雷 丹，張燕茹，陳 茜，李 露，崔 南*

(1.西安交通大學(xué)第一附屬醫(yī)院 生殖醫(yī)學(xué)科,西安交通大學(xué) 醫(yī)學(xué)部，陜西 西安710061；2.西安醫(yī)學(xué)院第一附屬醫(yī)院 腎病科，陜西 西安 710021)

在發(fā)展中國(guó)家，宮頸癌(cervical cancer)是位居第2的一種女性致死性癌，在全球范圍內(nèi)，宮頸癌也是排名第4的腫瘤類型。近年來(lái)的研究顯示，宮頸癌呈現(xiàn)年輕化傾向， 25歲以下罹患宮頸癌的年輕女性患者逐漸增多[1-2]。

在腫瘤細(xì)胞中，即使在氧供充足的情況下，細(xì)胞內(nèi)相當(dāng)一部分的葡萄糖仍會(huì)跳過(guò)氧化磷酸化途徑通過(guò)糖酵解途徑生成丙酮酸后直接生成乳酸，從而為腫瘤細(xì)胞增殖提供能量，該現(xiàn)象稱之為Warburg效應(yīng)。腫瘤細(xì)胞通過(guò)采用這種高消耗的代謝方式可以塑造有利于自身增殖的環(huán)境，利于腫瘤細(xì)胞的存活、快速增殖及腫瘤細(xì)胞的遷移和腫瘤的轉(zhuǎn)移[3]。己糖激酶2(hexokinase 2，HK2)是己糖激酶(hexokinase,HK)同工酶的一種，通過(guò)結(jié)合位于線粒體外膜的電壓依賴性陰離子通道(voltage dependent anion channel, VDAC)蛋白，HK2可以加快糖酵解的進(jìn)程，為腫瘤細(xì)胞增殖提供大量的原料，與腫瘤細(xì)胞內(nèi)異常糖酵解過(guò)程密切相關(guān)[4]。既往的研究證實(shí)，HK2在頭頸部麟癌、乳腺癌、肺癌、結(jié)直腸癌、肝癌、胰腺癌、宮頸癌和惡性淋巴瘤等多種腫瘤組織中表達(dá)升高。應(yīng)用HK2抑制劑如3-BP可抑制多種腫瘤細(xì)胞的增殖，如人膠質(zhì)瘤細(xì)胞、乳腺癌細(xì)胞、多發(fā)性骨髓瘤細(xì)胞和肝癌細(xì)胞等[5]。但是HK2在宮頸癌中的研究仍較少。因此，本研究擬在宮頸癌細(xì)胞系HeLa細(xì)胞中過(guò)表達(dá)HK2后，觀察HK2對(duì)HeLa細(xì)胞增殖、遷移和侵襲的影響，探討HK2通過(guò)p-ERK1/2上調(diào)周期相關(guān)蛋白cyclin A和Slug表達(dá)促進(jìn)宮頸癌細(xì)胞增殖、遷移和侵襲作用機(jī)制，研究HK2對(duì)宮頸癌細(xì)胞系HeLa細(xì)胞生物學(xué)行為的影響。

1 材料與方法

1.1 材料

人宮頸癌細(xì)胞系HeLa 細(xì)胞、SiHa、C-33A和CaSki(ATCC)。質(zhì)粒表達(dá)載體pCAG-IRES2-AcVEC-neo(本實(shí)驗(yàn)室保存)。HK2、cyclin A、ERK1/2和GAPDH鼠單克隆抗體(Santa Cruz公司)；Slug和p-ERK1/2兔單克隆抗體(Cell Signaling Technology公司)；DMEM培養(yǎng)基(上海源培生物科技有限公司)；胎牛血清(Biological Industries公司)；Trizol試劑、反轉(zhuǎn)錄試劑盒和SYBR?Premix Ex TaqTMⅡ(TaKaRa公司)；其余試劑為國(guó)產(chǎn)分析純。

1.2 方法

1.2.1 G418壓力篩選獲取穩(wěn)定表達(dá)HK2蛋白的HeLa細(xì)胞系：將人宮頸癌細(xì)胞HeLa培養(yǎng)于含10%胎牛血清的DMEM培養(yǎng)基中，于5% CO2的37 ℃孵箱中常規(guī)培養(yǎng)。將2 μg重組質(zhì)粒DNA通過(guò)Lipofectamine 2000脂質(zhì)體轉(zhuǎn)染試劑轉(zhuǎn)染于細(xì)胞中，G418壓力篩選3～4周后，通過(guò)Western blot，鑒定HK2表達(dá)陽(yáng)性的單克隆細(xì)胞系。

1.2.2 細(xì)胞免疫化學(xué)檢測(cè)蛋白表達(dá)：常規(guī)消化對(duì)數(shù)期的細(xì)胞后制備成細(xì)胞懸液，接種于0.5 cm×0.5 cm的爬片上， PBS洗滌5 min×3次，4%多聚甲醛室溫固定30 min。PBS 洗滌5 min×3次，加入0.2% Triton X-100，室溫放置10 min。PBS 洗滌5 min×3次后，加一抗，4 ℃濕盒過(guò)夜。次日，室溫放置30 min，PBS 洗滌5 min×3次，加二抗，室溫放置30 min。PBS洗滌5 min×3次后，DAB顯色，依次使用：蘇木精染色2 min，鹽酸乙醇分化15 s，氨水反藍(lán)15 s，梯度乙醇脫水各5 min，二甲苯透明2 min，中性樹(shù)膠封片，光學(xué)顯微鏡下觀察。

1.2.3 細(xì)胞劃痕實(shí)驗(yàn)檢測(cè)細(xì)胞遷移：將細(xì)胞接種于6孔板中至90%～95%匯合度，用20 μL無(wú)菌槍頭劃一橫線，PBS清洗細(xì)胞3次，加入無(wú)血清的DMEM培養(yǎng)基繼續(xù)培養(yǎng)24 h，用倒置顯微鏡進(jìn)行觀察及拍照，選取5個(gè)視野進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析。

1.2.4 Transwell小室法檢測(cè)細(xì)胞的遷移和侵襲：將HeLa細(xì)胞饑餓24 h后，將4×105個(gè)細(xì)胞加入Transwell上室中，下室中加入含 10% FBS的DMEM培養(yǎng)基， 37 ℃孵育。48 h后,用棉簽擦去上室內(nèi)殘留的細(xì)胞,甲醛固定10 min，0.1%的結(jié)晶紫室溫孵育10 min, PBS清洗3遍，將小室底面朝上于顯微鏡下拍照,隨機(jī)選取5個(gè)視野進(jìn)行計(jì)數(shù),統(tǒng)計(jì)分析，重復(fù)上述實(shí)驗(yàn)3次。

于Transwell上室中平鋪1∶8的matrigel膠50 μL，紫外燈照射消毒6 h后，將細(xì)胞懸液加入Transwell上室，下室中加入10% FBS 的DMEM培養(yǎng)基，后續(xù)步驟同體外遷移實(shí)驗(yàn)。

1.2.5 細(xì)胞計(jì)數(shù)法和MTT法檢測(cè)細(xì)胞增殖：將細(xì)胞用胰蛋白酶消化后制備成單細(xì)胞懸液，按照3×104個(gè)/皿接種于6孔板里。分別于1、3、5和7 d，進(jìn)行細(xì)胞計(jì)數(shù)，繪制細(xì)胞增殖曲線，每組試驗(yàn)設(shè)置3個(gè)復(fù)孔，重復(fù)3次。將細(xì)胞制成單細(xì)胞懸液，以1 000個(gè)/孔接種于96孔培養(yǎng)板中。于接種后1、3、5和7 d，用MTT法檢測(cè)各組吸光度A值，各實(shí)驗(yàn)組均設(shè)置3個(gè)復(fù)孔，實(shí)驗(yàn)重復(fù)3次。

1.2.6 細(xì)胞周期分析：胰蛋白酶消化收集細(xì)胞，1 000 r/min離心5 min，預(yù)冷的PBS洗滌2次，加入預(yù)冷的70%乙醇，4 ℃冰箱固定細(xì)胞。1 000 r/min離心5 min， PBS洗滌2次。0.01% RNase的PI處理細(xì)胞，4 ℃避光染色30 min。流式細(xì)胞儀進(jìn)行檢測(cè)，使用CellQuest軟件分析結(jié)果。重復(fù)試驗(yàn)3次以上。

1.2.7 Real-time PCR檢測(cè)細(xì)胞mRNA表達(dá)：使用Trizol試劑提取細(xì)胞的總RNA，按照反轉(zhuǎn)錄試劑盒說(shuō)明書(shū)將RNA反轉(zhuǎn)錄成cDNA，以NCBI Gene bank提供的人基因序列為模板設(shè)計(jì)特異性real-time PCR引物(表1)。Real-time PCR按照SYBR?Premix Ex TaqTMⅡ說(shuō)明書(shū)進(jìn)行。將各管混勻離心后，置于Bio-Rad iQ5熒光定量PCR儀中進(jìn)行擴(kuò)增反應(yīng)。每個(gè)樣品準(zhǔn)備3個(gè)復(fù)管，試驗(yàn)至少重復(fù)3遍。

表1 Real-time PCR引物Table 1 Real-time PCR primer sequences

1.2.8 Western blot檢測(cè)蛋白表達(dá)：使用細(xì)胞裂解液收集細(xì)胞蛋白，測(cè)定蛋白濃度。通過(guò)SDS-PAGE分離蛋白，電泳結(jié)束后，進(jìn)行轉(zhuǎn)膜；5%的脫脂奶粉TBST緩沖液室溫封閉1 h；加入一抗，4 ℃孵育過(guò)夜；次日，TBST洗膜10 min×4次；加二抗室溫孵育1 h；TBST洗膜10 min×4次；化學(xué)發(fā)光檢測(cè)；通過(guò)Western blot化學(xué)發(fā)光成像一體機(jī)拍照分析。

1.2.9 抑制p-ERK1/2蛋白在HK2過(guò)表達(dá)HeLa細(xì)胞中表達(dá)：ERK1/2抑制劑(FR180204)按照說(shuō)明書(shū)溶于DMSO，后續(xù)根據(jù)實(shí)驗(yàn)需要稀釋至工作濃度30 μmol/L和60 μmol/L。將細(xì)胞培養(yǎng)液更換為含F(xiàn)R180204培養(yǎng)液后：分別進(jìn)行細(xì)胞計(jì)數(shù)、MMT、Transwell體外遷移實(shí)驗(yàn)和侵襲實(shí)驗(yàn)；收集細(xì)胞，加入細(xì)胞裂解液收集細(xì)胞蛋白，通過(guò)Western blot檢測(cè)相關(guān)蛋白表達(dá)。

1.3 統(tǒng)計(jì)學(xué)分析

2 結(jié)果

2.1 HK2蛋白在宮頸癌細(xì)胞中的表達(dá)

HK2蛋白在宮頸癌細(xì)胞系HeLa、CaSki、C-33A和SiHa中均有表達(dá)(圖1A,B)。在線數(shù)據(jù)庫(kù)的結(jié)果顯示，HK2蛋白在宮頸癌組織中的表達(dá)高于正常組織(圖1C)(P<0.05)，且HK2高表達(dá)提示患者不良預(yù)后(圖1D)(P<0.01)(gepia.cancer-pku.cn)。成功構(gòu)建穩(wěn)定表達(dá)HK2蛋白的HeLa-HK2-2和HeLa-HK2-3細(xì)胞系，及對(duì)照細(xì)胞系HeLa-VEC-1和HeLa-VEC-2 (圖1E)。

A.expression of HK2 in cervical cancer cell lines was detected by Western blot; B. expression of HK2 in cervical cancer cell lines was detected by immunocychemistry; C.expression of HK2 between cervical cancer patients CECS and normal tissues(N) was analyzed by online database, *P<0.05 compared with VEC control group; D.overall survival between HK2-high patients and HK2-low patients was analyzed by online database; E.expression of HK2 in stable transfected HeLa cell was detected by Western blot圖1 HK2在宮頸癌細(xì)胞系中的表達(dá)Fig 1 Expression of HK2 in cervical cancer cell lines n=3)

2.2 HK2增強(qiáng)HeLa細(xì)胞體外遷移和侵襲的能力

與對(duì)照細(xì)胞相比，過(guò)表達(dá)HK2顯著增強(qiáng)HeLa細(xì)胞體外遷移(圖2A)(P<0.05)和侵襲的能力(圖2B)(P<0.05)。細(xì)胞劃痕實(shí)驗(yàn)也發(fā)現(xiàn)，在觀察48 h時(shí)，HeLa-HK2細(xì)胞劃痕的愈合速度快于HeLa-VEC細(xì)胞(圖2C，D)(P<0.05)。

A. migratory potential of HK2-overexpressing HeLa cells and the respective control cells was analyzed by the Transwell cell migration assay, and number of migratory cells was shown, scale bar=100 μm; B.invasive potential of HK2-over-expressing HeLa cells and the respective control cells was analyzed by the transwell cell invasion assay, and the number of migratory cells was shown, scale bar=100 μm; C.migratory potential of HK2-over-expressing HeLa cells and the respective control cells was analyzed in a wound-healing assay for 0 and 48 hours(×200); D.scratch area of HK2-over-expressing HeLa cells and the respective control cells; *P<0.05 compared with VEC control group圖2 HK2促進(jìn)HeLa細(xì)胞的體外遷移和侵襲Fig 2 HK2 promoted HeLa cell migration and invasion in n=3)

2.3 HK2促進(jìn)HeLa細(xì)胞的增殖和細(xì)胞活力

HK2可以顯著促進(jìn)HeLa細(xì)胞的增殖(圖3A)(P<0.05)和細(xì)胞活力(圖3B)(P<0.05)。HK2可以加快細(xì)胞周期從G0/G1期向S期的轉(zhuǎn)換。HeLa-HK2細(xì)胞中處于G0/G1的細(xì)胞比例明顯少于HeLa-VEC細(xì)胞，HeLa-HK2細(xì)胞中處于S期的細(xì)胞比例明顯多于HeLa-VEC細(xì)胞(圖3C，D)(P<0.05)。

A.proliferation of HeLa-VEC and HeLa-HK2 cells were detected by growth curves; B.viability of HeLa-VEC and HeLa-HK2 cells were detected by MTT assay; C，D.cell cycle of HeLa-VEC and HeLa-HK2 cells was analyzed by flow cytometry, and the quantitative analysis；*P<0.05, **P<0.01 compared with VEC control group圖3 HK2促進(jìn)HeLa細(xì)胞體外增殖Fig 3 HK2 promotesd cell proliferation of HeLa cells in vitro n=3)

2.4 HK2上調(diào)ERK1/2、p-ERK1/2、Slug和cyclin A蛋白表達(dá)

HK2可以上調(diào)EMT相關(guān)基因CDH2、Slug、vimentin、ZEB1和ZEB2在HeLa細(xì)胞中的mRNA的表達(dá)量(圖4A)。此外，HK2可以上調(diào)周期相關(guān)蛋白cyclin A和cyclin D1在HeLa細(xì)胞中的mRNA的表達(dá)量(圖4A)。HK2可以顯著上調(diào)ERK1/2、p-ERK1/2、cyclin A和Slug蛋白在HeLa細(xì)胞中的表達(dá)(圖4B,C)。

A. expression of CDH1, CDH2, Snai1, Slug, vimentin, ZEB1, ZEB2, HK2, cyclin D1, cyclin A, HK2 HeLa-Vec and HeLa-HK2 cells was detected by real-time PCR, and the quantitative analysis was shown; B.expression of ERK1/2, p-ERK1/2, Slug, cyclin A in HeLa-VEC and HeLa-HK2 cells was detected by Western blot, and the quantitative analysis was shown; C.expression of ERK1/2, p-ERK1/2, Snai2, cyclin A in HeLa-VEC and HeLa-HK2 cells was detected by immunocychemistry (×100); *P<0.05，**P<0.01 compared with VEC control group圖4 HK2上調(diào)HeLa細(xì)胞中ERK1/2、p-ERK1/2、Slug和cyclin A蛋白表達(dá)Fig 4 HK2 up-regulated expression of ERK1/2, p-ERK1/2, Slug and cyclin A in HeLa n=3)

2.5 抑制ERK1/2和p-ERK1/2蛋白表達(dá)可以減弱HK2對(duì)HeLa細(xì)胞增殖及遷移的影響

FR180204可以顯著抑制ERK1/2、p-ERK1/2、cyclin A和Slug蛋白的表達(dá)(圖5A)。FR180204可以抑制HeLa-HK2細(xì)胞的增殖和活力(圖5B,C)。FR180204 可以抑制HeLa-HK2細(xì)胞體外遷移和侵襲能力(圖5D,E)。

A.expression of ERK1/2, p-ERK1/2, Slug and cyclin A was detected by Western blot in FR180 or DMSO treated HeLa-HK2 cells, and the quantitative analysis was shown; B.proliferation of FR180 or DMSO treated HeLa-HK2 cells were detected by growth curves; C.viability of FR180 or DMSO treated HeLa-HK2 cells were detected by MTT assay; D.migratory potential of FR180 or DMSO treated HeLa-HK2 cells was analyzed by the transwell cell migration assay, and number of migratory cells was shown, scale bar=100 μm; E.invasive potential of FR180 or DMSO treated HeLa-HK2 cells was analyzed by the transwell cell invasion assay, and the number of migratory cells was shown, scale bar=100 μm; *P<0.05，**P<0.01 compared with DMSO control group圖5 抑制ERK1/2 蛋白表達(dá)可以減弱HK2對(duì)HeLa細(xì)胞增殖、遷移和侵襲的影響Fig 5 Treating with the ERK1/2 inhibitor could inhibite cell growth, migration and invasion that induced by HK2

3 討論

己糖激酶2 (HK2)是己糖激酶的一員，是糖酵解的一種關(guān)鍵酶，與惡性腫瘤關(guān)系最密切[6-8]。在本研究中，Western blot和細(xì)胞免疫化學(xué)的結(jié)果顯示，在宮頸癌細(xì)胞系HeLa、CaSki、C-33A和SiHa中均可檢測(cè)到HK2蛋白的表達(dá)。在線數(shù)據(jù)庫(kù)中的數(shù)據(jù)也證實(shí)HK2在宮頸癌患者標(biāo)本中的表達(dá)明顯高于正常組織標(biāo)本，且HK2高表達(dá)提示患者的不良預(yù)后。

HK2通過(guò)增強(qiáng)腫瘤細(xì)胞的Warburg效應(yīng)，可以促進(jìn)細(xì)胞增殖并抑制細(xì)胞凋亡[9]。在本研究中，HK2表達(dá)可以上調(diào)細(xì)胞周期相關(guān)蛋白cyclin A和cyclin D1在HeLa細(xì)胞中mRNA的表達(dá)。Western blot和細(xì)胞免疫化學(xué)的結(jié)果證實(shí)，HK2可以顯著上調(diào)cyclin A在HeLa細(xì)胞中的表達(dá)。cyclin A作為調(diào)節(jié)細(xì)胞周期進(jìn)程的一個(gè)正向調(diào)節(jié)分子可以促進(jìn)多種腫瘤細(xì)胞的增殖及腫瘤的生長(zhǎng)，在本研究中，HK2通過(guò)上調(diào)cyclin A在HeLa細(xì)胞中的表達(dá)可以促進(jìn)HeLa細(xì)胞的體外增殖和細(xì)胞活力。此外，real-time PCR和Western blot的結(jié)果顯示，HK2通過(guò)上調(diào)多種EMT相關(guān)分子在HeLa細(xì)胞中mRNA和蛋白的表達(dá)，如CDH2、Slug、vimentin、ZEB1和ZEB2，增強(qiáng)HeLa細(xì)胞體外遷移和侵襲的能力。

ERK1/2是MAPK信號(hào)傳導(dǎo)通路激酶級(jí)聯(lián)反應(yīng)的重要成員之一，ERK1/2經(jīng)過(guò)磷酸化活化后，通過(guò)調(diào)節(jié)下游多種因子的表達(dá)(如cyclin A和Slug)參與調(diào)節(jié)腫瘤細(xì)胞的增殖、 侵襲及腫瘤轉(zhuǎn)移[10-13]。在本研究中，HK2可以顯著上調(diào)ERK1/2和p-ERK1/2在HeLa細(xì)胞中的蛋白表達(dá)。在HK2過(guò)表達(dá)HeLa細(xì)胞中用ERK抑制劑(FR180204)抑制ERK1/2和 p-ERK1/2表達(dá)后，可以下調(diào)cyclin A和Slug蛋白的表達(dá)，并抑制HK2對(duì)HeLa細(xì)胞增殖、遷移和侵襲的促進(jìn)作用。上述結(jié)果提示，HK2通過(guò)上調(diào)ERK1/2和p-ERK1/2在HeLa細(xì)胞中的表達(dá)可以促進(jìn)細(xì)胞的增殖、遷移和侵襲。

綜上所述，本研究發(fā)現(xiàn)HK2在宮頸癌中通過(guò)活化ERK1/2(p-ERK1/2)，可以上調(diào)cyclin A和Slug蛋白的表達(dá)，并促進(jìn)HeLa細(xì)胞的體外增殖、遷移和侵襲。但是，HK2通過(guò)何種方式上調(diào)ERK1/2蛋白表達(dá)并增強(qiáng)ERK1/2的活化(p-ERK1/2)，仍有待通過(guò)進(jìn)一步的研究去證實(shí)。