葉 君，劉丹瑜，何 權(quán)，黃鳳鳴，朱華棟，徐 軍*，蔣澄宇*

(1.中國醫(yī)學(xué)科學(xué)院 基礎(chǔ)醫(yī)學(xué)研究所, 北京協(xié)和醫(yī)學(xué)院 基礎(chǔ)學(xué)院 生物化學(xué)與分子生物學(xué)系， 北京 100005；2.中國醫(yī)學(xué)科學(xué)院 北京協(xié)和醫(yī)學(xué)院 北京協(xié)和醫(yī)院 急診科，北京 100730；3.北京大學(xué)第一醫(yī)院呼吸和危重癥醫(yī)學(xué)科，北京 100034)

肺炎是一種常見的呼吸系統(tǒng)疾病，被認(rèn)為是各種傳染病的主要死亡原因[1]，也是世界范圍內(nèi)住院和死亡的主要原因之一[2]。根據(jù)患者發(fā)病地點的不同，肺炎可分為社區(qū)獲得性肺炎(community acquired pneumonia, CAP) 和院內(nèi)獲得性肺炎(hospital-acquired pneumonia, HAP)。根據(jù)不同的多中心隊列研究，重癥社區(qū)獲得性肺炎(severe community acquired pneumonia, SCAP) 的病死率為17%～49%[3]。優(yōu)化SCAP患者的早期診斷方法和評估預(yù)后手段能很好地輔助醫(yī)師把握患者的病情，有效制定治療策略。microRNA是短的(20～24 nt) 非編碼RNA，通過影響mRNA的穩(wěn)定性和翻譯，參與多細(xì)胞生物中基因表達(dá)的轉(zhuǎn)錄后調(diào)控。hsa-miR-10a-5p(MIMAT0000253, UACCCUGUAGAUCCGAAUUUGUG)序列長23個核苷酸，在智人中發(fā)現(xiàn)。hsa-miR-10a-5p可調(diào)控日本血吸蟲感染的肝纖維化[4]，在正常的子宮肌層和平滑肌瘤中差異表達(dá)[5]，還可作為地方性伯基特淋巴瘤(endemic Burkitt lymphoma) 的潛在標(biāo)志物[6]。目前尚無報道hsa-miR-10a-5p在肺炎中的作用。本研究通過microRNA測序、相關(guān)性分析以及受試者工作特征曲線下面積(area under the receiver operating characteristic curve, AUC) 來評估hsa-miR-10a-5p作為SCAP標(biāo)志物的潛能，通過mRNA測序和靶基因預(yù)測及基因功能富聚類的方法探究hsa-miR-10a-5p在SCAP中的作用。

1 材料與方法

1.1 樣本來源

本研究納入了2013年4月至2016年1月北京協(xié)和醫(yī)院急診重癥監(jiān)護(hù)病房的SCAP患者41例，同時還招募了10名健康對照。其中SCAP患者定義為收入急診重癥監(jiān)護(hù)病房并診斷為CAP的患者。該研究通過了北京協(xié)和醫(yī)學(xué)院倫理委員會的批準(zhǔn)(審批文號：S-500) 并獲得每個參與者的知情同意。

本研究記錄了患者的基本個人信息，包括年齡、性別、吸煙史、飲酒史和基礎(chǔ)疾病史。記錄患者病情和治療情況，包括體溫、疾病轉(zhuǎn)歸、是否合并急性呼吸窘迫綜合征(acute respiratory distress syndrome, ARDS)、是否應(yīng)用激素治療、是否行氣管插管和體外膜肺氧合(extracorporeal membrane oxygenation, ECMO) 治療。記錄患者的血液化驗結(jié)果，包括血常規(guī)、肝腎功能、凝血功能、C反應(yīng)蛋白、降鈣素原(procalcitonin, PCT)。分別計算急性生理功能和慢性健康狀況評分系統(tǒng)Ⅱ(the acute physiology and chronic health evaluation Ⅱ, APACHE Ⅱ) 評分,CURB-65(C, 意識, consciousness; U, 血中尿素氮, blood urea nitrogen; R, 呼吸頻率, respiratory rate; B, 血壓, blood pressure; 65, 年齡≥65歲, age≥65) 評分、肺炎嚴(yán)重程度指數(shù)(pneumonia severity index, PSI) 評分和序貫器官衰竭評估(sequential organ failure assessment, SOFA) 評分來評估肺炎的嚴(yán)重程度。細(xì)菌檢測采用傳統(tǒng)培養(yǎng)方法，病毒檢測采用實時定量PCR方法。

1.2 方法

1.2.1 樣本處理:用無菌抗凝管采集SCAP患者和健康人外周靜脈血標(biāo)本，離心分離血清和血細(xì)胞。用紅細(xì)胞裂解緩沖液(索萊寶公司) 裂解紅細(xì)胞，使用TrizolTM試劑(Invitgen公司) 按照標(biāo)準(zhǔn)方案提取白細(xì)胞中的總RNA。

1.2.2 RNA測序及測序數(shù)據(jù)處理:RNA定量和RNA測序由Novogene生物信息學(xué)技術(shù)有限公司完成。測序數(shù)據(jù)使用FastQC 0.11.2 來控制鏈特異雙末端測序讀段的質(zhì)量。Bowtie2 2.1.0 和Tophat2 2.0.11 用于將測序讀段映射到人類基因組(版本hg19,http://hgdownload.cse.ucsc.edu/downloads.html)上。使用Cufflinks 2.2.1、Cuffmerge 2.2.1和Cuffdiff 2.2.1 軟件處理轉(zhuǎn)錄單位，計算基因表達(dá)水平(fragments per kilobase of transcript per million frag-ments mapped, FPKM值)，并識別差異表達(dá)基因。

1.2.3 預(yù)測microRNA靶點:microRNA在miRDB(microRNA target prediction database, http:// www.mirdb.org/expression.html) 和Targetscan7.2(http://www.argetscan.org/vert_72/) 平臺進(jìn)行靶基因預(yù)測，將兩個平臺預(yù)測到的靶基因進(jìn)行重合比對，取兩個平臺共有的靶基因進(jìn)行下一步分析。

1.2.4 基因功能富集分析:使用Metacore(Clarivate Analytics公司) 軟件分析差異表達(dá)基因的功能途徑。FDR<0.1、P<0.05為差異有統(tǒng)計學(xué)意義。選取前200條差異顯著的通路和生物學(xué)過程，使用Cytoscape 3.6.1軟件和Enrichment Map application 3.1.0進(jìn)行可視化。

1.3 統(tǒng)計學(xué)分析

采用Mann-WhitneyU檢驗確定兩組間的差異。線性相關(guān)分析采用Spearman秩相關(guān)系數(shù)。預(yù)測分析采用受試者工作特征(receiver operating characteristic, ROC) 曲線。利用GraphPad Prism 6進(jìn)行Mann-WhitneyU檢驗。采用SPSS統(tǒng)計軟件25.0進(jìn)行Spearman秩相關(guān)分析和AUC計算。

2 結(jié)果

2.1 下調(diào)的hsa-miR-10a-5p表達(dá)水平與CAP嚴(yán)重性相關(guān)

最終共37位受試者(SCAP患者27例，健康對照10名) 的第一個時間點樣本被選用。對27例SCAP患者根據(jù)預(yù)后轉(zhuǎn)歸分類分為存活組19例，死亡組8例，進(jìn)行基礎(chǔ)信息和臨床信息記錄。其中APACHE Ⅱ評分(P<0.001)、ARDS(P<0.05)、血糖(P<0.05)、淋巴細(xì)胞(P<0.000 1)、白細(xì)胞計數(shù)(P<0.001)和中性粒細(xì)胞計數(shù)(P<0.001) 在存活與死亡組之間有顯著性差異(表1)。

表1 根據(jù)預(yù)后轉(zhuǎn)歸分類的SCAP患者的臨床特征單變量分析Table 1 Univariable analysis of the clinical characteristics of SCAP patients according to the prognostic outcome classification

續(xù)表1

對hsa-miR-10a-5p的表達(dá)量進(jìn)行顯著性分析。相較于健康對照組，SCAP組的microRNA表達(dá)量顯著降低(P<0.01)(圖1A)。將SCAP組hsa-miR-10a-5p的表達(dá)量分為存活組和死亡組，死亡組的microRNA表達(dá)量相較于健康對照組顯著降低(P<0.000 1)(圖1B)，死亡組的microRNA表達(dá)量相較于存活組顯著降低(P<0.05)。SCAP的預(yù)后越差，hsa-miR-10a-5p的表達(dá)量越低。

A.Boxplot of hsa-miR-10a-5p level in healthy control(n=10) and SCAP patients(n=27); B.Boxplot of hsa-miR-10a-5p level in healthy control(n=10) and SCAP patients according to prognostic outcome classification(survive group n=19; non-survive group n=8); the horizontal line represents the median; the bottom and the top of the box represent 25th and the 75th percentiles; whiskers represent the minimum and the maximum； *P<0.01, **P<0.000 1 compared with healthy group圖1 hsa-miR-10a-5p水平在SCAP組和死亡組中顯著下調(diào)Fig 1 hsa-miR-10a-5p level was significantly down-regulated in SCAP group and non-survive group

對hsa-miR-10a-5p的表達(dá)量與SCAP患者的臨床參數(shù)進(jìn)行相關(guān)性分析。其中除了血氣乳酸(lactic acid, lac)(P<0.05) 與表達(dá)量有稍弱相關(guān)性以外，該microRNA表達(dá)水平與APACHE Ⅱ 評分(P<0.05)、紅細(xì)胞計數(shù)(P<0.01)、淋巴細(xì)胞百分比(P<0.05)、血細(xì)胞比容(hematocrit)(P<0.05)、心衰敏感指標(biāo)(N terminal pro B type natriuretic peptide/brain natriuretic peptide, NT-proBNP/BNP)(P<0.05)、凝血指標(biāo)(activated partial thromboplastin time, APTT)(P<0.05) 和PCT(P<0.05) 都有中等相關(guān)性(圖2)。microRNA水平與APACHE Ⅱ評分、NT-proBNP/BNP、血氣乳酸和PCT都呈負(fù)相關(guān)，而與APTT、紅細(xì)胞計數(shù)、淋巴細(xì)胞百分比和血細(xì)胞比容呈正相關(guān)(圖2)。其中該microRNA水平與APACHE Ⅱ 評分呈負(fù)相關(guān)，說明hsa-miR-10a-5p的表達(dá)量越低，APACHE Ⅱ 評分越高，即hsa-miR-10a-5p的表達(dá)量越低，疾病嚴(yán)重程度越高。

Spearman rank correlation analysis between hsa-miR-10a-5p level and clinical parameters in SCAP patients(n≤27, n is the amount of data available for each parameter); both horizontal and vertical coordinates have taken the log10 value圖2 hsa-miR-10a-5p水平與SCAP患者的臨床參數(shù)相關(guān)Fig 2 hsa-miR-10a-5p level was correlated with the clinical parameters of SCAP patients

2.2 hsa-miR-10a-5p預(yù)測的靶向基因與肺炎的發(fā)展密切相關(guān)

對41個SCAP樣本(覆蓋了本次microRNA測序的27個樣本) 和10個健康對照樣本進(jìn)行mRNA測序。對mRNA測序結(jié)果進(jìn)行差異分析，篩選出P<0.05、差異倍數(shù)(fold change, FC)>2或<0.5的差異基因。將這些差異基因與hsa-miR-10a-5p(UACCCUGUAGAUCCGAAUUUGUG) 預(yù)測的靶基因進(jìn)行重合比對，取共有的差異基因進(jìn)行聚類分析。

生物學(xué)過程聚類結(jié)果中可看到除了主要的炎性反應(yīng)和免疫相關(guān)生物學(xué)過程以外，結(jié)果中也出現(xiàn)了細(xì)胞骨架和細(xì)胞黏附相關(guān)的生物學(xué)過程(圖3A)，這可能與病原體感染過程相關(guān)。通路聚類結(jié)果中同樣也看到炎性反應(yīng)和免疫、細(xì)胞骨架和細(xì)胞黏附，還出現(xiàn)了癌癥與腫瘤相關(guān)的以及細(xì)胞生長相關(guān)的通路(圖3B)。這些通路都與肺炎的發(fā)展密切相關(guān)。

A.biological process clustering diagram of hsa-miR-10a-5p targeted genes(n=26); B.pathway clustering diagram of hsa-miR-10a-5p targeted genes(n=26); node size represents the number of differentially expressed genes(DEGs) in the gene set; node color reflects the enrichment score(FDR value); the edge line represents the overlap of DEGs圖3 hsa-miR-10a-5p預(yù)測的靶向基因的功能聚類分析Fig 3 Functional cluster analysis of targeted genes predicted by hsa-miR-10a-5p

2.3 hsa-miR-10a-5p的表達(dá)水平可以預(yù)測SCAP患者的不良結(jié)局

根據(jù)疾病預(yù)后轉(zhuǎn)歸分類計算了hsa-miR-10a-5p表達(dá)水平的AUC，結(jié)果顯示hsa-miR-10a-5p的表達(dá)水平具有良好的預(yù)后預(yù)測能力(AUC=0.776)。

3 討論

多個研究表明，hsa-miR-10a-5p在癌癥中發(fā)揮重要的作用，例如上調(diào)的hsa-miR-10a-5p抑制宮頸癌細(xì)胞的活力和細(xì)胞周期進(jìn)程[7]；抑制hsa-miR-10a-5p來降低膽管癌細(xì)胞的生長[8]；hsa-miR-10a-5p抑制腎細(xì)胞癌細(xì)胞的遷移和侵襲[9]；hsa-miR-10a-5p直接參與胃癌轉(zhuǎn)移的主要機(jī)制[10]。這些研究說明hsa-miR-10a-5p在不同的癌癥中發(fā)揮不同的作用。有研究采用生物信息學(xué)方法發(fā)現(xiàn)hsa-miR-10a-5p在生長發(fā)育及腫瘤發(fā)生發(fā)展過程中起重要作用[11]。本研究也發(fā)現(xiàn)hsa-miR-10a-5p預(yù)測的靶向基因與腫瘤和癌癥以及生長發(fā)育密切相關(guān)，說明hsa-miR-10a-5p在生長發(fā)育方面和病理情況下發(fā)揮著不可忽視的作用。

本研究通過顯著性分析發(fā)現(xiàn)hsa-miR-10a-5p水平在SCAP中顯著下調(diào)，且在死亡組中下調(diào)更明顯，提示hsa-miR-10a-5p水平能區(qū)分健康對照與SCAP患者，且能指示肺炎的嚴(yán)重程度。hsa-miR-10a-5p水平與APACHE Ⅱ 評分、NT-proBNP/BNP、血氣乳酸和PCT都呈負(fù)相關(guān)，而與APTT、紅細(xì)胞計數(shù)、淋巴細(xì)胞百分比和血細(xì)胞比容呈正相關(guān)，這些結(jié)果都與臨床經(jīng)驗相一致。hsa-miR-10a-5p水平與APACHE Ⅱ 評分呈負(fù)相關(guān)提示hsa-miR-10a-5p水平能指示肺炎的嚴(yán)重程度。microRNA水平預(yù)測疾病預(yù)后的AUC為0.776，提示hsa-miR-10a-5p水平能很好地預(yù)測SCAP的不良結(jié)局。這些結(jié)果都支持hsa-miR-10a-5p可以作為SCAP的潛在標(biāo)志物。

功能富集分析結(jié)果表明在SCAP發(fā)生時，hsa-miR-10a-5p預(yù)測的靶向基因能調(diào)控與肺炎發(fā)展密切相關(guān)的生物學(xué)過程和通路。具體來說，hsa-miR-10a-5p可能參與前期病原體侵入(細(xì)胞骨架和細(xì)胞黏附相關(guān)生物學(xué)過程和通路)、免疫系統(tǒng)發(fā)揮作用(免疫和炎性反應(yīng)相關(guān)生物學(xué)過程和通路) 和生理和病理情況下的調(diào)控(細(xì)胞生長和癌癥與腫瘤相關(guān)生物學(xué)過程和通路)，提示hsa-miR-10a-5p在SCAP中的重要作用。