李永春　趙美榮　張智

摘 要：目的：建立測(cè)定椿皮中鐵屎米-6-酮含量的HPLC方法.方法：采用色譜柱Ultimate AQ-C18（250mm×4.6mm，5μm），流動(dòng)相為乙腈-0.1%乙酸（35：65），檢測(cè)波長254nm，流速1.0mL·min-1，柱溫30℃，進(jìn)樣量20μL.結(jié)果：鐵屎米-6-酮進(jìn)樣濃度在1.10～15.35μg·mL-1（r=0.9994）的范圍內(nèi)與峰面積線性關(guān)系良好，平均回收率（n=6）為99.66%，RSD值為1.38%.結(jié)論：建立的方法簡便可靠穩(wěn)定，為椿皮質(zhì)量的分析及評(píng)價(jià)提供參考.

關(guān)鍵詞：HPLC;臭椿;鐵屎米-6-酮;含量測(cè)定

中圖分類號(hào)：R927.2;O657.72? 文獻(xiàn)標(biāo)識(shí)碼：A? 文章編號(hào)：1673-260X（2020）03-0039-02

椿皮是苦木科臭椿屬植物臭椿（Ailanthus altissima （Mill.） Swingle）的干燥根皮或莖皮，又稱椿根皮，是我傳統(tǒng)的中藥材，具有清熱燥濕、止血消炎等功效，椿皮中含有苦木素、生物堿、甾醇、萜類等多種化學(xué)成分，其中生物堿作為主要活性成分之一，具有抗菌、抗病毒、抗腫瘤等生物活性，是近年來研究的重點(diǎn)，相對(duì)于其他植物，椿皮中的生物堿含量較低，目前研究主要集中在分離鑒定及生物活性等方面，而對(duì)于其定量測(cè)定研究還鮮見報(bào)道[1-4].為此，以椿皮中特征性生物堿成分鐵屎米-6-酮為測(cè)定指標(biāo)，探索利用HPLC的方法測(cè)定其在椿皮中的含量，以期為藥材椿皮的質(zhì)量控制及評(píng)價(jià)提供參考.

1 儀器與試劑

1.1 儀器

Autobalance AD6000型超微量天平;FL2200Ⅱ型高效液相色譜儀;SB-5200DNT型超聲波清洗機(jī);RE-52A型旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀;GWA-UN5-30型超純水器;Eppendorf微量移液器.

1.2 試劑

鐵屎米-6-酮對(duì)照品（批號(hào)20170312，購自寶雞市辰光生物有限公司，純度為98%）;乙腈為色譜純;冰乙酸為分析純;超純水自制.椿皮購于安徽亳州藥材市場(chǎng)（經(jīng)赤峰學(xué)院劉鐵志教授鑒定為植物臭椿的干燥莖皮）.

2 方法與結(jié)果

2.1 對(duì)照品溶液的制備

精密稱取鐵屎米-6-酮生物堿1.0963mg，以甲醇定容至5mL制成對(duì)照品溶液，4℃儲(chǔ)存?zhèn)溆?

2.2 供試溶液的制備

精密稱取過100目篩的椿皮粉末3.0000g，置于250mL的具塞錐形瓶中，加入100mL的無水甲醇后超聲提取1h，過濾，洗滌3次，將濾液及洗滌液進(jìn)行減壓濃縮，定容到50mL，得供試溶液.

2.3 色譜條件的確定

色譜條件：色譜柱：Ultimate AQ-C18（250mm×4.6mm，5μm）;流動(dòng)相：乙腈-0.1%乙酸（35：65）;檢測(cè)波長：254nm;流速：1.0mL·min-1;柱溫：30℃;進(jìn)樣量：20μL.

依次吸取對(duì)照品溶液、供試溶液在上述色譜條件下檢測(cè)，對(duì)照品及供試品HPLC圖見圖1.供試溶液中其他色譜峰對(duì)鐵屎米-6-酮色譜峰無干擾，理論塔板數(shù)21098，分離度1.739，拖尾因子0.977，與基線分離完全，符合含量測(cè)定的要求.因此，以下色譜檢測(cè)試驗(yàn)都按照上述色譜條件進(jìn)行.

2.4 線性關(guān)系考察

精密吸取對(duì)照品溶液，以甲醇配制成1.10～15.35μg·mL-1的系列濃度溶液，進(jìn)行色譜檢測(cè)，以峰面積Y與進(jìn)樣濃度X（μg·mL-1）進(jìn)行線性回歸，得回歸方程：Y=10026.516+70252.688X（r=0.9994）.表明鐵屎米-6-酮生物堿進(jìn)樣濃度在1.10～15.35μg/mL的范圍內(nèi)與峰面積線性關(guān)系良好.

2.5 精密度試驗(yàn)

利用對(duì)照品溶液進(jìn)行精密度試驗(yàn)，重復(fù)6次，記錄鐵屎米-6-酮每次的峰面積，計(jì)算RSD值，結(jié)果鐵屎米-6-酮的峰面積RSD值為0.65%，表明儀器的精密度較好.

2.6 重復(fù)性試驗(yàn)

精密稱取椿皮藥粉，按照“2.1”方法制備供試溶液，按照“2.3”項(xiàng)下條件進(jìn)樣6次，記錄鐵屎米-6-酮每次的峰面積，計(jì)算RSD值，結(jié)果鐵屎米-6-酮的峰面積RSD值為0.64%，表明該方法的重復(fù)性較好.

2.7 穩(wěn)定性試驗(yàn)

配制一份供試溶液，室溫放置，分別于0、2、4、8、12、24 h后進(jìn)行色譜分析，記錄鐵屎米-6-酮每次的峰面積，通過計(jì)算，得到RSD值為1.54%，說明供試溶液在24h內(nèi)穩(wěn)定.

2.8 加樣回收率試驗(yàn)

精密稱取6份椿皮藥粉，每份3.0000g，并加入一定量的鐵屎米-6-酮生物堿標(biāo)準(zhǔn)品，按“2.1”方法制備供試溶液，進(jìn)行色譜檢測(cè)，計(jì)算回收率（n=6），見表1.結(jié)果顯示鐵屎米-6-酮的平均回收率為99.66%，RSD值為1.38%.

2.9 樣品測(cè)定

精密稱取3個(gè)不同批次的椿皮樣品，按“2.1”方法制備供試溶液，進(jìn)行含量測(cè)定，結(jié)果顯示樣品中鐵屎米-6-酮生物堿含量在14.11～33.24μg·g-1之間，同批次樣品鐵屎米-6-酮生物堿含量較穩(wěn)定，不同批次間含量存在較大差異.

3 討論

通過全波長掃描，鐵屎米-6-酮生物堿在210nm處有末端吸收，在250nm附近也有最大吸收，為避免溶劑峰及雜峰的干擾，參照文獻(xiàn)[5]使用254nm作為其檢測(cè)波長.

采用文獻(xiàn)[6-7]乙腈-0.2%氨水溶液（22∶78）、乙腈-0.1%磷酸（35∶65）作為流動(dòng)相來測(cè)定椿皮中的鐵屎米-6-酮生物堿，結(jié)果顯示分離效果不佳.參照文獻(xiàn)[8]采用乙腈-0.1%乙酸水溶液為流動(dòng)相，先后考察了乙腈-0.1%乙酸水溶液不同配比（95∶5～15∶85）對(duì)鐵屎米-6-酮生物堿分離效果的影響，發(fā)現(xiàn)乙腈-0.1%乙酸水溶液（35∶65）、乙腈-0.1%乙酸水溶液（25∶75）都能與其他峰的基線達(dá)到完全分離，但考慮到以乙腈-0.1%乙酸水溶液（25∶75）為流動(dòng)相時(shí)，鐵屎米-6-酮生物堿保留時(shí)間過長，為提高分析效率，故采用乙腈-0.1%乙酸水溶液（35∶65）作為流動(dòng)相進(jìn)行分離.

通過比較不同柱溫（25℃、30℃、35℃、40℃）下鐵屎米-6-酮生物堿分離效果，并對(duì)其HPLC色譜圖進(jìn)行綜合分析，發(fā)現(xiàn)柱溫30℃時(shí)基線穩(wěn)定，分離效果較好，故選擇柱溫30℃為液相色譜條件.

對(duì)藥材市場(chǎng)購買的不同批次椿皮藥材，利用此種方法對(duì)鐵屎米-6-酮生物堿含量進(jìn)行檢測(cè)，發(fā)現(xiàn)其含量在14.11～33.24μg·g-1之間，含量變化較大，這可能與藥材的產(chǎn)地、采收時(shí)節(jié)、生長環(huán)境、存儲(chǔ)加工等因素存在較大的關(guān)系.

以上建立的測(cè)定方法，具有良好的精密度和簡便性，對(duì)椿皮藥材中特征性生物堿成分鐵屎米-6-酮的含量檢測(cè)提供了一定的科學(xué)依據(jù)和參考.但此種方法僅是對(duì)一種鐵屎米酮型生物堿的含量測(cè)定，而對(duì)于椿皮中多種生物堿成分含量的同時(shí)測(cè)定，還需要進(jìn)一步的研究.

參考文獻(xiàn)：

〔1〕譚慶偉，吳祖建，歐陽明安.臭椿化學(xué)成分及生物活性研究進(jìn)展[J].天然產(chǎn)物研究與開發(fā)，2008（4）：748-755.

〔2〕胡苗芬，宋新波，張麗娟.臭椿吲哚生物堿成分及其生物活性研究進(jìn)展[J].藥物評(píng)價(jià)研究，2012，35（6）：469-472.

〔3〕錢娟，王瑞平，鄒璽.椿皮的化學(xué)成分及抗腫瘤作用研究進(jìn)展[J].江蘇中醫(yī)藥，2012，44（4）：75-77.

〔4〕李永春，趙美榮，李曉蘭，等.臭椿主要活性成分及在生物防治中的應(yīng)用[J].湖南農(nóng)業(yè)科學(xué)，2018（3）：118-122.

〔5〕賴正權(quán)，歐國燈，肖樹雄，等.HPLC法同時(shí)測(cè)定苦木注射液中3種活性成分的含量[J].藥物分析雜志，2011，31（1）：15-18.

〔6〕黃曉丹，蘇子仁，沈小玲，等.消炎利膽片中穿心蓮內(nèi)酯類和苦木堿類的RP-HPLC法測(cè)定[J].中成藥，2003（6）：21-24.

〔7〕呂武清，黃衛(wèi)東，宋友昕.HPLC法測(cè)定苦木藥材中鐵屎米酮生物堿[J].中草藥，2009，40（8）：1321-1323.

〔8〕趙文娜，余靜潔，張新新，等.RP-HPLC法測(cè)定苦木藥材中4-甲氧基-5-羥基鐵屎米酮的含量[J].藥物分析雜志，2012，32（7）：1239-1242.

收稿日期：2019-12-18

基金項(xiàng)目：內(nèi)蒙古自治區(qū)高等學(xué)校科學(xué)研究項(xiàng)目（NJZY19215）

通訊作者：張智，教授，從事植物資源開發(fā)與利用研究