張麗翠，馬川，馮毛，李建科

（中國(guó)農(nóng)業(yè)科學(xué)院蜜蜂研究所，北京 100093）

0 引言

【研究意義】蜂王漿是由工蜂上顎腺和咽下腺等腺體共同分泌的乳白色或淡黃色的漿狀物質(zhì)[1]，是工蜂用來(lái)飼喂 1—3日齡蜜蜂幼蟲(chóng)和飼喂蜂王終生的食物。蜂王漿是一種對(duì)人類健康具有重要作用的天然功能食品，具有調(diào)節(jié)血壓、增強(qiáng)免疫力、抗菌消炎、抗腫瘤等藥理功效[2-3]，其營(yíng)養(yǎng)價(jià)值越來(lái)越受到人們的關(guān)注。蜂王漿成分復(fù)雜，主要包括水分、蛋白質(zhì)、脂類、氨基酸、糖類、維生素等[2,4]，其豐富的生物活性成分是蜂王漿具有醫(yī)療保健功效的物質(zhì)基礎(chǔ)。代謝組學(xué)是對(duì)生物體、器官、組織或細(xì)胞中的代謝物進(jìn)行全面系統(tǒng)鑒定和分析的技術(shù)[5]，該技術(shù)在食品領(lǐng)域的應(yīng)用，可對(duì)食品中的小分子組分進(jìn)行整體定性和定量分析，為食品質(zhì)量安全提供技術(shù)支撐[6]。代謝物的提取是代謝組學(xué)研究中至關(guān)重要的步驟[7-8]，直接影響了可檢測(cè)的代謝物范圍[9]以及代謝物提取的數(shù)量[10]。因此，建立簡(jiǎn)單易行且高效的蜂王漿代謝物的提取方法，獲得更加全面的代謝物種類和數(shù)量，對(duì)蜂王漿質(zhì)量評(píng)價(jià)和功能開(kāi)發(fā)利用具有重要意義?！厩叭搜芯窟M(jìn)展】目前對(duì)蜂王漿小分子化合物的鑒定分析已有大量報(bào)道，ISIDOROV等[11]檢測(cè)了蜂王漿中的揮發(fā)性成分和有機(jī)溶劑萃取成分，PINA、VIRGILIOU 等[12-13]靶向測(cè)定了蜂王漿中的親水性化合物，但大多數(shù)研究只針對(duì)蜂王漿中的某一類化合物，如氨基酸[14-16]、糖[16-17]、有機(jī)酸[18]、維生素[19-20]及核酸[21-22]。從分析方法來(lái)看，以上研究主要基于氣相色譜-質(zhì)譜聯(lián)用技術(shù)（GC-MS）、氣相色譜火焰-離子化檢測(cè)器（GC-FID）、高效液相色譜-熒光檢測(cè)技術(shù)（HPLC-FLD）等。氣相色譜相關(guān)技術(shù)檢測(cè)范圍小，只能檢測(cè)揮發(fā)性化合物和衍生化后形成的揮發(fā)性化合物[23]。超高效液相色譜-高分辨質(zhì)譜技術(shù)（UPLC-HRMS）具有更高的分辨率和靈敏度，通過(guò)選擇不同的分離色譜柱可以實(shí)現(xiàn)從非極性到極性代謝物的全面檢測(cè)，其中反相液相色譜（reverse phase liquid chromatography，RPLC）能夠很好地分離非極性和中低極性化合物，但對(duì)強(qiáng)極性化合物的保留和分離能力較弱，而親水相互作用色譜（hydrophilic interaction liquid chromatography，HILIC）對(duì)強(qiáng)極性化合物有較好的分離和保留，具有與 RPLC互補(bǔ)的選擇性[24-27]。因此，RPLC和 HILIC相結(jié)合可以擴(kuò)大代謝物的分離檢測(cè)范圍，與質(zhì)譜聯(lián)用后可獲得更全面的代謝物種類及含量的信息。但 UPLC-HRMS技術(shù)在蜂王漿代謝物研究中的應(yīng)用非常有限，而且只進(jìn)行了靶向分析[12-13]，非靶向的 RPLC-HRMS和HILIC-HRMS以及二者同時(shí)應(yīng)用到蜂王漿中的研究還未有報(bào)道。代謝組學(xué)研究中，溶劑提取法是廣泛使用的代謝物提取方法，目前常用的樣品提取溶劑有甲醇、乙醇、乙腈以及與水組成的混合溶劑提取體系，不同溶劑對(duì)代謝物的提取會(huì)產(chǎn)生不同的影響[28-30]。蜂王漿代謝成分復(fù)雜，化學(xué)性質(zhì)和豐度差異大，提取溶劑的選擇至關(guān)重要，目前常用的提取溶劑有90%乙醇[14]、50%甲醇[12-13]、100%甲醇[16]及 50%乙腈[31]等，但缺乏系統(tǒng)的比較研究?！颈狙芯壳腥朦c(diǎn)】分別基于RPLC和HILIC聯(lián)合Q-Exactive Orbitrap HRMS以及代謝組學(xué)分析技術(shù)對(duì)蜂王漿中的小分子化合物進(jìn)行全面分析，通過(guò)多元統(tǒng)計(jì)分析比較不同濃度（50%和 80%）的甲醇、乙醇和乙腈對(duì)蜂王漿代謝物的提取效果，優(yōu)化蜂王漿代謝物的提取方法?！緮M解決的關(guān)鍵問(wèn)題】建立并優(yōu)化蜂王漿小分子化合物成分的高效提取方法，對(duì)蜂王漿中的小分子化合物進(jìn)行全面解析，為后續(xù)蜂王漿代謝組學(xué)研究提供技術(shù)支持。

1 材料與方法

試驗(yàn)于 2019年在中國(guó)農(nóng)業(yè)科學(xué)院蜜蜂研究所完成。

1.1 化學(xué)試劑

質(zhì)譜級(jí)乙腈（A955-4）、質(zhì)譜級(jí)甲醇（A456-4）、質(zhì)譜級(jí)乙醇（24102）、色譜級(jí)甲酸（50144）和甲酸銨（A115-50）購(gòu)自Fisher Scientific，超純水由Milli-Q純水機(jī)制備，化合物標(biāo)準(zhǔn)品購(gòu)自Sigma。

1.2 儀器設(shè)備

質(zhì)譜儀（Q-Exactive），美國(guó) Thermo Fisher Scientific公司；超高效液相色譜系統(tǒng)（Ultimate 3000），美國(guó)Thermo Fisher Scientific公司；臺(tái)式低溫離心機(jī)（Microfuge 22R Centrifuge），美國(guó)BeckMAN CoulTER公司；電子分析天平（PL203，0.1 mg），德國(guó) METTLER TOLEDO公司；超低溫冰箱（MDF-U3286S），日本SANYO公司；非接觸超聲波細(xì)胞粉碎機(jī)（Scientz08-III），寧波 SCIENTZ公司；快速低溫冷卻循環(huán)機(jī)（DLK-2007），寧波SCIENTZ公司。

1.3 樣品采集

以飼養(yǎng)于中國(guó)農(nóng)業(yè)科學(xué)院蜜蜂研究所養(yǎng)蜂基地的蜂王漿高產(chǎn)蜜蜂作為試驗(yàn)蜂群，蜂王購(gòu)買(mǎi)于浙江省。參考常用的蜂王漿生產(chǎn)方法[32-34]獲得蜂王漿樣品：準(zhǔn)備并清理含有63個(gè)塑料王臺(tái)的產(chǎn)漿條，移取1日齡小幼蟲(chóng)至王臺(tái)中，將該產(chǎn)漿條固定在產(chǎn)漿框后放至所選取的蜂群繼箱中，72 h后取出產(chǎn)漿框，割除蠟蓋并移走王臺(tái)中的幼蟲(chóng)后，收集蜂王漿于1.5 mL離心管，保存于-80℃冰箱中備用。

1.4 代謝物提取

利用6種不同有機(jī)溶劑（50%和80%甲醇、50%和80%乙醇、50%和80%乙腈）分別提取蜂王漿中的代謝物，每種提取方法6個(gè)平行樣。將凍存的蜂王漿樣品置于冰上充分解凍，均質(zhì)化后，準(zhǔn)確稱取0.1 g至4 mL棕色進(jìn)樣瓶中，加入4 mL溶劑，超聲40 min，使樣品充分溶解，取1.4 mL樣品混合液轉(zhuǎn)移到1.5 mL離心管中，4℃條件下12 000 r/min離心20 min，取上清液用0.22 μm有機(jī)相濾膜過(guò)濾，收集到2 mL棕色進(jìn)樣瓶中供UPLC-MS分析。每個(gè)樣品分別取30 μL，混合到2 mL棕色進(jìn)樣瓶中，作為質(zhì)量控制（QC）樣品?？瞻讓?duì)照只加入 6種有機(jī)溶劑的混合液，其他操作流程與樣品處理完全一致。

1.5 UPLC-MS分析

RPLC方法：ZORBAX SB-Aq C18反相色譜柱（Agilent，100 mm×2.1 mm，1.8 μm）；進(jìn)樣量3 μL；柱溫40℃；流動(dòng)相A為0.1%甲酸-水溶液，流動(dòng)相B為0.1%甲酸-乙腈；流速0.3 mL·min-1。梯度洗脫：0—2 min，95%—70% A；2—8 min，70%—15% A；8—9 min，15%—15% A；9—9.5 min，15%—95% A；9.5—13 min，95%—95% A。

HILIC方法：ACQUITY BEH Amide色譜柱（Waters，150 mm×2.1 mm，1.7 μm）；進(jìn)樣量3 μL；柱溫50℃；流動(dòng)相A為30%乙腈溶液（含0.1%甲酸和10 mmol甲酸銨），流動(dòng)相B為95%乙腈溶液（含0.1%甲酸和10 mmol甲酸銨）；流速0.3 mL·min-1。梯度洗脫：0—2 min，0—0 A；2—8 min，0—80% A；8—9 min，80%—80% A；9—9.5 min，80%—0 A；9.5—13.5 min，0—0 A。

質(zhì)譜條件：采用 HESI離子源，在正、負(fù)離子切換模式下采集，參數(shù)設(shè)置如下：離子源溫度 320℃，噴霧電壓3.5 kV（ESI+）和3.0 kV（ESI-），鞘氣流速40 arb，輔助氣流速5 arb，S-lens射頻電壓60%，母離子掃描分辨率70 000，掃描范圍70—1 000 m/z，自動(dòng)增益控制目標(biāo)離子數(shù)1×106，最大離子注入時(shí)間50 ms，掃描速率1 scan/s。為了鑒定化合物，需要進(jìn)行數(shù)據(jù)依賴型二級(jí)掃描，參數(shù)設(shè)置如下：掃描分辨率17 500，自動(dòng)增益控制目標(biāo)離子數(shù)1×105，最大離子注入時(shí)間50 ms，TopN為10，信號(hào)強(qiáng)度閾值2×106，動(dòng)態(tài)排除8 s，頂點(diǎn)激發(fā)2—7 s，歸一化碰撞能量（NCE）為15%、40%和60%。先進(jìn)10針QC樣品，以平衡系統(tǒng)，此數(shù)據(jù)不用于后續(xù)分析。所有的蜂王漿樣品順序隨機(jī)打亂，以減小系統(tǒng)誤差。為了檢測(cè)系統(tǒng)的穩(wěn)定性及校正數(shù)據(jù)，每9個(gè)樣品之間進(jìn)1針QC樣品。通過(guò)Xcalibur軟件（Thermo Fisher Scientific）收集MS和MS/MS數(shù)據(jù)并保存為Raw格式文件。

1.6 數(shù)據(jù)處理與分析

將Raw文件導(dǎo)入Compound Discoverer 2.1軟件（Thermo Fisher Scientific）進(jìn)行離子峰識(shí)別、峰對(duì)齊、峰面積歸一化處理及數(shù)據(jù)庫(kù)搜索。參數(shù)設(shè)置如下：最大允許偏移時(shí)間0.2 min，質(zhì)量允許偏差5 ppm，信噪比閾值3，峰響應(yīng)強(qiáng)度最小值1×106，樣品與空白比值5，基于QC峰面積進(jìn)行校正，QC覆蓋范圍＞50%且QC峰面積相對(duì)標(biāo)準(zhǔn)偏差＜30%。根據(jù)精準(zhǔn)質(zhì)量數(shù)及 MS/MS質(zhì)譜圖的離子碎片信息，使用HMDB（http://www.hmdb.ca/）、mzCloud（https://www.mzcloud.org/）、ChemSpider（http://www.chemspider.com/）、LIPID MAPS（http://lipidmaps.org/）和 KEGG（http://www.genome.jp/kegg/）數(shù)據(jù)庫(kù)進(jìn)行化合物鑒定，確定可能的化合物，購(gòu)買(mǎi)相應(yīng)的標(biāo)準(zhǔn)品并進(jìn)行二級(jí)質(zhì)譜分析，進(jìn)一步驗(yàn)證。采用SIMCA 14.0軟件，進(jìn)行多變量統(tǒng)計(jì)分析：經(jīng)Pareto-scaling處理和log轉(zhuǎn)換后進(jìn)行PCA分析，可直觀上反應(yīng)各組樣本的空間分布，從總體上反映樣本之間的代謝譜差異；經(jīng)Paretoscaling處理后，采用正交偏最小二乘判別分析（orthogonal partial least squares-discriminant analysis，OPLS-DA），在建模過(guò)程中對(duì)模型數(shù)據(jù)進(jìn)行置換檢驗(yàn)并計(jì)算變量投影重要度（variable importance in the projection，VIP）。VIP＞1.0且單變量統(tǒng)計(jì)分析（Student’st-test）中P＜0.05 和倍數(shù)變化（fold change，F(xiàn)C）＞1.2的代謝物作為具有顯著差異的代謝物。使用Cluster和Treeview軟件進(jìn)行已定性化合物的聚類熱圖分析。計(jì)算代謝特征離子和已定性化合物在同一溶劑6個(gè)技術(shù)重復(fù)的峰面積的RSD，以檢測(cè)不同溶劑提取過(guò)程的穩(wěn)定性。

2 結(jié)果

2.1 分析系統(tǒng)的穩(wěn)定性

將RPLC和HILIC條件下QC樣品的總離子流圖分別進(jìn)行疊加，結(jié)果顯示色譜峰的保留時(shí)間及信號(hào)響應(yīng)強(qiáng)度高度重疊（圖1）。在RPLC和HILIC條件下檢測(cè)到的代謝特征離子的數(shù)量分別是955和1 113個(gè)，基于這些代謝特征離子的PCA分析表明，所有QC樣品聚集緊密（圖2）。

2.2 化合物鑒定

通過(guò)數(shù)據(jù)庫(kù)代謝物譜圖信息比對(duì)及標(biāo)準(zhǔn)品驗(yàn)證，在RPLC和HILIC條件下分別鑒定到50和51種高豐度化合物，兩者共有的化合物有31種。脂類等中低極性化合物，包括兩組同分異構(gòu)體（3-羥基癸酸與 10-羥基癸酸，11-羥基十二烷酸與12-羥基十二烷酸），在RPLC條件下得到較好的分離；而氨基酸、糖類等強(qiáng)極性化合物，包括葡萄糖與果糖等同分異構(gòu)體，在HILIC條件下分離良好。在蜂王漿樣品中共鑒定到70種化合物（53種經(jīng)過(guò)標(biāo)準(zhǔn)品驗(yàn)證），涵蓋了糖類、氨基酸、脂類、維生素等，其豐度差異高達(dá)8 340倍，其中有17種化合物為本研究首次報(bào)道（表1）。

2.3 不同溶劑的提取效果

首先，比較了不同溶劑提取蜂王漿得到的代謝特征離子的數(shù)量和RSD值。使用50%和80%乙腈、50%和80%乙醇、50%和80%甲醇，在RPLC條件下分別鑒定到817、808、878、889、879和932個(gè)代謝特征離子，在HILIC條件下分別鑒定到799、752、857、869、805和865個(gè)代謝特征離子?？梢钥闯觯靡译嫒軇┑玫降拇x特征離子數(shù)量最少，與50%乙腈相比，80%乙腈提取效果更差。對(duì)甲醇和乙醇而言，高濃度時(shí)的代謝特征離子數(shù)量更多，濃度變化對(duì)甲醇的影響更大。所有溶劑組的特征離子RSD值具有相似的分布模式，集中分布在20%范圍內(nèi)，但80%乙腈組在10%內(nèi)的占比最低（圖3）。

其次，通過(guò)計(jì)算70種代謝物峰面積的RSD值，進(jìn)一步檢測(cè)溶劑提取過(guò)程的穩(wěn)定性（圖 4）。80%乙腈組的RSD值主要集中在5%—10%范圍內(nèi)，其次為0—5%，有11種代謝物的RSD值＞15%。其他5種溶劑組的 RSD值分布模式相似，主要集中在 0—5%和5%—10%范圍內(nèi)。

表1 在蜂王漿中鑒定到的化合物Table 1 Tentatively identified compounds in royal jelly

續(xù)表1 Continued table 1

圖1 QC樣品的總離子流疊加圖Fig. 1 Overlapping of total ion chromatography (TIC) of QCs

圖2 基于代謝特征離子的主成分分析得分圖Fig. 2 The PCA score plots based on metabolite features

2.4 主成分分析

基于代謝特征離子進(jìn)行 PCA分析，分別考察在RPLC和HILIC條件下不同溶劑對(duì)蜂王漿代謝物的提取效果。在RPLC條件下第1和第2主成分分別解釋了總變異的49.9%和13.8%，在HILIC條件下第1和第2主成分分別為37.0%和20.9%。根據(jù)每個(gè)樣本在PCA得分圖上的分布規(guī)律可以發(fā)現(xiàn)，來(lái)自同一提取溶劑的樣品分布比較集中，不同溶劑提取的樣品間存在差異，其中，80%乙腈組與其他5組差異最大，甲醇和乙醇的濃度變化對(duì)蜂王漿代謝物提取的影響較?。▓D2）。

2.5 差異代謝物的篩選

圖3 代謝特征離子的相對(duì)標(biāo)準(zhǔn)偏差Fig. 3 The relative standard deviation of metabolite features

圖4 已鑒定化合物的相對(duì)標(biāo)準(zhǔn)偏差Fig. 4 The relative standard deviation of identified compounds

為了篩查在 PCA分析中將 80%乙腈組和其他 5組明顯區(qū)分開(kāi)的主要化合物，對(duì)鑒定到的70種化合物進(jìn)行OPLS-DA分析。OPLS-DA分析能夠過(guò)濾掉無(wú)關(guān)組分，凸顯組間差異。該模型包含3個(gè)主成分，其擬合參數(shù)為R2X=0.913，R2Y=0.983，Q2=0.977，即用91.3%的變量解釋了 98.3%的組間差異，預(yù)測(cè)能力為97.7%，表明該模型的可靠性和預(yù)測(cè)率較高。為了避免有監(jiān)督模型在建模過(guò)程中發(fā)生擬合，采用置換檢驗(yàn)對(duì)模型進(jìn)行檢驗(yàn)，參數(shù)為R2=0.194，Q2=-0.447，說(shuō)明此模型未發(fā)生過(guò)擬合，結(jié)果可靠（圖 5-A）。得到相應(yīng)的S-plot圖（圖5-B），一個(gè)點(diǎn)代表一個(gè)變量，越是在圖的兩端代表該化合物在該組的含量越高。VIP用來(lái)衡量各代謝物的表達(dá)模式對(duì)各組樣本分類判別的影響強(qiáng)度和解釋能力，以及輔助標(biāo)志代謝物的篩選，VIP值＞1.0的變量被認(rèn)為是對(duì)分類具有重要意義的變量。將VIP＞1.0且單變量統(tǒng)計(jì)分析P＜0.05和FC＞1.2的代謝物作為具有顯著差異的代謝物，共篩選出8種差異化合物（賴氨酸、磷酸膽堿、葡萄糖、蔗糖、果糖、腺苷、葡萄糖酸和膽堿），其含量在80%乙腈組顯著低于其他5組（圖5-B）。

2.6 代謝物熱圖分析

聚類熱圖分析結(jié)果表明，已鑒定的70種化合物總體上分為兩個(gè)分支。分支1包括22種化合物，主要為中低極性物質(zhì)，在50%溶劑組豐度較低。分支2主要為強(qiáng)極性物質(zhì)，在80%乙腈組豐度最低，在其他5組的差異不明顯（圖6）。

圖5 80%乙腈組與其他5組間差異代謝物Fig. 5 Differential metabolites between the 80% acetonitrile and the five other solvents

3 討論

本研究分別基于RPLC和HILIC聯(lián)合高分辨質(zhì)譜技術(shù)對(duì)蜂王漿小分子化合物進(jìn)行代謝輪廓分析，基于代謝組學(xué)方法評(píng)估和優(yōu)化蜂王漿代謝物的提取方法。在蜂王漿樣品中共鑒定了 70種高豐度化合物，發(fā)現(xiàn)80%甲醇和 80%乙醇具有更高的提取效率，80%乙腈提取蜂王漿代謝物的重復(fù)性差且強(qiáng)極性物質(zhì)的豐度最低。

3.1 數(shù)據(jù)質(zhì)量評(píng)估

儀器分析系統(tǒng)的穩(wěn)定性是獲得穩(wěn)定重現(xiàn)的代謝組學(xué)數(shù)據(jù)的前提，是代謝組學(xué)研究成功的關(guān)鍵，QC樣品在實(shí)驗(yàn)分析中的重復(fù)性是評(píng)價(jià)系統(tǒng)穩(wěn)定性的常用指標(biāo)之一[35]。本研究將蜂王漿提取物等體積混合后作為QC樣品，采用與實(shí)際樣品同樣的進(jìn)樣方法，每分析9個(gè)樣品穿插1個(gè)QC樣品。由總離子流圖的疊加圖（圖1）可知，QC樣品的峰形重現(xiàn)性良好，表明儀器帶來(lái)的偏差很小。在PCA得分圖（圖2）中，QC樣品緊密聚集，進(jìn)一步表明分析系統(tǒng)具有較好的穩(wěn)定性和重復(fù)性。

3.2 蜂王漿小分子化合物鑒定

代謝組學(xué)的研究對(duì)象是生物樣品中的代謝物，如氨基酸、糖、核苷酸、脂類等極性及非極性化合物[36]。UPLC-HRMS是代謝組學(xué)分析的有力平臺(tái)，高效的色譜分離能有效區(qū)分同分異構(gòu)體，減少共流出化合物導(dǎo)致的離子抑制效應(yīng)，從而有助于增加質(zhì)譜檢測(cè)化合物的種類和數(shù)量，并提高測(cè)定結(jié)果的準(zhǔn)確度[23,37]。目前常用的分離色譜柱主要有RPLC和HILIC色譜柱，前者對(duì)于非極性和中低極性化合物的分離發(fā)揮重要作用，對(duì)強(qiáng)極性化合物的分離和保留能力較弱[38]，而HILIC色譜柱在分離強(qiáng)極性化合物方面表現(xiàn)出更大的優(yōu)勢(shì)[24]。

本研究比較了RPLC和HILIC兩種色譜柱在分析蜂王漿代謝物種類上的互補(bǔ)性。在RPLC和HILIC條件下分別鑒定了50和51種高豐度代謝物，共有代謝物有31種。脂類等中低極性化合物，包括兩組同分異構(gòu)體（3-羥基癸酸與 10-羥基癸酸，11-羥基十二烷酸與 12-羥基十二烷酸），在 RPLC條件下得到較好的分離；而氨基酸、糖類等強(qiáng)極性化合物，包括葡萄糖與果糖等同分異構(gòu)體，在HILIC條件下分離良好。以上結(jié)果證明了兩種色譜柱的互補(bǔ)性，以及在蜂王漿代謝組學(xué)研究中的必要性。在蜂王漿樣品中共鑒定了70種化合物（表 1），其中大部分化合物已在蜂王漿中報(bào)道[11-12]，17種化合物為本研究首次發(fā)現(xiàn)。受二級(jí)質(zhì)譜數(shù)據(jù)庫(kù)譜圖數(shù)量的限制，本研究中還有大量代謝特征離子未能定性。此外，蜂王漿成分受蜂種、地理環(huán)境、氣候條件、天氣因素、蜜粉源狀況、蜂群飼養(yǎng)管理以及生產(chǎn)方式等多種因素的影響[39-40]。因此，完善二級(jí)質(zhì)譜數(shù)據(jù)庫(kù)，增加蜂王漿的種類，使用以上代謝組學(xué)方法，將鑒定出更多的蜂王漿小分子化合物。

圖6 已鑒定化合物的聚類熱圖Fig. 6 The clustering heatmap of identified compounds

3.3 不同溶劑對(duì)代謝物提取的影響

代謝物的提取是代謝組學(xué)的核心組成部分，合適的提取方法是獲得較高提取效率的保證，不同的提取溶劑適用于不同的代謝產(chǎn)物，因此提取溶劑的選擇至關(guān)重要。蜂王漿中所含代謝物種類繁多，化學(xué)性質(zhì)差異較大。本研究以兩種不同濃度的乙腈、乙醇和甲醇為研究對(duì)象，在基于UPLC-HRMS代謝組學(xué)分析中表明，80%乙腈對(duì)蜂王漿強(qiáng)極性化合物（特別是賴氨酸等8種化合物）的提取效率最低（圖5、圖6），且重復(fù)性較差（圖3、圖4）。PINA等[12]在提取蜂王漿極性代謝物時(shí)發(fā)現(xiàn)，與50%甲醇相比，80%乙腈的提取效率低，與本研究結(jié)果一致。在其他生物樣品的代謝組學(xué)研究中，也有類似報(bào)道。例如，通過(guò)比較不同溶劑（甲醇、乙醇、乙腈及其水溶液）對(duì)白蘆筍代謝物的提取效果，發(fā)現(xiàn)隨著乙腈比例的增加，代謝特征離子數(shù)目及峰面積明顯減少[41]；在血清代謝組學(xué)研究中，利用乙腈提取檢測(cè)到的代謝特征離子數(shù)目最少，而且RSD值最大[42]。本研究發(fā)現(xiàn)，與50%甲醇和50%乙醇相比，80%甲醇和80%乙醇提取的蜂王漿代謝特征離子數(shù)量更多，中低極性物質(zhì)的豐度更高（圖6）。因此，80%甲醇和80%乙醇是蜂王漿代謝組學(xué)研究的最佳提取溶劑。以往研究表明，80%乙醇能有效沉淀蜂王漿中的蛋白，并用于提取蜂王漿中的腺苷[43]。80%甲醇和80%乙醇也廣泛用于其他生物樣品的非靶向代謝組學(xué)研究[44-49]。

4 結(jié)論

建立了基于RPLC和HILIC四級(jí)桿-靜電場(chǎng)軌道阱高分辨串聯(lián)質(zhì)譜技術(shù)的蜂王漿代謝輪廓分析方法，共鑒定了70種高豐度化合物，實(shí)現(xiàn)了糖、脂類、維生素和氨基酸等小分子化合物的檢測(cè)，發(fā)現(xiàn) 80%甲醇或80%乙醇是提取蜂王漿代謝物的最佳溶劑，為后續(xù)蜂王漿代謝組學(xué)研究提供了技術(shù)支持。