施寒清 石芳 何奇 王哲 梁正峰

東北石油大學提高油氣采收率教育部重點實驗室 黑龍江 大慶 163318

生物采油技術(shù)已經(jīng)研究了幾十年，微生物單井吞吐技術(shù)已經(jīng)趨于成熟，在國內(nèi)外都有應(yīng)用。目前在勝利、大慶、吉林等油田作業(yè)成功率在70%以上，在管線清防蠟、油水井解堵、抑制硫酸鹽還原菌和提高原油采收率方面取得了良好效果［1-3］。在提高原油采收率方面，微生物驅(qū)按區(qū)塊作業(yè)，具有大面積應(yīng)用的潛力，但是從目前發(fā)表文獻來看微生物驅(qū)礦場試驗的效果總體不佳，提高采收率在0.13%到5%，還處于探索階段［1-2］。

實驗室從1994 年開始研究微生物采油，多年來也進行了一些有關(guān)微生物驅(qū)的研究，但也未突破低效的結(jié)果［4］。微生物驅(qū)主要靠產(chǎn)物或微生物的生長繁殖直接作用于原油，以提高原油地下流動性和水攜帶性使原油被采出。根據(jù)菌種提高采收率的原理，采用的方式和工藝流程會有所不同，而工藝流程和發(fā)酵過程的長短肯定會影響采油效果［1-2,5-7］。生物表面活性劑目前油田應(yīng)用較多的是糖脂和脂肽類，是微生物的發(fā)酵產(chǎn)物，已有半提純產(chǎn)品銷售，應(yīng)用時就可以如化學表面活性劑般應(yīng)用，單獨使用生物表面活性劑的油水界面張力一般只能達到10?1mN/m［8-9］。由于微生物在發(fā)酵過程中除了生物表面活性劑還會產(chǎn)生其它物質(zhì)，且微生物有的可以產(chǎn)生降解原油成分的物質(zhì)，采用注微生物發(fā)酵液及培養(yǎng)基技術(shù)，省去了提純工藝，也可以大幅度降低成本［1-4, 10-11］。

實驗室一直從事地下發(fā)酵微生物驅(qū)研究，在大慶油田礦場試驗的結(jié)果為提高采收率2～3%，室內(nèi)30 cm 方巖心驅(qū)油提高采收率在2～5%左右。從生物學代謝規(guī)律的角度，影響菌種的代謝和活躍能力的因素很多，培養(yǎng)時間的長短也會影響有效代謝產(chǎn)物的產(chǎn)生和積累，現(xiàn)場作業(yè)的菌種發(fā)酵液很多情況下已經(jīng)發(fā)酵后放置很長時間，部分學者認為微生物沒死，只要達到菌數(shù)108個/mL 就行。筆者研究了產(chǎn)表面活性劑菌種Bsw(自命名菌株，選于大慶油田)的代謝規(guī)律，認為以前的工藝流程可能與該菌種代謝規(guī)律存在不一致性，影響了驅(qū)油效果。因此進行了產(chǎn)表面活性劑微生物驅(qū)工藝設(shè)計和提高采收率效果研究。

1 實驗材料和方法

1.1 材料

Bsw 菌種及其發(fā)酵液、30 cm 方巖心、立式恒溫培養(yǎng)箱、模擬油、模擬地層水、油藏物理模擬驅(qū)替裝置、光學正置顯微鏡及攝像系統(tǒng)、超凈工作臺、紫外殺菌裝置、微量移液器；模擬油用大慶油田采油5 廠某聯(lián)合站脫氣原油配成在42 ℃黏度值為12 mPa · s的模擬油。

1.2 菌種生長培養(yǎng)基和菌種發(fā)酵培養(yǎng)

菌種：Bsw；培養(yǎng)基：葡萄糖硝酸鹽培養(yǎng)基；葡萄糖：2.0 g；玉米漿：0.8 g；NaNO3：0.2 g；Na2HPO4· 12H2O：0.1 g；KH2PO4：0.05 g；MgSO4· 7H2O：0.05 g；CaCl2(無水)：0.005 g；水:100 mL；pH:7.0～7.2；116 ℃濕熱滅菌20 min。

1.3 方法和步驟

(1)菌種鑒定：16SrDNA 鑒定步驟，克隆rDNA序列，連質(zhì)粒，測序，NCBI 比對［12］。

(2)細菌形態(tài)染色觀察：草酸銨結(jié)晶紫單染，100×物鏡觀察并拍照。

(3)菌種培養(yǎng)表面活性劑合成和積累規(guī)律。在500 mL 三角瓶中裝200 mL 培養(yǎng)基, 接入200 μL 的20%甘油保存的菌種先置于39 ℃培養(yǎng)24 h, 然后將溫度調(diào)至42 ℃培養(yǎng)，每間隔24 h 觀察一次泡沫產(chǎn)生情況，如產(chǎn)生泡沫與空白培養(yǎng)基為對照，靜置30 min 觀察泡沫的穩(wěn)定性及泡沫形態(tài)并拍照, 然后置搖床中繼續(xù)培養(yǎng)。連續(xù)觀察7～15 d 每次觀察時取樣1 mL 于1.5 mL 離心管中4 ℃保存。生物量的變化：將1.5 mL 離心管保存的樣品用12 000 rpm離心5 min 對比沉淀體積判斷。

(4)驅(qū)油方案：油藏溫度42 ℃，水驅(qū)注入速度、微生物段塞注入速度: 0.1 mL/min(相當于現(xiàn)場每天前進1 m)。

(5)菌種地下發(fā)酵工藝流程。取凍存菌種25 μL接種于含7 mL 培養(yǎng)基的試管中39 ℃好氧培養(yǎng)18 h，然后置室溫存放。從中取200 μL 發(fā)酵液接種于含200 mL 培養(yǎng)基的三角瓶中42 ℃好氧培養(yǎng)22 h，此時菌液含菌數(shù)應(yīng)為108cell/mL, 然后取11 mL(接種量為總液量的1/20)接于200 mL 培養(yǎng)基中，在搖床上42 ℃搖30 min 以上，發(fā)酵液作驅(qū)油的微生物段塞。驅(qū)油實驗步驟：巖心飽和水-飽和油-水驅(qū)至含水率98%- 0.34 PV 發(fā)酵液段塞-關(guān)井15 d-水驅(qū)至含水率98%。

(6)地上好氧發(fā)酵注驅(qū)工藝流程。取200 μL 甘油凍存發(fā)酵液接種于含200 mL 培養(yǎng)基的三角瓶中39 ℃好氧培養(yǎng)15 d，此時菌液中已充分積累了鼠李糖脂等產(chǎn)物。然后取出40 mL 發(fā)酵液保存于4 ℃冰箱做理化測定用，補入40 mL 新培養(yǎng)基(總液量的1/5)置39 ℃好氧培養(yǎng)6 h，復壯發(fā)酵液中的菌體，該發(fā)酵液作驅(qū)油的微生物段塞。驅(qū)油實驗步驟：巖心飽和水-飽和油-水驅(qū)至含水率98%-0.34 PV 發(fā)酵液段塞-關(guān)井3 d-水驅(qū)至含水率98%。

(7)表面張力的測定：白金吊片法，Kino 自動表面張力測定儀。面張力的測定：Kino TX500D 旋轉(zhuǎn)滴自動界面張力測定儀。

2 結(jié)果與分析

實驗所用菌種，篩選自上世紀九十年代大慶油田油井的采出液，菌種用科學方法保存至今，在1 000 倍光學顯微鏡下菌體形態(tài)如圖1 所示。結(jié)晶紫單染為桿菌，經(jīng)rDNA 測序，在NCBI 比對鑒定為銅綠假單胞菌(Pseudomonas aeruginosa)，表面活性物質(zhì)主要為鼠李糖脂，該菌可以好氧和厭氧生長，都能產(chǎn)生生物表面活性劑。我們對好氧和厭氧條件下的發(fā)酵液的表面張力進行了測定，結(jié)果如圖2 所示。其中，15 d(原)：研究表面活性劑合成代謝規(guī)律的終培養(yǎng)液(好氧培養(yǎng))；培養(yǎng)基：好氣三角瓶中的滅菌培養(yǎng)基；好氧：厭氧培養(yǎng)的菌種接好氧瓶培養(yǎng)7 d的培養(yǎng)液；厭氧：菌種接厭氧瓶培養(yǎng)15 d；厭氧去菌：厭氧發(fā)酵液離心除去菌體；測量溫度為25 ℃。

圖1 菌種結(jié)晶紫染色光學顯微鏡形態(tài)Fig. 1 Strain’s morphology after crystal violet staining under optical microscope

圖2 不同培養(yǎng)條件發(fā)酵液表面張力值的比較Fig. 2 Surface tension comparison between fermentation liquors under different culture conditions

圖中的結(jié)果顯示好氧培養(yǎng)7 d、15 d，厭氧培養(yǎng)15 d 的發(fā)酵液表面張力值都在23 到29 mN/m 之間，和培養(yǎng)基的表面張力50 mN/m 相比有明顯下降，說明都產(chǎn)生了表面活性劑。因此好氧和厭氧發(fā)酵工藝都可以用于生物采油。

為了弄清菌種的表面活性劑的合成和積累規(guī)律，進行了表面活性劑合成積累與發(fā)酵培養(yǎng)時間的關(guān)系研究。由于生物表面活性劑具有發(fā)泡功能，因此實驗用穩(wěn)定泡沫的多少來間接反映表面活性物質(zhì)的積累情況。如圖3 所示，培養(yǎng)4 d 和7 d 都可產(chǎn)生穩(wěn)定的泡沫，而7 d 明顯泡沫比4 d 的多，說明培養(yǎng)時間延長，三角瓶中表面活性劑是在積累，由于在現(xiàn)場礦場試驗一般微生物注入后關(guān)井7 d，因此又進行了好氧培養(yǎng)發(fā)酵液的菌數(shù)變化實驗，實驗結(jié)果如圖4 所示。由圖中可以看到，從培養(yǎng)24 h 到7 d，培養(yǎng)液中的菌數(shù)按離心后體積看，沒有明顯變化，說明菌數(shù)在24 h 達到峰值后，處于相對穩(wěn)定的狀態(tài)。由于中間沒有補充營養(yǎng)，因此在中后期菌體應(yīng)處于休止期。由于在7 d 的這輪實驗中觀察到表面活性劑泡沫是從3 d 開始產(chǎn)生，且隨培養(yǎng)時間增加而增加，因此認為該菌種生物表面活性劑的產(chǎn)生屬野生型，受營養(yǎng)消耗調(diào)控，應(yīng)符合Das 等的文獻對鼠李糖脂表達調(diào)控模式的報道。由于表面活性劑隨培養(yǎng)時間積累而產(chǎn)生變化，因此進行了好氧培養(yǎng)15 d 的表面活性劑合成積累規(guī)律實驗，結(jié)果如圖5 所示。在前7 d，穩(wěn)定的泡沫是在3 d 開始明顯増多，隨培養(yǎng)時間的延長發(fā)泡能力増強，從8 d 開始雖然有些樣品泡沫減少，但是11 d，14 d 等樣品的泡沫顯示近似7 d或有增強，因此延長培養(yǎng)時間可以積累更多的表面活性劑。

圖3 好氧培養(yǎng)時長與表面活性劑積累的關(guān)系Fig. 3 Relationship between aerobiotic culture time and surfactant accumulation

圖4 不同好氧培養(yǎng)時間細菌菌數(shù)的變化(培養(yǎng)溫度38 ℃)Fig. 4 Variation of the number of bacteria with the aerobiotic culture time (culture temperature 38 ℃)

圖5 穩(wěn)定泡沫量和培養(yǎng)時間的關(guān)系(液體體積0.9 mL，搖起泡后靜置30 min 拍照)Fig. 5 Relationship between the volume of stable foam and the culture time (liquid volume: 0.9 mL, taking photos after it is foamed and then rested for 30 min)

根據(jù)上述研究結(jié)果，Bsw 菌株的表面活性物質(zhì)合成和積累有隨發(fā)酵培養(yǎng)時間延長產(chǎn)物增加的特點，考慮到地層是厭氧環(huán)境，厭氧代謝應(yīng)該比好氧發(fā)酵明顯緩慢。這是由于以前現(xiàn)場礦場注入該菌種關(guān)井7 d，合成的表面活性劑較少，影響了采收率的提高。因此在以前的工藝基礎(chǔ)上延長了關(guān)井時間，將關(guān)井時間由7 d 延長至15 d。物理模擬裝置如圖6所示，巖心參數(shù)如表1 所示。

圖6 驅(qū)油巖心及連接設(shè)備Fig. 6 Oil displacement core and connection equipment

表1 各巖心參數(shù)Table 1 Core parameters

室內(nèi)實驗結(jié)果如圖7，圖8，表2 所示。每塊巖心的驅(qū)油曲線圖分3 個時期，第一段為水驅(qū)到產(chǎn)出液含水率98%，第二段為微生物驅(qū)的菌液或培養(yǎng)基段塞注入階段，第三段為關(guān)井后水驅(qū)到產(chǎn)出液含水率98%。由于該菌株也可以利用原油生長繁殖，因此對原油也有降解作用，提高采收率值應(yīng)是表面活性劑和原油降解綜合作用的結(jié)果，生物段塞為空白培養(yǎng)基的巖心為空白對照組(圖7)。注培養(yǎng)基時出了一些油，計算提高采收率為0.54%，可以認為是實驗誤差，因此可以認為注空白培養(yǎng)基基本無提高采收率效果。本次實驗注培養(yǎng)22 h 的菌種發(fā)酵液，進行地下發(fā)酵15 d 的工藝，開井水驅(qū)后出了一些油，但是提高采收率為2.83%(圖8，表2)，這與以前實驗室和礦場試驗的結(jié)果相近，因此延長地下發(fā)酵培養(yǎng)時間沒有產(chǎn)生明顯改善。

圖7 地下發(fā)酵空白培養(yǎng)基的注入方案驅(qū)油過程曲線Fig. 7 Injection plan and oil displacement process of underground-fermentation blank culture medium

圖8 地下發(fā)酵15 d 的注入方案驅(qū)油過程曲線Fig. 8 Injection plan and oil displacement process of 15 d underground fermentation

表2 各巖心驅(qū)油的采收率和提高采收率Table 2 Recovery factor and EOR of each oil displacement core

實驗結(jié)果并不理想，經(jīng)綜合分析，原因可能是厭氧發(fā)酵產(chǎn)生的表面活性物質(zhì)較少所致，因為商業(yè)生產(chǎn)的鼠李糖脂是由銅綠假單胞菌好氧發(fā)酵生產(chǎn)的，菌株Bsw 也可以好氧發(fā)酵產(chǎn)生生物表面活性劑，而且有隨培養(yǎng)時間增加積累的特點，據(jù)此從新設(shè)計了采油生產(chǎn)注入工藝，讓發(fā)酵液在地面好氧發(fā)酵充分積累表面活性劑，然后使休止細胞活化后再注入地層厭氧發(fā)酵。菌種在三角瓶中好氧發(fā)酵15 d 后，加入五分之一體積的新培養(yǎng)基，好氧培養(yǎng)6 h，細胞恢復活化狀態(tài)，然后將發(fā)酵液注入地層，厭氧發(fā)酵3 d。實驗結(jié)果如圖9, 圖10 所示。在1 000 倍光學顯微鏡下，圖9 中a 圖顯示好氧培養(yǎng)15 d 后菌種細胞形態(tài)為休止狀態(tài)，b 圖顯示加入新培養(yǎng)基培養(yǎng)6 h 菌種細胞形態(tài)轉(zhuǎn)變?yōu)榛罨癄顟B(tài)。這也說明，在長期產(chǎn)物積累和營養(yǎng)耗盡時，細胞還活著。在新工藝中，核心改變是將積累有效產(chǎn)物的過程放在地面發(fā)酵罐(實驗室三角瓶)好氧發(fā)酵完成，好氧發(fā)酵時細胞的合成代謝要比厭氧發(fā)酵快很多，因此產(chǎn)物積累充分。注入前將發(fā)酵液加入新培養(yǎng)基活化培養(yǎng)6 h 的目的是使細胞恢復旺盛生長狀態(tài)，以利于菌種在地下厭氧發(fā)酵，發(fā)揮細胞降解原油等方面的能力。由表2 和圖10 的結(jié)果顯示，采用新工藝的驅(qū)油實驗取得了提高采收率15.63%的效果。由于30 cm 方巖心可以指導現(xiàn)場生產(chǎn)，按實際施工提高采收率折半計算還有7%到8%的提高采收率，因此該結(jié)果應(yīng)是有明顯生產(chǎn)意義的。有參考文獻報道，將2 種產(chǎn)生不同生物表面活性劑菌(一種產(chǎn)脂肽，一種產(chǎn)糖脂)混合注入地下，他們的室內(nèi)實驗表明提高采收率17.38%，但是注入的生物段塞為1 PV。從現(xiàn)場施工角度考慮，段塞有些大，工藝設(shè)計中采用0.34 PV 的生物段塞比較符合大慶等油田的化學驅(qū)段塞大小，實驗中用單一菌種也取得了可觀的效果，因此可以認為工藝的改變確實可以取得明顯的生產(chǎn)效果。

圖9 好氧培養(yǎng)15 d 培養(yǎng)液和15 d 的培養(yǎng)液活化培養(yǎng)6 h 的菌體形態(tài)對比Fig. 9 Morphological comparison between the strain in culture solution for 15 d aerobiotic culture and that in 15 d culture solution for 6 h activated culture

圖10 地面發(fā)酵15 d 后活化6 h 菌液注入方案驅(qū)油過程曲線Fig. 10 Injection plan and oil displacement process of the bacteria solution after 15 d ground fermentation and then 6 h activation

菌株Bsw 具有降解原油的能力，以前做過以原油為碳源好氧和厭氧發(fā)酵的工作，從本輪實驗，2 種工藝驅(qū)油的效果來看，在地下發(fā)酵15 d 應(yīng)比發(fā)酵3 d 對原油的降解作用更強，但是2 種工藝的提高采收率效果明顯不同，新工藝效果明顯，這也顯示菌株地下發(fā)酵的原油降解能力對提高采收率貢獻很小，有效產(chǎn)物的地面充分積累是取得明顯效果的關(guān)鍵因素。

為了探索改變工藝能明顯提高采收率的原因，進行了注入前的發(fā)酵液(留樣)對目標油藏原油的界面張力進行了測定。結(jié)果顯示，在油藏溫度下，油水界面張力為0.27 mN/m。雖然生物表面活性劑的發(fā)酵液，沒有象化學表面活性劑達到0.01 mN/m，但是由于微生物發(fā)酵液是復雜液體，因此能取得較好的提高采收率效果。

3 結(jié)論

(1) 產(chǎn)鼠李糖脂的菌株Bsw 可以地下厭氧發(fā)酵進行微生物驅(qū)，但是提高采收率不明顯，只有2.83%，延長關(guān)井時間至15 d 也沒有明顯改觀。

(2) 采用地面好氧發(fā)酵充分積累產(chǎn)物，然后活化菌株細胞注入地層再厭氧發(fā)酵的工藝，微生物驅(qū)提高采收率達到15.63%。

(3) 驅(qū)油實驗的結(jié)果表明，銅綠假單胞菌Bsw 好氧發(fā)酵比厭氧發(fā)酵能積累更多的表面活性物質(zhì)，改變生物采油生產(chǎn)工藝，可以有效改善微生物驅(qū)效果。