3.4.1 豆天蛾蛹酶解條件的單因素試驗(yàn)

分別研究豆天蛾蛹粉的加入量（0.01、0.05、0.09、0.13、0.17 g/mL），酶用量（0.1%、0.3%、0.5%、0.7%、0.9%），酶解溫度（35、40、45、50、55 ℃），酶解 pH 值（5.0、6.0、7.0、8.0、9.0），酶解時(shí)間（2、4、6、8、10 h）對(duì)豆天蛾蛹酶解效果的影響。

1.3.4.2 豆天蛾蛹酶解條件的正交試驗(yàn)

在單因素結(jié)果的基礎(chǔ)上，分別以酶用量、酶解溫度、酶解pH值、酶解時(shí)間，進(jìn)行正交試驗(yàn)，以氨基酸態(tài)氮的含量為檢測(cè)指標(biāo)，確定豆天蛾蛹最佳的水解反應(yīng)條件。其因素水平表見(jiàn)表2。

1.3.5 水解液DPPH自由基清除率的測(cè)定

在最佳的水解反應(yīng)條件下將干豆天蛾蛹粉進(jìn)行水解，調(diào)配試劑。在25℃下避光反應(yīng)30 min，并在517 nm處進(jìn)行測(cè)定，做3組平行試驗(yàn)，并計(jì)算清除率。

式中：Ai為1 mL水解液加入2 mL DPPH的吸光度；A0為2 mLDPPH加入1 mL50%乙醇的吸光度；A2為1 mL水解液加入2 mL50%乙醇的吸光度。

表2 豆天蛾蛹酶解條件正交試驗(yàn)的影響因素及水平Table 2 Influencing factors and levels of orthogonal test on enzymatic hydrolysis conditions of Clanis bilineata tsingtauica Mell

1.3.6 豆天蛾蛹飲料最佳配方的確定

1.3.6.1 豆天蛾蛹飲料配方的單因素試驗(yàn)

分別研究水解液與檸檬汁體積比（1∶1，1∶2，1∶3，1∶4，1∶5），濃縮汁與水的體積比（4 ∶6，4 ∶7，4 ∶8，4 ∶9，4∶10），白砂糖添加量（4%、6%、8%、10%、12%），黃原膠添加量（0.03%、0.04%、0.05%、0.06%、0.07%），羧甲基纖維素鈉添加量（0.05%、0.10%、0.15%、0.20%、0.25%）對(duì)豆天蛾蛹飲料感官評(píng)分的影響。

1.3.6.2 豆天蛾蛹酶解條件的正交試驗(yàn)

在單因素結(jié)果的基礎(chǔ)上，分別以濃縮汁與水的比例、白砂糖添加量、黃原膠添加量、羧甲基纖維素鈉（sodium carboxymethyl cellulose，CMC-Na） 添加量，進(jìn)行正交試驗(yàn)，以感官評(píng)價(jià)為依據(jù)，確定豆天蛾蛹飲料的最佳配方，其因素水平表見(jiàn)表3。

表3 豆天蛾蛹飲料最佳配方正交試驗(yàn)的影響因素及水平Table 3 Influencing factors and levels of orthogonal test for optimum formulation of pupa beverage of Clanis bilineata tsingtauica Mell

2 結(jié)果與分析

2.1 豆天蛾蛹的脫脂率測(cè)定結(jié)果

將豆天蛾蛹粉碎后，在40℃下進(jìn)行索氏提取4 h，烘干后稱量粉重，計(jì)算得脫脂率約為21.58%。

2.2 豆天蛾蛹酶解條件的確定

2.2.1 豆天蛾蛹粉添加量的確定

不同豆天蛾蛹粉添加量對(duì)氨基酸態(tài)氮含量的影響見(jiàn)圖1。

根據(jù)圖1的曲線可以看出，豆天蛾蛹粉的添加量從0.01 g/mL至0.13 g/mL時(shí)，隨著添加量增加，水解液中氨基酸態(tài)氮含量逐漸增加。當(dāng)豆天蛾蛹粉的添加量為0.13 g/mL時(shí)，氨基酸態(tài)氮含量為1.97 g/L。但豆天蛾蛹粉的添加量高于0.13 g/mL時(shí)，氨基酸態(tài)氮含量下降，可能底物過(guò)多使酶解反應(yīng)不完全。

圖1 不同豆天蛾蛹粉添加量對(duì)氨基酸態(tài)氮含量的影響Fig.1 Effect of different addition amounts of Clanis bilineata tsingtauica Mell powder on amino acid nitrogen content

2.2.2 酶用量的確定

不同酶用量對(duì)氨基酸態(tài)氮含量的影響見(jiàn)圖2。

圖2 不同酶用量對(duì)氨基酸態(tài)氮含量的影響Fig.2 Effect of different enzyme additions on amino ccid nitrogen content

如圖2所示，當(dāng)酶用量在0.1%至0.5%，隨著酶用量增加，氨基酸態(tài)氮的含量不斷增高。當(dāng)酶用量超過(guò)0.5%時(shí)，氨基酸態(tài)氮的含量開(kāi)始下降。產(chǎn)生的原因可能是隨著酶用量的不斷增加，產(chǎn)物不斷增多，會(huì)抑制底物的反應(yīng)。

2.2.3 酶解溫度的確定

不同酶解溫度對(duì)氨基酸態(tài)氮含量的影響見(jiàn)圖3。

圖3 不同酶解溫度對(duì)氨基酸態(tài)氮含量的影響Fig.3 Effect of different enzymatic hydrolysis temperature on amino acid nitrogen content

如圖3所示，當(dāng)酶解溫度在35℃至50℃，隨著酶解溫度的提高，氨基酸態(tài)氮含量增加，當(dāng)酶解溫度為50℃時(shí)，氨基酸態(tài)氮含量可達(dá)到2.01 g/L，產(chǎn)生的原因?yàn)檫m當(dāng)?shù)募訜釙?huì)使蛋白質(zhì)的酶作用位點(diǎn)暴露，方便與酶更加充分的結(jié)合，促使酶解反應(yīng)完全；而當(dāng)溫度高于50℃時(shí)，酶活性受到抑制，氨基酸態(tài)氮含量下降。

2.2.4 酶解pH值的確定

不同酶解pH值對(duì)氨基酸態(tài)氮含量的影響見(jiàn)圖4。

圖4 不同酶解pH值對(duì)氨基酸態(tài)氮含量的影響Fig.4 Effect of different enzymatic hydrolysis pH on amino acid nitrogen content

結(jié)果如圖4所示，當(dāng)pH值為6.0時(shí)，氨基酸態(tài)氮含量為2.22 g/L，酶解反應(yīng)條件受pH值影響明顯，當(dāng)pH值大于6時(shí)酶反應(yīng)能力減弱，氨基酸態(tài)氮生成量減少。

2.2.5 酶解時(shí)間的確定

不同酶解時(shí)間對(duì)氨基酸態(tài)氮含量的影響見(jiàn)圖5。

圖5 不同酶解時(shí)間對(duì)氨基酸態(tài)氮含量的影響Fig.5 Effect of different enzymatic time on amino acid nitrogen content

如圖5所示，隨著酶解時(shí)間的延長(zhǎng)，氨基酸態(tài)氮的含量不斷增加，8 h時(shí)氨基酸態(tài)氮生成量為2.63 g/L。超過(guò)8 h后，氨基酸態(tài)氮的含量開(kāi)始下降。這是因?yàn)橐环矫嫘庐a(chǎn)生的產(chǎn)物對(duì)底物有抑制作用，另一方面底物在不斷減少，酶也會(huì)隨著酶解時(shí)間的延長(zhǎng)漸漸變性失活。

2.2.6 豆天蛾蛹酶解條件的正交試驗(yàn)

以各個(gè)單因素的最佳條件為中心，上下各選取兩個(gè)參數(shù)進(jìn)行正交試驗(yàn)。正交試驗(yàn)結(jié)果如表4所示。

根據(jù)正交試驗(yàn)結(jié)果可得出4個(gè)單因素對(duì)豆天蛾蛹酶解反應(yīng)影響大小的順序?yàn)椋篊（酶解pH值）＞A（酶用量）＞B（酶解溫度）＞D（酶解時(shí)間），即得到的最佳酶解條件為A3B1C2D2。這與單因素試驗(yàn)結(jié)果A2B2C2D2和正交試驗(yàn)第7組A3B1C3D2稍有偏差，進(jìn)行驗(yàn)證試驗(yàn)，再次測(cè)定氨基酸態(tài)氮的含量，結(jié)果見(jiàn)圖6。

表4 豆天蛾蛹酶解條件正交試驗(yàn)結(jié)果Table 4 Orthogonal test table of enzymatic hydrolysis conditions of Clanis bilineata tsingtauica Mell

圖6 豆天蛾蛹酶解最佳條件的確定Fig.6 Determination of the optimum enzymatic hydrolysis conditions of Clanis bilineata tsingtauica Mell

經(jīng)驗(yàn)證試驗(yàn)可得，最佳的酶解反應(yīng)條件為酶用量0.5%、酶解溫度50℃、酶解pH6.0、酶解時(shí)間8 h。

2.3 豆天蛾蛹飲料最佳配方的確定

2.3.1 水解液與檸檬汁體積比的確定

水解液與檸檬汁體積比對(duì)感官評(píng)分的影響見(jiàn)圖7。

結(jié)果如圖7所示，當(dāng)水解液與檸檬汁的體積比超過(guò)1∶3時(shí)，感官評(píng)分變化不明顯。這是由于當(dāng)水解液與檸檬汁的體積比為1∶3時(shí)，檸檬香氣就已經(jīng)可以完全掩蓋水解液蟲味，所以后續(xù)檸檬汁比例的增加不會(huì)對(duì)感官評(píng)分產(chǎn)生影響。因此，通過(guò)試驗(yàn)可以得出檸檬香氣對(duì)蟲味具有遮蔽效應(yīng)。

圖7 水解液與檸檬汁體積比對(duì)感官評(píng)分的影響Fig.7 Effect of volume ratio of hydrolysate and lemon juice on sensory score

2.3.2 濃縮汁與水體積比的確定

濃縮汁與水體積比對(duì)感官評(píng)分的影響見(jiàn)圖8。

圖8 濃縮汁與水體積比對(duì)感官評(píng)分的影響Fig.8 Effect of volume ratio of concentrated juice and water on sensory score

如圖8所示，當(dāng)濃縮汁與水的體積比為4∶8時(shí)，感官評(píng)分最高。此時(shí)飲料濃稠適宜，無(wú)蟲味。而當(dāng)濃縮汁與水的體積比超過(guò)4∶8時(shí)，味道變淡，品質(zhì)下降。

2.3.3 白砂糖添加量的確定

白砂糖添加量對(duì)感官評(píng)分的影響見(jiàn)圖9。

圖9 白砂糖添加量對(duì)感官評(píng)分的影響Fig.9 Effect of white sugar addition on sensory score

如圖9所示，當(dāng)白砂糖添加量低于8%時(shí)，口感過(guò)酸，刺激腸胃，影響身體健康；當(dāng)白砂糖添加量高于8%時(shí)，口感過(guò)甜，與現(xiàn)代人低糖的飲食習(xí)慣不符。當(dāng)白砂糖添加量為8%時(shí)，感官評(píng)分最高。

2.3.4 黃原膠添加量的確定

黃原膠添加量對(duì)感官評(píng)分的影響見(jiàn)圖10。

圖10 黃原膠添加量對(duì)感官評(píng)分的影響Fig.10 Effect of xanthan gum addition on sensory score

如圖10所示，當(dāng)黃原膠添加量為0.05%時(shí)，檸檬顆粒的懸浮效果最好，評(píng)分最高。這是因?yàn)楫?dāng)黃原膠添加量過(guò)低時(shí)，檸檬顆粒多數(shù)沉淀。而當(dāng)黃原膠添加量高于0.05%時(shí)，黃原膠溶解緩慢，會(huì)在飲料表面形成白色絮狀飄浮，影響感官評(píng)定。

2.3.5 羧甲基纖維素鈉添加量的確定

羧甲基纖維素鈉添加量對(duì)感官評(píng)分的影響見(jiàn)圖11。

圖11 羧甲基纖維素鈉添加量對(duì)感官評(píng)分的影響Fig.11 Effects of sodium CMC-Na on sensory score

如圖11所示，當(dāng)CMC-Na添加量為0.10%時(shí)，檸檬顆粒完全懸浮，口感最佳，感官評(píng)分最高。當(dāng)CMCNa添加量超過(guò)0.10%時(shí)，檸檬顆粒懸浮效果無(wú)變化，但飲料流動(dòng)性減弱。

2.3.6 豆天蛾蛹飲料最佳配方的正交試驗(yàn)

以各個(gè)單因素的最佳條件為中心，上下各選取兩個(gè)參數(shù)進(jìn)行正交試驗(yàn)正交試驗(yàn)結(jié)果如表5所示。

表5 豆天蛾蛹飲料最佳配方正交試驗(yàn)結(jié)果表Table 5 Orthogonal test table for optimum formulation of pupa beverage of Clanis bilineata tsingtauica Mell

續(xù)表5 豆天蛾蛹飲料最佳配方正交試驗(yàn)結(jié)果表Continue table 5 Orthogonal test table for optimum formulation of pupa beverage of Clanis bilineata tsingtauica Mell

根據(jù)正交試驗(yàn)結(jié)果可得出4個(gè)單因素對(duì)豆天蛾蛹飲料最佳配方影響大小的順序?yàn)椋篎（白砂糖添加量）>G（黃原膠添加量）>E（濃縮汁與水體積比）>H（CMCNa添加量），即得到的最佳飲料配方為E2F2G2H3。這與試驗(yàn)結(jié)果E1F2G2H2稍有偏差，進(jìn)行驗(yàn)證試驗(yàn)。經(jīng)驗(yàn)證試驗(yàn)得出極差最優(yōu)組試驗(yàn)所得飲料感官評(píng)價(jià)較好。

2.4 水解液DPPH自由基清除率的測(cè)定

在最佳酶解反應(yīng)條件下處理豆天蛾蛹粉，得到水解液。再將水解液與葡萄皮、VC以及幾種常見(jiàn)蔬果的DPPH自由基清除率進(jìn)行比較，結(jié)果見(jiàn)圖12。

圖12 水解液與幾種常見(jiàn)物質(zhì)DPPH自由基清除能力的比較Fig.12 Comparison of DPPH scavenging capacity between hydrolysate and several common substances

經(jīng)3次平行試驗(yàn)可得，豆天蛾蛹水解液DPPH自由基清除率為84.99%。與VC的DPPH自由基清除能力進(jìn)行方差分析（P=0.09>0.05），結(jié)果表明兩組數(shù)據(jù)無(wú)差異，說(shuō)明豆天蛾蛹水解液與VC抗氧化能力相當(dāng)；與葡萄皮色素的DPPH自由基清除能力進(jìn)行方差分析（P=0.87>0.05），結(jié)果表明兩組數(shù)據(jù)無(wú)差異，說(shuō)明豆天蛾蛹水解液與葡萄皮抗氧化能力相當(dāng)；與蓮藕、番茄的 DPPH 清除能力[16，20]進(jìn)行方差分析（P<0.05），結(jié)果表明兩組數(shù)據(jù)差異顯著，說(shuō)明豆天蛾蛹水解液的抗氧化能力超過(guò)蓮藕和番茄。

分析結(jié)果表明，豆天蛾蛹水解液具有較強(qiáng)的抗氧化能力，所研發(fā)的豆天蛾蛹飲料也具有一定的抗氧化效果。

3 結(jié)論

通過(guò)試驗(yàn)得出豆天蛾蛹脂肪含量為21.58%，豆天蛾蛹蛋白最佳水解條件為0.13 g/mL的豆天蛾蛹粉、0.5%的風(fēng)味蛋白酶、在50℃、pH值為6.0的條件下反應(yīng)8 h，水解液對(duì)DPPH自由基的清除率為84.99%；水解液與檸檬汁按1∶3體積比調(diào)配成濃縮汁，再將濃縮汁與水按4∶8體積比混合，加入8%的白砂糖、0.05%的黃原膠和0.15%的羧甲基纖維素鈉。通過(guò)最佳配方試驗(yàn)的分值可以看出豆天蛾蛹水解液的氣味可以被掩蓋。而且豆天蛾蛹水解液的抗氧化能力較強(qiáng)，對(duì)豆天蛾蛹水解液的研究具有現(xiàn)實(shí)意義，可以繼續(xù)深入，開(kāi)發(fā)出更多的豆天蛾蛹系列產(chǎn)品。