肖 琳，陳 中

(華南理工大學(xué)食品科學(xué)與工程學(xué)院，廣州 510640)

芽孢桿菌在微生物探討領(lǐng)域有著具大的作用。芽孢桿菌是工業(yè)上酶的重要菌種來源，利用芽孢桿菌通過發(fā)酵能產(chǎn)生具有高活性、高純度的淀粉酶、蛋白酶、纖維酶等[1,2]。木質(zhì)素是一種難降解的無定形芳香化合物，但經(jīng)鑒定表明，解糖類芽孢桿菌能降解纖維素和半纖維素，并能降解木質(zhì)素[3]。芽孢桿菌在農(nóng)作物的殺蟲防病和畜牧業(yè)上具有廣泛的應(yīng)用[4]，它產(chǎn)生的多種功能代謝產(chǎn)物還具有抑菌和促生效果，還可應(yīng)用在研究生物保鮮和生物肥料等方面[5]。現(xiàn)在很多飼料會(huì)添加益生菌。益生菌種類以芽孢桿菌、乳酸菌和酵母菌為主[6]。芽孢桿菌現(xiàn)已經(jīng)被應(yīng)用至醫(yī)學(xué)研究范疇。例如：大量實(shí)驗(yàn)證明支氣管炎、腸炎等可利用枯草芽孢桿菌活菌劑來治療。此外，芽孢桿菌還可用于預(yù)防和治療皮膚細(xì)菌感染[7]。

本實(shí)驗(yàn)采用高溫純水中分離出來的菌株作為目標(biāo)菌，對(duì)其進(jìn)行鑒定和理化特性研究，對(duì)摸索其殺滅方式及對(duì)后續(xù)進(jìn)行監(jiān)控具有一定的參考價(jià)值，也為開發(fā)此菌在各領(lǐng)域的應(yīng)用奠定了基礎(chǔ)。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 主要設(shè)備

分析天平/電子天平，振蕩器，恒溫培養(yǎng)箱，生物安全柜(博科生物生產(chǎn))，超凈工作臺(tái)，冰箱，生物顯微鏡，紫外分光光度計(jì)，高壓蒸汽滅菌器，pH計(jì)，過濾器，恒溫水浴鍋(上海精宏實(shí)驗(yàn)設(shè)備有限公司生產(chǎn))。

1.1.2 試劑與培養(yǎng)基

R2A瓊脂培養(yǎng)基、TSA胰蛋白胨大豆瓊脂、LB培養(yǎng)基、MC 麥康凱瓊脂培養(yǎng)基(均為廣州市環(huán)凱生物科技有限公司生產(chǎn))。氧化酶試劑(生物梅里埃公司生產(chǎn))，氯化鈉(廣州化學(xué)試劑廠生產(chǎn))，API20E、API20NE、API50CH(生物梅里埃公司生產(chǎn))，細(xì)菌基因組DNA快速提取試劑盒(廣東東盛生物科技公司生產(chǎn))。

1.2 方法

1.2.1 菌株的采集、復(fù)蘇與保存

純化水按藥典方法采用薄膜過濾法收集，通過R2A培養(yǎng)基培養(yǎng)，TSA液體培養(yǎng)基中復(fù)蘇，劃板于TSA固體培養(yǎng)基平上，得到目標(biāo)菌種。

1.2.2 細(xì)菌形態(tài)觀察

選取營養(yǎng)瓊脂平板上的24 h的新鮮菌落進(jìn)行革蘭氏染色[8]和芽孢染色[9],于顯微鏡下觀察菌落的形態(tài)。

1.2.3 生理生化鑒定

A.運(yùn)動(dòng)性[10]。

利用穿刺法蘸取新鮮菌落于斜面培養(yǎng)基上，放置于35℃培養(yǎng)箱中培養(yǎng)24～48 h再觀察。如在培養(yǎng)基內(nèi)向邊緣擴(kuò)散，則表示有運(yùn)動(dòng)性。

B.氧化酶試驗(yàn)[10]。

將二甲基對(duì)苯二胺1%水溶液滴于干凈的濾紙上，挑取新鮮菌落于濾紙上，如果在10 s內(nèi)出現(xiàn)紅色為陽性，否則為陰性。

C.AIP20 E、API20NE、API50CH生化試劑盒鑒定進(jìn)行生化鑒定。

D.16S rDNA鑒定。

DNA提?。簠⒄誅NA快速提取試劑盒。

DNA質(zhì)量檢驗(yàn)：用超微量的分光光度計(jì)檢測 DNA的長度和濃度。

PCR擴(kuò)增：利用試劑盒對(duì)所提取的DNA通過聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)(PCR)用來擴(kuò)增基因片段[11]。委托廣東省微生物研究所完成。

DNA序列的測定：將轉(zhuǎn)化好的菌液以1∶1的體積比加入50%的甘油，送往廣州華大基因科技有限公司進(jìn)行測序，對(duì)比分析序列的同源性，確定其最終的種類。

E.體外抑菌試驗(yàn)。

將新鮮培養(yǎng)好的菌懸液于8 000 r/min離心10 min，離心后取上清液濃縮至10 mL，作為待測液。準(zhǔn)備五種致病指示菌(大腸桿菌ATCC25922、金黃色葡萄球菌ATCC25923、鼠傷寒沙門氏菌ATCC14028、內(nèi)志賀氏菌ATCC25931、乙型副傷寒桿菌CMCC50094)制備成菌懸液并均勻涂抹于LB培養(yǎng)基板上。在培養(yǎng)基平板中間打一小孔，孔內(nèi)注入100 μL制備好的芽孢桿菌待測液，置于37℃培養(yǎng)箱培養(yǎng)12 h，觀察是否有抑菌圈出現(xiàn)[12,13]。

F.生長曲線的繪制。

將新鮮菌株配置成濃度為108 CFU/mL菌懸液作為待測液。在裝有100 mL LB液體培養(yǎng)基的錐形瓶。加入2 mL的待測菌懸液，并編號(hào)，置于37℃培養(yǎng)箱培養(yǎng)24 h，每隔8 h取出錐形瓶，吸出1 mL菌懸液，用分光光度計(jì)測定培養(yǎng)基的OD600(細(xì)菌培養(yǎng)液在600 nm處的吸光值，利用吸光值來測量細(xì)菌培養(yǎng)液的濃度)。最后，將待測菌各個(gè)時(shí)間段的菌落OD值繪制成生長曲線[14,15]。

G.耐膽鹽性實(shí)驗(yàn)。

膽鹽的主要成分是鈉鹽或鉀鹽，是動(dòng)物膽汁中參與脂肪消化吸收的重要成分，具有殺菌功能[16]。配制膽鹽濃度分別為0.2%、0.5%、1%、2%、5%、8%、10%的LB培養(yǎng)基，接入等量的菌懸液，37℃和恒溫培養(yǎng)24 h，設(shè)未接菌的空白作對(duì)照。

H.耐熱性實(shí)驗(yàn)。

將活化后的菌懸液分三次接種到LB液體培養(yǎng)基中，37℃培養(yǎng)4 h，將水浴鍋溫度依次設(shè)置為95℃、105℃、115℃。每個(gè)溫度段分別培養(yǎng)5 min、10 min、15 min和20 min，然后通過無菌操作吸收1 mL用高溫處理過的細(xì)菌溶液，快速冷卻，并在平板上計(jì)數(shù)。

I.耐酸性實(shí)驗(yàn)。

因動(dòng)物胃酸pH值大概在2.0～6.0，將菌懸液按5%的比例分別接種于不同pH的LB培養(yǎng)基中，培養(yǎng)基用HCl來調(diào)節(jié)pH值，并置于 37℃培養(yǎng)箱培養(yǎng)，分別2 h、4 h，吸1 mL并用MC培養(yǎng)基培養(yǎng)后計(jì)數(shù)，重復(fù)三次[17-18]。

動(dòng)態(tài)顯色法檢測4種清熱解毒類中藥注射液中細(xì)菌內(nèi)毒素含量 …………………………………………… 張軍霞等（13）：1806

2 結(jié)果與分析

2.1 菌落形態(tài)觀察

觀察在TSA瓊脂平板上培養(yǎng)2 h的菌落后發(fā)現(xiàn)，菌落蔓延擴(kuò)散，呈油脂稍透明狀，圓形，菌落淡黃色，表面干燥，無固定大小，在營養(yǎng)瓊脂上無可溶性色素，如圖1。

圖1 菌落Fig.1 Colony

2.2 細(xì)菌形態(tài)觀察

革蘭氏染色：通過染色將玻片放在40×100倍的顯微鏡下觀察。細(xì)菌革蘭氏染色陽性、桿狀，可見菌體內(nèi)膨大的芽孢囊。

芽孢染色：在油鏡下觀察，菌體呈紅色，在膨大的胞囊內(nèi)芽孢呈綠色。

2.3 生理生化鑒定結(jié)果

通過運(yùn)動(dòng)性實(shí)驗(yàn)發(fā)現(xiàn)，細(xì)菌具有鞭毛，在培養(yǎng)基管內(nèi)觀察其具有一定的運(yùn)動(dòng)性。結(jié)合細(xì)菌的生理生化特性和菌落形態(tài)，根據(jù)《伯杰氏細(xì)菌鑒定手冊(cè)》，可初步鑒定出該菌株屬于解糖類芽孢桿菌屬。菌株生理生化鑒定結(jié)果見表1。

表1 菌株生理生化鑒定結(jié)果Tab.1 Physiological and biochemical identification results of the strain

2.4 16S rDNA鑒定結(jié)果

測序引物為1492R和27F。

基因組序列：實(shí)驗(yàn)菌株與對(duì)照條帶比較，可知目標(biāo)擴(kuò)增產(chǎn)物的片段長度大約為450 bp，則通過16S rRNA基因序列比對(duì)表明，該菌株與解糖類芽孢桿菌關(guān)系最密切，并結(jié)合生理生化反應(yīng)結(jié)果，將其鑒定為成解糖類芽孢桿菌。

測序結(jié)果：中文名為解糖類芽胞桿菌(拉丁名Paenibacillus glucanolyticus)。

2.5 體外抑菌試驗(yàn)結(jié)果

通過體外抑菌法進(jìn)行對(duì)常見致病菌五種致病指示菌進(jìn)行抑菌實(shí)驗(yàn)，試驗(yàn)結(jié)果如表2，說明解糖類芽孢桿菌對(duì)五種常見致病菌均有抑制作用。

表2 解糖類芽孢桿菌抑菌性Tab.2 Bacteriostasis of bacillus amyloliquefaciens

2.6 菌株生長曲線繪制

從實(shí)驗(yàn)可知，解糖類芽孢桿菌從培養(yǎng)至16 h后，吸光度OD600顯著上升，生長速度較快，進(jìn)入對(duì)數(shù)增長期。菌株培養(yǎng)至24 h，OD600到達(dá)最高值，24 h后，曲線平緩下降，菌體進(jìn)入穩(wěn)定生長期。32 h后，生長速度下降較快，菌體進(jìn)入衰亡期。故在本實(shí)驗(yàn)中，一般選取培養(yǎng)24 h菌齡的菌株為最適合接種菌株。

2.7 耐膽鹽性實(shí)驗(yàn)結(jié)果

由表3可知，該菌株在2%以下鹽度的培養(yǎng)基中可生長。解糖類芽孢桿菌可以在低濃度鹽溶液中生長，具有一定的耐膽鹽性。

表3 耐鹽性實(shí)驗(yàn)結(jié)果Tab.3 Experimental results of salt tolerance

2.8 耐熱性實(shí)驗(yàn)結(jié)果

從圖2中可看出，在95℃、105℃、115℃三個(gè)不同溫度下，加熱5 min后，細(xì)菌數(shù)量沒有減少，反而有少量增加，原因可能是時(shí)間短，液體傳熱速度慢，短時(shí)高溫反而促進(jìn)孢子萌發(fā)。隨著加熱時(shí)間的延長，10 min后下降趨勢明顯。115℃和105℃熱處理20 min后，活菌數(shù)減少了2個(gè)數(shù)量級(jí)。95℃熱處理20 min后，僅減少了一個(gè)數(shù)量級(jí)。115℃隨著加熱時(shí)間增加，菌落減少較顯著，95℃和105℃熱處理曲線變化相對(duì)平緩，需要較長的加熱時(shí)間才能殺死相同數(shù)量的芽孢桿菌。

圖2 菌株耐熱曲線Fig.2 The heat resistance curve of strain

2.9 耐酸性實(shí)驗(yàn)結(jié)果

當(dāng)初始pH值在2～6時(shí)，細(xì)菌數(shù)量隨pH值的變化而變化。當(dāng)細(xì)菌處于強(qiáng)酸環(huán)境下(pH值為2和3)生長時(shí)，培養(yǎng)基的OD650值在0～14 h內(nèi)基本不變，約為0.3，說明解糖類芽孢桿菌在強(qiáng)酸性條件下生長性能差。在當(dāng)初始pH為4時(shí)，OD650隨時(shí)間變化而呈上升趨勢，pH接近中性，OD650短時(shí)間內(nèi)接近OD650=1.7的時(shí)間越短，這說明，在弱酸性和中性環(huán)境下生長速度較快。因此，降低環(huán)境pH值的方法可用于抑制解糖類芽孢桿菌的生長。

3 結(jié)論

以生產(chǎn)用純水中分離出來的菌落作為目標(biāo)菌株，通過生理生化鑒定及經(jīng)DNA基因測序?qū)⒕觇b定為解糖類芽孢桿菌。進(jìn)一步對(duì)其理化性質(zhì)進(jìn)行研究發(fā)現(xiàn)，此芽孢桿菌具有一定的抑菌性，可應(yīng)用到動(dòng)物飼料加工、食品防腐劑、生物防治等領(lǐng)域[19]。因?yàn)閯?dòng)物體內(nèi)的消化道環(huán)境非常復(fù)雜，如酸性環(huán)境的胃、含有膽鹽的腸道以及酶分解等作用，這些均是影響益生菌存活的關(guān)鍵因素。但解糖類芽孢桿菌具有耐酸性、耐膽鹽性以及耐高溫，利用這些優(yōu)勢，可以將其應(yīng)用至益生菌中[20]。本實(shí)驗(yàn)通過對(duì)解糖類芽孢桿菌生理生化特性的初步研究，填補(bǔ)了此菌在這方面資料的空白。

說明該菌抗菌譜較寬，對(duì)病原菌有一定的抑菌作用，在生物防治、醫(yī)藥衛(wèi)生和畜牧業(yè)等方面具有應(yīng)用潛力。