李浩，于華杰，李勝,,4，韓露，沈陽洋△

(1.山東省藥物研究院，濟(jì)南 250062；2.山東省腫瘤防治研究院，濟(jì)南 250117；3.濟(jì)南大學(xué)醫(yī)學(xué)與生命科學(xué)學(xué)院，濟(jì)南 250220；4.山東省醫(yī)學(xué)科學(xué)院，濟(jì)南 250062)

1 引 言

隨著發(fā)病率和死亡率持續(xù)上升，在我國，癌癥已經(jīng)成為最主要的疾病死亡原因[1]。研究表明早期診斷和早期治療與癌癥預(yù)后密切相關(guān)[2]。多數(shù)癌癥的早期臨床癥狀不明顯，確診困難[3]?，F(xiàn)行的病理學(xué)診斷方法很難檢測早期癌癥的細(xì)胞變化，因此，尋找針對(duì)早期癌癥方便、快捷、準(zhǔn)確率高的診斷方法具有重大意義[4-5]。

拉曼光譜技術(shù)是利用拉曼散射效應(yīng)，對(duì)散射光譜進(jìn)行分析得到分子振動(dòng)、轉(zhuǎn)動(dòng)方面的信息，并對(duì)物質(zhì)的分子結(jié)構(gòu)進(jìn)行分析識(shí)別的技術(shù)[5]。拉曼光譜技術(shù)通過使用一定頻率的激光照射物質(zhì)表面，散射出較低頻率的光線，在利用計(jì)算機(jī)檢測反射的光線信號(hào)來反映分子水平上的生物化學(xué)變化，鑒別各類物質(zhì)[6]。拉曼光譜技術(shù)的這一特性使得它廣泛應(yīng)用于化學(xué)、物理學(xué)、生物學(xué)和食品等諸多領(lǐng)域，在醫(yī)學(xué)診斷上的價(jià)值也日益重要[7-11]。

人體是由蛋白質(zhì)、核酸等生物大分子組成，不同的生物大分子都有其特征的拉曼光譜[7]。當(dāng)組織或細(xì)胞發(fā)生癌變時(shí)，其內(nèi)部的生物分子均有可能出現(xiàn)變化[8]。這些特征變化一般不會(huì)表現(xiàn)為臨床癥狀，在常規(guī)檢查中也難以辨別出來，而拉曼光譜可以檢測出分子水平的微小變化，且具有高精度化、高制動(dòng)化、無需染色或標(biāo)記等優(yōu)點(diǎn)，對(duì)早期癌癥的診斷具有幫助。經(jīng)過多年拉曼光譜技術(shù)的研究完善，逐步發(fā)展為可以對(duì)不同形態(tài)的腫瘤組織、細(xì)胞、蛋白質(zhì)、核酸等樣本進(jìn)行檢測分析，在早期腫瘤診斷中運(yùn)用越來越廣泛[12]。綜上所述，拉曼光譜技術(shù)可以成為癌癥的病理學(xué)診斷依據(jù)和癌癥早期診斷的途徑之一[5]。

瑞氏-姬姆薩(Wright-Giemsa)染色是一種臨床檢驗(yàn)工作中常用的染色方法，瑞氏-姬姆薩染液是將瑞氏染液和姬姆薩染液結(jié)合使用，能更好的染色細(xì)胞質(zhì)顆粒、細(xì)胞核和染色質(zhì)等細(xì)胞結(jié)構(gòu)[13]。

本研究運(yùn)用顯微共聚焦拉曼光譜儀，在532 nm波長激光下檢測了瑞氏-姬姆薩染色的腫瘤細(xì)胞和正常細(xì)胞，通過統(tǒng)計(jì)拉曼特征峰的變化來驗(yàn)證顯微共聚焦拉曼光譜儀是否能用于區(qū)分經(jīng)瑞氏-姬姆薩染色后的腫瘤細(xì)胞與正常細(xì)胞。

2 實(shí)驗(yàn)材料與方法

2.1 實(shí)驗(yàn)材料及儀器

實(shí)驗(yàn)材料及儀器見表1。

2.2 實(shí)驗(yàn)步驟

實(shí)驗(yàn)步驟如下：

(1)顯微共聚焦拉曼光譜儀進(jìn)行質(zhì)檢后使用，將激光光斑聚集調(diào)節(jié)至視野正中心；

(2)使用硅片糾正偏差，在50倍物鏡下觀察，收集在532 nm激光波長下500～2 000 cm-1的拉曼光譜信號(hào)；

(3)分別檢測經(jīng)處理的淋巴細(xì)胞、肝細(xì)胞、骨肉瘤細(xì)胞、胃癌細(xì)胞、肝癌細(xì)胞、鼻咽癌細(xì)胞和瑞氏吉姆薩染料玻片，對(duì)各樣本的拉曼光譜特征峰進(jìn)行對(duì)比；

(4)在每張玻片中隨機(jī)選取3個(gè)視野，每個(gè)視野隨機(jī)選取正常細(xì)胞和腫瘤細(xì)胞各1個(gè)，對(duì)每個(gè)細(xì)胞進(jìn)行3次掃描，取3次掃描結(jié)果的平均拉曼光譜值[14]。

表1 實(shí)驗(yàn)材料及儀器

3 結(jié)果

本研究在用顯微共聚焦拉曼光譜儀532 nm波長激光下檢測經(jīng)瑞氏-姬姆薩染色后的淋巴細(xì)胞、肝細(xì)胞(見圖1)、骨肉瘤細(xì)胞(見圖2)、肝癌細(xì)胞(見圖3)、胃癌細(xì)胞(見圖4)和鼻咽癌細(xì)胞(見圖5)，檢測結(jié)果見表2。

圖1 肝細(xì)胞及旁淋巴細(xì)胞(×500)Fig.1 Hepatocytes and para-lymphocytes(×500)

圖2 骨肉瘤細(xì)胞(×500)

圖3 肝癌細(xì)胞(×500) Fig.3 Liver cancer cells(×500)

圖4 胃癌細(xì)胞(×500)

圖5 鼻咽癌細(xì)胞(×500)

表2 瑞氏-姬姆薩染色樣本拉曼光譜峰位峰強(qiáng)統(tǒng)計(jì)表

峰值區(qū)間鼻咽癌肝癌胃癌骨肉瘤肝細(xì)胞鼻咽癌旁淋巴肝癌旁淋巴胃癌旁淋巴骨肉瘤旁淋巴染色劑1271 ～12751274 1273 1273 1272 1273 127412731274 12741271407319952500253548001445842463845924741309～13161313 1312131313091312 131313111314 1313130912395916062201536211484143315004181351～13581355 1354 1356 1355 1355 135613521356 1355135622051084134514063117472732263828641421414～14201418 142014161416 1417 14151411417 14171419163942074410362100419520172716637131470～14811473 1474147714741472 147014761472 1473147814295567753951519526388146016563071500～15051504 1504 1503 1504 1504 15031504 1505 15041504 816538814315539310420237527888872882319161620～16241621 1621 1621 1621 1621 16201620 1621 1621 1622 12037500666738842156863030283613136128493084

由于瑞氏-姬姆薩染色較淺，對(duì)照組除經(jīng)顯微共聚焦拉曼光譜儀532 nm波長激光下在1 620～1 624 cm-1、1 500～1 505 cm-1、708～713 cm-1、640～643 cm-1四處位置拉曼特征峰顯示峰強(qiáng)較高外，其余特征峰位峰強(qiáng)均顯示較低，見圖6。

注: 由上往下分別為鼻咽癌細(xì)胞、肝癌細(xì)胞、骨肉瘤細(xì)胞、胃癌細(xì)胞、肝細(xì)胞、淋巴細(xì)胞、迪夫染料、瑞氏-姬姆薩染料

圖6 本研究各種細(xì)胞的拉曼光譜圖

Fig.6 Raman spectra of experimental cells

4 結(jié)論

本研究利用拉曼光譜技術(shù)測量了經(jīng)瑞氏-姬姆薩染色的正常細(xì)胞和6種腫瘤細(xì)胞及瑞氏-姬姆薩染料，拍攝了拉曼光譜激光下各種腫瘤細(xì)胞圖像，對(duì)比其拉曼信號(hào)峰值，發(fā)現(xiàn)各種腫瘤細(xì)胞的拉曼光譜峰值和瑞氏-姬姆薩染色料的拉曼信號(hào)峰值相同。對(duì)光譜進(jìn)行分析后發(fā)現(xiàn)，檢測到的結(jié)果均為染料的拉曼信號(hào)，而6種腫瘤細(xì)胞的拉曼信號(hào)較弱，無法檢出。由上述結(jié)果分析得出，受瑞氏-姬姆薩染色劑的拉曼信號(hào)影響，無法明確檢測出腫瘤細(xì)胞的拉曼信號(hào)，也無法通過檢測的拉曼信號(hào)對(duì)正常細(xì)胞和腫瘤細(xì)胞進(jìn)行準(zhǔn)確的鑒別。

致謝

本次實(shí)驗(yàn)所用顯微共聚焦拉曼光譜儀及其操作方法由山東省農(nóng)業(yè)科學(xué)院秦宏偉提供，在此表示真摯的感謝。