林 靚， 柳之彥， 林 容， 阮輿鑫， 董潔瓊， 鄭 晶

子癇前期(preeclampsia，PE)是一種妊娠期特發(fā)的可能導(dǎo)致多器官多系統(tǒng)損害的高血壓疾病，發(fā)病機制與早期胎盤形成缺陷有關(guān)。DNA甲基化是一種相對穩(wěn)定的表觀遺傳修飾，為解釋胎盤基因的異常表達(dá)以及相關(guān)信號通路的變化機制提供了良好的切入點。腫瘤壞死因子誘導(dǎo)蛋白8(tumor necrosis factor α-inducing protein 8，TNFAIP8)是一種參與調(diào)節(jié)細(xì)胞增殖和分化的蛋白，在維持細(xì)胞穩(wěn)態(tài)和調(diào)控自身免疫方面起著重要作用。本研究擬通過人類全基因組芯片篩選胎盤組織候選基因，探討PE發(fā)病機制的表觀遺傳背景，為子癇的防治和管理提供理論基礎(chǔ)。

1 對象與方法

1.1對象 選取2016年3月—2017年8月在筆者醫(yī)院產(chǎn)科分娩的46例孕婦，其中早發(fā)型PE組(early-onset preeclampsia，EOPE)16例，晚發(fā)型PE組(late-onset preeclampsia，LOPE)12例，正常足月分娩孕婦組(normal pregnancy，NP)18例。PE診斷參考《妊娠期高血壓疾病診治指南(2020)》的診斷標(biāo)準(zhǔn)，在妊娠34周前因PE終止妊娠者為PE。排除標(biāo)準(zhǔn)：(1)妊娠合并癥及并發(fā)癥：妊娠合并慢性高血壓病、糖尿病、腎病、免疫系統(tǒng)疾病、內(nèi)分泌疾病及腫瘤等；(2)輔助生殖技術(shù)受孕；(3)畸胎或死胎；(4)多胎妊娠(≥2胎)；(5)嗜酒、吸毒及濫用藥物者。本研究經(jīng)筆者醫(yī)院倫理委員會批準(zhǔn)，研究對象均簽署知情同意書。

1.2方法

1.2.1外周血及胎盤組織采集 入院后抽取肘靜脈血液2管各3 mL，置于EDTA抗凝管中。胎盤娩出 15 min內(nèi)從4個不同胎盤小葉取材，用無菌 PBS 緩沖液反復(fù)沖洗血污，直至沖洗液接近無色，將組織剪碎至1 mm3，置于凍存管液氮預(yù)處理，送-80 ℃冰箱保存。

1.2.2DNA及RNA抽提 采用DNA提取試劑盒(批號：No.59124，德國Qiagen公司)抽提樣本DNA，用瓊脂糖凝膠電泳檢測DNA濃度(≥2 μg)。采用RNA提取試劑盒(Cat#CW0581，中國CWbio公司)提取樣本總RNA。

1.2.3Illumina Human 450K甲基化芯片檢測 從EOPE組、LOPE組、NP組中選取年齡及孕周相匹配的胎盤各3例，均為單胎自然受孕，孕次1～2次，產(chǎn)次0～1次，進(jìn)行甲基化芯片檢測。

1.2.3.1實驗步驟 對提取的胎盤組織DNA進(jìn)行亞硫酸氫鹽處理，針對每個甲基化位點同時設(shè)計兩種探針，進(jìn)行芯片雜交、洗脫、延伸、成像，并對探針雜交及亞硫酸氫鹽轉(zhuǎn)化效率進(jìn)行質(zhì)控。

1.2.3.2數(shù)據(jù)分析 采用Illumina公司的Genome Studio軟件進(jìn)行原始數(shù)據(jù)處理分析，包括差別性分析、DeltaBeta篩選及Diffscore篩選。以下為各衡量指標(biāo)的計算公式：

(1)β值是衡量該位點甲基化程度的指標(biāo)，該值區(qū)間(0，1)，越接近于1該位點甲基化程度越高，越接近于0該位點甲基化程度越低。Illumina甲基化平臺的計算公式為：

(2)M代表每個探針在IP DNA和input DNA中的相對富集程度，計算公式為：

M=lgβ

1.2.4焦磷酸測序驗證 根據(jù)候選基因位點序列信息，采用PyroMark Assay Design 2.0設(shè)計引物序列(表1)。每個樣本各取1～2 μg DNA，用EpiTect Plus DNA Bisulfite Kit甲基化轉(zhuǎn)化試劑盒進(jìn)行轉(zhuǎn)化，以轉(zhuǎn)化后的DNA樣本做模板進(jìn)行PCR檢測。取15～20 μL PCR產(chǎn)物上PyroMark Q24實時定量焦磷酸系列分析儀，PyroQ-CpG軟件分析該位點甲基化狀態(tài)。

表1 焦磷酸測序引物名稱及序列

1.2.5RT-PCR檢測TNFAIP8-mRNA 取5 μL RNA，用1%瓊脂糖凝膠進(jìn)行電泳檢測RNA的完整性。采用DNaseⅠ試劑盒(Cat# CW2090，中國CWbio公司)對RNA中殘留的DNA進(jìn)行消化處理，用HiFi-MMLVcDNA第一鏈合成試劑盒(Cat#CW0744，中國CWbio公司)進(jìn)行反轉(zhuǎn)錄，上ABI 7500型熒光定量PCR儀檢測，用2-△△CT法進(jìn)行數(shù)據(jù)相對定量分析。

表2 RT-PCR引物名稱及序列

1.2.6Western-blot檢測TNFAIP8蛋白 制備 SDS-PAGE膠，提取胎盤及血液蛋白，進(jìn)行蛋白樣品變性電泳及凝膠轉(zhuǎn)膜，測定蛋白濃度，采用Image J軟件分析灰度值。

2 結(jié) 果

2.1臨床資料比較 3組患者的年齡、妊娠和分娩次數(shù)、孕早期BMI比較，差別無統(tǒng)計學(xué)意義(P>0.05)；與NP組比較，EOPE組及LOPE組的平均動脈壓和24 h尿蛋白定量升高，分娩孕齡和胎兒出生體質(zhì)量降低，差別有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.05)。

表3 臨床資料比較

2.2胎盤組織整體及TNFAIP8位點的甲基化芯片檢測結(jié)果 胎盤組織TNFAIP8位點探針主要分布在5’UTR區(qū)，甲基化芯片共檢測485 577個位點。EOPE組、LOPE組和對照組的胎盤整體平均甲基化程度分別為0.47，0.46，0.46。3組的TNFAIP8甲基化程度和富集程度比較，差別有統(tǒng)計學(xué)意義(F=6.992，P=0.027；F=6.985，P=0.027)。與LOPE組、NP組比較，EOPE組的甲基化程度和富集程度顯著降低，差別有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.05)；而LOPE組與NP組比較，差別無統(tǒng)計學(xué)意義(P>0.05，表4)。

表4 3組胎盤芯片TNFAIP8甲基化水平差別

2.3焦磷酸測序驗證TNFAIP8位點甲基化水平

2.3.1焦磷酸測序峰圖 設(shè)計TNFAIP8的甲基化測序序列為YGGTAATYGTTTTTGTAGTTGGTTAT。測序峰圖中藍(lán)色矩形陰影上方對應(yīng)的黃色方塊提示檢測效果穩(wěn)定，所標(biāo)數(shù)值是以百分率表示的該位點甲基化程度(圖1)。

圖1 TNFAIP8的焦磷酸測序峰圖Fig 1 Spectrum of TNFAIP8 pyrosequencing

2.3.23組的TNFAIP8甲基化程度及差別 3組TNFAIP8 基因的兩個位點平均甲基化程度見表5。3組的位點1甲基化程度比較，差別有統(tǒng)計學(xué)意義(F=6.361，P=0.004)；而位點2甲基化程度比較，差別無統(tǒng)計學(xué)意義(F=2.984，P=0.061)。EOPE組中出現(xiàn)多例TNFAIP8未甲基化，即甲基化程度為0。位點1中EOPE組4例(25%)未甲基化，LOPE組和NP組無此現(xiàn)象；位點2中EOPE組5例(31.25%)未甲基化，LOPE組1例(8.33%)，NP組1例(5.56%)。與NP組比較，EOPE組及LOPE組位點1甲基化程度顯著降低，差別有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.05)；而LOPE組和NP組比較，差別無統(tǒng)計學(xué)意義(P>0.05)。

表5 3組間TNFAIP8焦磷酸測序甲基化水平差別

2.4RT-PCR及Western-blot檢測胎盤及外周血TNFAIP8蛋白表達(dá) 3組胎盤組織的TNFAIP8-mRNA相對定量和蛋白表達(dá)比較，差別均有統(tǒng)計學(xué)意義(F=243.252，P=0.000；F=38.594，P=0.000)。外周血TNFAIP8-mRNA相對定量和蛋白表達(dá)比較，差別均有統(tǒng)計學(xué)意義(F=405.209，P=0.000；F=143.199，P=0.000，表6)。組間采用Turkey HSD檢驗比較，差別有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.05)。胎盤和外周血TNFAIP8蛋白電泳圖呈現(xiàn)按照EOPE→LOPE→NP順序表達(dá)逐漸下降的趨勢(圖2)。

表6 3組胎盤和外周血TNFAIP8表達(dá)及差別

TNFAIP8：腫瘤壞死因子誘導(dǎo)蛋白8； EOPE：早發(fā)型子癇前期；LOPE：晚發(fā)型子癇前期；NP：正常妊娠.圖2 胎盤組織和外周血TNFAIP8電泳條帶Fig 2 Electrophoretic bands of TNFAIP8 in the placenta and peripheral blood

3 討 論

PE是一種妊娠期特有的母親-胎兒-胎盤疾病，各種發(fā)病機制通路之間復(fù)雜的相互作用很大程度上阻礙了有效干預(yù)靶點的探尋。胎盤在以母體全身性炎癥、內(nèi)皮損傷、高血壓和蛋白尿為特征的終末通路中起著關(guān)鍵作用[1]。新近研究不斷揭示表觀遺傳機制在PE發(fā)生發(fā)展中的作用，特別是DNA甲基化成為胎盤源性疾病研究的焦點所在。甲基化介導(dǎo)的轉(zhuǎn)錄失調(diào)基序(methylation-mediated transcriptional dysregulation motifs，methTDMs) 可能參與PE的發(fā)病機制[2]，因此,建立DNA甲基化與PE之間的關(guān)聯(lián)將為探索PE的臨床監(jiān)測指標(biāo)和藥物靶點提供科學(xué)依據(jù)。

本研究通過人類全基因組Illumina Human 450K甲基化芯片篩選異常甲基化候選基因并用焦磷酸測序驗證。雖然3組胎盤總體甲基化程度相近，但是本課題組前期研究顯示，特定基因的甲基化程度卻各有顯著性差別，并涉及免疫及生長發(fā)育的多條途徑[3]。同源盒基因在人類胎盤中廣泛表達(dá)，調(diào)控胚胎和胎盤發(fā)育，而且大多數(shù)同源盒基因在整個妊娠過程中都是低甲基化的[4]。本研究結(jié)果與此相似，PE尤其是EOPE胎盤組織中TNFAIP8基因顯著低甲基化甚至未甲基化。約70%的CpG島位于人類基因啟動子的5’端區(qū)域，大多數(shù)CpG島未甲基化，而未甲基化則代表基因具有潛在活性[5]。PE可分為EOPE和LOPE兩種亞型。EOPE主要與胎盤重塑、胎盤功能障礙有關(guān)；LOPE主要與代謝紊亂、肥胖、糖尿病、脂代謝紊亂和炎癥影響內(nèi)皮功能有關(guān)[6]。本研究TNFAIP8的甲基化焦磷酸測序驗證結(jié)果也顯示，相對于LOPE和NP組，EOPE組胎盤的甲基化程度顯著降低；但是LOPE和NP組卻未顯示出差別，這可能與兩種亞型發(fā)病機制存在不同有關(guān)。既往認(rèn)為兩者是同一種疾病的兩種階段，但是現(xiàn)在更多的研究結(jié)論傾向于兩者是機制截然不同的兩種疾病。

1997年，Patel等在人類頭頸鱗狀細(xì)胞癌株上首先發(fā)現(xiàn)并鑒定出TNFAIP8蛋白[7]，也稱為SCC-S2、GG2-1和NDED，它是一種和細(xì)胞凋亡密切相關(guān)的免疫調(diào)節(jié)蛋白。TNFAIP8包含一個假定的死亡效應(yīng)域，可影響各種類型細(xì)胞的凋亡和自噬[8]。TNFAIP8的表達(dá)與前列腺癌、肝癌、肺癌、乳腺癌、結(jié)腸癌、食道癌、卵巢癌、宮頸癌、胰腺癌等多種癌癥的發(fā)病機制密切相關(guān)[9]，且影響化療耐藥性及生存預(yù)后[10]。在胎盤形成早期，滋養(yǎng)細(xì)胞的行為極其類似于腫瘤細(xì)胞，具有形成血管、遷移、侵襲等功能。

有研究顯示，降低腫瘤細(xì)胞TNFAIP8的表達(dá)，將降低血管內(nèi)皮生長因子受體VEGFR-2、基質(zhì)金屬蛋白酶MMP-1及MMP-9的表達(dá)[11]。若用小干擾RNA沉默成纖維細(xì)胞上TNFAIP8的表達(dá)，MMP-1產(chǎn)生水平也明顯降低[12]。既往研究已證實，系列MMPs分子與PE發(fā)病相關(guān)，MMP-3與EOPE有關(guān)，而與LOPE無關(guān)；升高的MMP-2和MMP-13及降低的MMP-9均與早發(fā)及晚發(fā)型重度PE有關(guān)[13]。本研究中，PE尤其是EOPE胎盤組織中TNFAIP8-mRNA和蛋白的過表達(dá)導(dǎo)致系列MMPs分子異常表達(dá)，影響母胎界面血管床重塑障礙出現(xiàn)胎盤形成缺陷。另外，PE孕婦外周血管過表達(dá)MMPs受體，MMP可通過該受體發(fā)揮強大的收縮血管功能，準(zhǔn)確模擬PE全身外周血管痙攣的病理特征；而MMPs介導(dǎo)的膠原蛋白不平衡性刺激溶膠原活性，也會造成血管壁通透性增加引起PE特有的癥狀水腫和蛋白尿[13]。因此，TNFAIP8作為MMPs分子導(dǎo)致PE發(fā)病的上游原因之一，可作為深入探索發(fā)病機制以及糾正血管和膠原蛋白功能的切入點，改善PE預(yù)后。

本研究還發(fā)現(xiàn)，與NP組比較，EOPE組和LOPE組的外周血中TNFAIP8蛋白表達(dá)差別也很顯著。Xiang等發(fā)現(xiàn)，正常孕婦外周血中TNFAIP8家族成員TIMP-3完全甲基化，而發(fā)生PE時胎盤中TIMP-3則明顯低甲基化或未甲基化[15]，由此，檢測母血中由胎盤釋放的異常甲基化TIPM-3濃度有望實現(xiàn)早期診斷和預(yù)測PE。本研究也證實了外周血TNFAIP8的表達(dá)水平能切實反映胎盤的病理性甲基化情況，后續(xù)研究將探討不同孕周孕婦外周血中TNFAIP8的甲基化情況，進(jìn)一步驗證TNFAIP8作為診斷和預(yù)測的外周血生物學(xué)指標(biāo)的可行性。

PE是妊娠期特有的嚴(yán)重影響母嬰預(yù)后的疾病之一，TNFAIP8在胎盤中的表達(dá)以及和PE是否存在關(guān)聯(lián)，目前研究還很有限。本課題組在后續(xù)已完成的胎盤組織miRNA測序研究中也發(fā)現(xiàn)了TNFAIP8的上游微調(diào)控開關(guān)，后續(xù)將把TNFAIP8作為關(guān)鍵蛋白，推測異常轉(zhuǎn)錄翻譯的信號通路，探索上游和下游的調(diào)控機制，豐富PE的發(fā)病理論，并驗證其作為預(yù)測指標(biāo)的可行性，這對于完善PE的分子生物學(xué)機制具有重要的理論意義和潛在的應(yīng)用價值。