謝 憲 梁 軍,2 朱彥鵬 胡瑞瑞 程 元 張星耀,2

(1. 中國林業(yè)科學研究院森林生態(tài)環(huán)境與保護研究所 國家林業(yè)和草原局森林保護學重點實驗室 北京 100091; 2. 昆崳山森林生態(tài)系統(tǒng)國家定位觀測研究站 煙臺 264100; 3. 中國環(huán)境科學研究院 北京 100012)

松球殼孢菌(Sphaeropsissapinea)可引起針葉樹種的枯梢病(Blodgettetal., 2005)?？萆也〉陌l(fā)生會影響多種針葉樹的生長發(fā)育，尤其是松屬(Pinusspp.)，已造成了重大生態(tài)破壞和經濟損失(Stanoszetal.,1996)。經CABI統(tǒng)計，松球殼孢菌是世界上65個國家最常見的真菌類植物病原體之一(CABI, 2017)，目前已知松球殼孢菌廣泛分布于北半球的松樹自然分布區(qū)，這些樹木已被引種至南半球(Smithetal., 2006)。松枯梢病已在我國中南、西南、華南、華東、西北等10余個省份的松林中發(fā)生，對松樹林造成了嚴重的危害(葉建仁等, 2011)。

內生真菌在植物體內度過其全部或部分生命周期。當被定義為內生微生物時，這些菌種可能并不會對寄主植物造成直接傷害(Backmanetal., 2008; Rodriguezetal., 2009)，而且在某些情況下，內生菌對寄主會產生有益的影響(Arnold, 2007)。內生微生物通過種子從大樹垂直傳播到幼樹，并在葉和莖系統(tǒng)中生長(Santangeloetal., 2015)，通過有性孢子或無性孢子水平傳播(Arnoldetal., 2003)。已有研究表明，內生真菌在與寄主植物和其他內生微生物的互作中，能抵抗對植物病原菌的入侵，提高寄主植物的抗病性(Pakvazetal., 2016)。因此，植物內生微生物的群落結構的研究有利于解析寄主植物—病原菌—內生菌三者間的關系，對病害的預防和調控具有指導意義。

目前，關于松球殼孢菌侵染的研究主要集中在病原菌定殖和物種鑒定(Luchietal., 2014; Adamsonetal., 2015)、感染針葉的生化生理相應、激素和抗氧化代謝的變化(Huetal., 2018)和寄主抗性(Sherwoodetal., 2013)等方面。對感染松球殼孢菌的松樹寄主的內部微生物，特別是病原菌影響的真菌多樣性和群落結構的變化還未有研究。鑒于此，本研究選擇無病斑與感染枯梢病不同發(fā)病情況的赤松(Pinusdensiflora)針葉為研究對象，利用高通量測序技術研究不同枯梢病發(fā)病狀態(tài)下赤松針葉的內生真菌多樣性以及群落結構的差異，為松枯梢病的微生物防控提供參考。

1 材料與方法

1.1 研究區(qū)概況及樣地設置

昆崳山(121°41′34″—121°48′04″E，37°11′50″—37°17′49″N)地處山東半島東部，屬暖溫帶季風氣候，林區(qū)土壤屬森林棕壤，以沙質壤土為主。昆崳山是我國赤松原生地和天然分布中心，分布面積達11 546.3 hm2。共選取3塊30 m×30 m標準樣地(樣地P，海拔212 m；樣地Q，海拔196 m；樣地R，海拔185 m)。樣地立地條件均為中坡位，坡度為24°～26°，林分均為赤松純林，赤松占比超過80%。

1.2 樣品采集

2018年9月，在3塊純林樣地內進行采樣，由于枯梢病病原菌存在潛伏侵染的情況以及針葉不同發(fā)病情況，因此分別采集樣地內全株無病斑赤松的針葉CC1(P1、Q1、R1)與染病赤松上無病斑針葉CC2(P2、Q2、R2)、染病較輕針葉CC3(病斑長度為針葉長度1/2以下,P3、Q3、R3)、染病較重針葉CC4(病斑長度為針葉長度1/2以上，P4、Q4、R4)。采用五點采樣法采集樣本，沖洗晾干后用75%乙醇浸泡1 min，無菌水沖洗3次，0.5%次氯酸鈉溶液浸泡2 min后，再用無菌水沖洗3次，-20°C條件下保存(劉學周等, 2015)。將沖洗后的無菌水稀釋至PDA培養(yǎng)基上，置于適宜條件下進行培養(yǎng)，經7天觀察后，培養(yǎng)基內無真菌生長，證實針葉樣本表面已無殘留真菌。

1.3 真菌多樣性測定

利用CTAB法對樣本DNA進行抽提，完成基因組DNA抽提后，利用1%瓊脂糖凝膠進行電泳檢測(Bullingtonetal., 2015)。將DNA樣品在冰上融化后，離心并充分混勻，Nanodrop檢測樣品質量，取30 ng進行PCR擴增。PCR擴增體系： DNA樣品，1.0 μL； Forward Primer(5.0 μmol·L-1)，1.0 μL； Reverse Primer(5.0 μmol·L-1)，1.0 μL； BSA(2.0 ng·μL-1)，3.0 μL； 2 × Taq Plus Master Mix，12.5 μL； ddH2O，6.5 μL。進行ITS擴增。ITS1區(qū)擴增引物序列為(5′-CTTGGTCATTTAG AGGAAGTAA-3’)和(5′-TGCGTTCTTCATCGAT GC-3′)。

PCR采用TransGen AP221-02： TransStart Fastpfu DNA Polymerase，將同一樣本的PCR產物混合后用2%瓊脂糖凝膠電泳檢測，使用AxyPrepDNA凝膠回收試劑盒(AXYGEN公司)切膠回收PCR產物，Tris-HCl洗脫，2%瓊脂糖電泳檢測。擴增產物采用Illumina Miseq PE300平臺，并構建Miseq文庫以及Miseq上機測序。

1.4 測序數據處理與分析

OTU(operational taxonomic units)是在系統(tǒng)發(fā)生學或群體遺傳學研究中為了便于進行分析，為某一個分類單元(品系、屬、種、分組等)設置的同一標志。用uclust(Version 1.2.22)按照97%相似性將全部序列聚類，去除singleton的OTU，并得到代表序列和OTU表。用usearch按照97%相似性序列進行OTU聚類(不含單序列)，得到代表序列再將其全部序列按照97%相似度比對到OTU上形成OTU列表(Caporasoetal., 2010)。使用Mothur軟件計算豐富度指數Chao1和多樣性指數Shannon(劉滿光等, 2018)。用FUNGuild數據庫解析赤松內生真菌的營養(yǎng)型類別，置信水平僅選用probable和highly probable的OTUs及其類別； 為避免擴大功能類別的指定，序列數小于3的OTUs將被刪除(Nguyenetal.， 2016)。使用R軟件(v2.15.3)繪制PCoA圖。測序數據已上傳NCBI，編號為SUB5584140。

2 結果與分析

2.1 操作分類單元(OTU)及其多樣性

測序結果顯示，在赤松純林CC的12個樣品中共獲得內生真菌有效序列405 240條，共計1 683個OTU。各樣品Coverage測序深度指數統(tǒng)計分析結果見表1，結果顯示采集針葉樣本中覆蓋率均接近于99%，稀釋曲線平緩(圖1)，說明各樣本中的真菌物種信息被充分檢測，結果能夠代表各類針葉中內生真菌的真實水平。

根據內生真菌OTU數目，對樣品中OTU組成進行分析，構建Venn圖(圖2)和群落結構柱狀圖(圖3, 4)。在赤松純林中不同染病程度的針葉中共有相同的OTU 223個，占OTU總數的13.25%，4類針葉中特有的OTU數目分別為273、169、202、96個，以CC1中特有OTU數目最多。

樣本內生真菌的Chao1指數和Shannon指數統(tǒng)計分析結果見表1，無病斑赤松針葉內生真菌的Chao1和Shannon指數最高，即測得OTU數與種類數均最高，其次分別為染病赤松上的無病斑針葉、病斑長度為針葉長度2/1以下的赤松針葉、病斑長度為針葉長度2/1以上的赤松針葉。結果表明，隨著病害侵染的加重，內生真菌豐富度及多樣性呈現出下降的趨勢。

表1 不同侵染級別的赤松針葉真菌豐度與多樣性Tab.1 Abundance and diversity of fungi in different level of disease in needles of P. densiflora

圖1 赤松樣品真菌OTU稀釋曲線Fig.1 OTU-based rarefaction curve of fungal communities in needles of P. densifloraCC1樣本包括P1、Q1、R1； CC2樣本包括P2、Q2、R2； CC3樣本包括P3、Q3、R3； CC4樣本包括P4、Q4、R4。 Samples of CC1 concludes P1, Q1, and R1; Samples of CC2 concludes P2, Q2, and R2; Samples of CC3 concludes P3, Q3, and R3; Samples of CC4 concludes P4, Q4, and R4.

圖2 不同感病級別赤松針葉OTU分類的Venn示意Fig.2 Venn diagram of OTU distribution of fungi in different level of disease in needles of P. densiflora

2.2 真菌物種優(yōu)勢類群組成

對1 683個OTU進行物種歸類，歸類為28個門、205個屬。在門水平上(圖3)，子囊菌門(Ascomycota)占比最高，分別達到94.35%、91.85%、91.29%、97.13%，其次為擔子菌門(Basidiomycota)，分別占比3.17%、5.68%、2.25%和1.29%，子囊菌門為針葉內生真菌中的優(yōu)勢菌門。在屬水平上(圖4)，無病斑針葉CC1相對豐度較高的屬有多臂菌屬(Trichomerium)(5.52%)、暗色球菌屬(Phaeococcomyces)(4.25%)、煤炱目的一屬(Lapidomyces)(4.03%)、枝孢屬(Cladosporium)(3.62%)、煤炱目的一屬(Capnobotryella)(2.85%)、小穴殼科的一屬(Hormonema)(2.31%)，而染病赤松上的無病斑針葉CC2相對豐度較高的屬有暗色球菌屬(5.63%)、小穴殼科的一屬(Hormonema)(4.87%)、外囊菌屬(Taphrina)(4.69%)、煤炱目的一屬(Lapidomyces)(4.55%)、鏈格孢屬(Alternaria)(3.84%)、多腔菌屬(Myriangium)(3.50%)、煤炱目的一屬(Capnobotryella)(3.23%)、枝孢屬(2.73%)。在染病較輕針葉CC3中，相對豐度較高的屬有星裂盤菌屬(Phacidium)(10.31%)、小穴殼科的一屬(Hormonema)(7.98%)、截盤多毛孢屬(Truncatella)(5.90%)、暗色球菌屬(5.89%)、鏈格孢屬(5.51%)、圓盤菌屬(Orbilia)(3.66%)、座囊菌科的一屬(Rhizosphaera)(3.22%)、煤炱目的一屬(Lapidomyces)(3.08%)。而染病較重針葉CC4中屬有薄盤菌屬(Cenangium)(39.70%)、鏈格孢屬(11.73%)、小穴殼科的一屬(Hormonema)(10.62%)、散斑殼屬(Lophodermium)(4.70%)、座囊菌科的一屬(Rhizosphaera)(2.20%)、截盤多毛孢屬(1.83%)、枝孢屬(1.58%)。

圖3 不同侵染級別下赤松針葉真菌門水平組成Fig.3 Dominant fungal phyla from fungi of different level of disease in needles of P. densiflora

圖4 不同感病級別赤松針葉真菌屬水平組成Fig.4 Dominant fungal genera from fungi of different level of disease in needles of P. densiflora

2.3 真菌Beta多樣性

基于主坐標分析樣品間多樣性差異，評估不同病級的赤松純林針葉內生真菌的差異性(圖5)，結果表明，第一主坐標PC1與第二主坐標PC2的貢獻率分別為33.90%和18.10%，二者累積貢獻率為52.00%。無病斑針葉CC1和CC2相聚較近，而發(fā)病較輕的CC3和較重的CC4相聚較近，表明在枯梢病侵染的情況下，內生真菌群落結構發(fā)生改變，無病斑針葉與染病針葉內生真菌群落構成差異明顯。

圖5 赤松針葉內生真菌主坐標分析Fig.5 Principal coordinates analysis of fungi in the needles of P. densiflora

2.4 真菌營養(yǎng)型類群

在FUNGuild的分析中，除去未歸類的OTU，共有725個OTU在數據庫中成功注釋了營養(yǎng)型功能信息。在共生營養(yǎng)型的占比上，無病斑針葉CC1中最高(19.76%)，顯著高于其他3種針葉(均低于10%)，病理營養(yǎng)型的分布以染病植株上的無病斑針葉CC2(26.37%)與染病較輕的針葉CC3(39.93%)較高，而腐生營養(yǎng)型的占比上，4種針葉內的占比均較高(依次為42.50%、38.00%、37.15%和65.87%)，其中染病較重的針葉CC4最高。真菌群落主要由單一營養(yǎng)型構成，兼顧2種或3種營養(yǎng)型的菌類在4種針葉中占比均較低。

圖6 赤松針葉內生真菌群落營養(yǎng)型比較Fig.6 Trophic composition of fungal communities in the needles of P. densiflora

3 討論

通過高通量測序技術，對純林內的赤松針葉內生真菌多樣性與群落結構進行分析可知，針葉內的真菌多樣性豐富，無病斑針葉與染病針葉優(yōu)勢門為子囊菌門和擔子菌門，無病斑針葉與染病針葉多樣性、群落結構等方面均存在差異。

松枯梢病是針葉樹上最常見和分布最廣的重要病害之一。國內對松枯梢病的研究在病原菌的多樣性、生物學特征等方面均有較大的進展(劉秀嶶等, 2012; 陳潔等, 2019)，此外，近年來通過拮抗菌對病害的控制也取得了較多的成果(蔣萍等, 2007; 王鳳各等, 2016)，這些證實了可通過對寄主植物的微生物調控達到防控枯梢病暴發(fā)的目的。在其他植物內生微生物的研究中，無病斑植物組織中的內生真菌群落更加穩(wěn)定，而穩(wěn)定的群落結構可抑制病原菌的入侵及繁衍。張麗娜等(2011)通過PDA平板培養(yǎng)法比較不同季節(jié)內的無病斑山茶(Camelliapitardii)及感病山茶葉片內生真菌群落的差異，發(fā)現無病斑葉片的內生真菌數量、多樣性、均勻度高于染病葉片，證實染病程度顯著影響山茶葉內生真菌多樣性。另有研究表明，2個品種染病后的內生真菌變化趨勢也不同，高抗品種內生真菌多樣性逐漸減少，而高感品種多樣性呈現上升的趨勢(白維曉等, 2019)。有研究對漆樹(Toxicodendronvernicifluum)感染潰瘍病的枝干部內生真菌進行培養(yǎng)，比對不同染病情況、不同部位的真菌多樣性結果表明，無病斑枝干的內生真菌多樣性顯著高于受損傷組織，潰瘍病菌的侵染對內生真菌群落結構的影響顯著(Takemotoetal., 2014)。

本研究中，內生真菌在無病斑針葉中表現為較高的多樣性，高于染病針葉，這與先前的研究結論一致。染病較重的針葉中多樣性指數顯著下降，是因為在針葉的防御體系被破壞后，單一菌種的腐生營養(yǎng)型真菌相對豐度較高的原因。在病原菌入侵植物組織時，寄主植物的防御機制被破壞，內部平衡被打破，其他病原微生物以及腐生微生物更容易進入植物組織內(Steinruckenetal., 2016)。在無病斑棉花(Gossypiumhirsutum)和黃萎病侵染后的棉花根部的內生真菌研究中，黃萎病侵染后的棉花根部內生真菌多樣性等指標也均高于無病斑植株根部，證實病原菌的侵染提高了棉花內部微生物的多樣性，并影響其群落結構(劉政等, 2016)。

松屬樹種的針葉內生微生物分析大都通過純培養(yǎng)法進行研究，對樟子松(Pinussylvestrisvar.mongolica)、紅松(Pinuskoraiensis)等樹種的內生真菌或內生細菌進行分離培養(yǎng)，初步證實了松針葉內生微生物的多樣性及其中對內生微生物多樣性的影響因素，如針葉葉齡(王立祥等, 2016)。在赤松內生真菌研究中(Eoetal., 2018)，分離獲得了松生莖點霉菌(Sydowiapolyspora)、勃肯肉齒菌(Sistotremabrinkmannii)、殼針孢屬一種菌(Septoriapini-thunbergii)、春孔菌屬(Earliellasp.)和散斑殼屬菌(Lophodermiumspp.)等多株優(yōu)勢菌株。隨著對內生微生物認識的不斷提高以及研究水平的提升，第二代測序技術已經常用于微生物多樣性的研究中。Bullington等(2015)對針葉樹種內生真菌多樣性進行了研究，對山白松(Pinusmonticola)針葉進行接種，并通過新一代高通量測序手段對其中的內生真菌多樣性和群落結構的變化進行測定，研究內生真菌相互間的種間競爭、共生模式等，證實了接種真菌與潛在病原菌的相互競爭。本研究結果得到內生真菌的優(yōu)勢菌門為子囊菌門。子囊菌門和擔子菌門均為常見植物內生真菌(黃彩微等, 2018)，與先前赤松純培養(yǎng)內生真菌研究(Eoetal., 2018)結論一致。

在無病斑植株的針葉與染病植株上的無病斑針葉的內生真菌群落結構進行對比，發(fā)現在染病植株的無病斑針葉群落結構已發(fā)生了變化。而在染病較重的針葉中的真菌群落組成中，薄盤菌屬為常見的松類病害病原菌，該屬被證實與枯梢病病原菌的侵染具有緊密的聯系(Luchietal., 2014)。本研究通過群落營養(yǎng)型分析揭示了該種變化，共生型營養(yǎng)菌占比下降，而病理營養(yǎng)型占比增高，其潛伏侵染病原菌的發(fā)病率增高。除染病較輕的針葉中病理營養(yǎng)型pathotroph高于腐生營養(yǎng)型，在無病斑與染病針葉中，腐生營養(yǎng)型saprotroph均占有較高的比例，這與無病斑煙草的內生真菌結構一致(李朋發(fā)等, 2019)。病理營養(yǎng)型真菌通過傷害寄主細胞來獲取自身所需的營養(yǎng)物質，而腐生營養(yǎng)型真菌通過分解死亡的寄主細胞來獲取營養(yǎng)物質(Tedersooetal., 2014)。本研究中，染病較輕針葉中的病理營養(yǎng)型真菌占比增高，說明此時針葉中存在較高的致病菌，破壞針葉組織結構，可導致其他類真菌可對針葉進行多重侵染。

4 結論

在赤松純林中，赤松針葉內生真菌的多樣性及群落結構組成受到枯梢病侵染的影響，多樣性及豐度均呈下降趨勢。無病斑針葉中內生真菌的優(yōu)勢菌屬為多臂菌屬和暗色球菌屬，在染病后群落結構發(fā)生改變，無病斑針葉與染病針葉內生真菌群落結構差異顯著。腐生營養(yǎng)型真菌在針葉中豐度均較高，共生營養(yǎng)型真菌僅在無病斑植株的針葉上占一定比例，而在染病較輕針葉中病理營養(yǎng)型真菌為主要真菌。