宋 奇，程安源，余 鈴，徐 立*

(武漢市第一醫(yī)院 骨科， 湖北 武漢 430022； 2.武漢大學(xué)人民醫(yī)院 骨科， 湖北 武漢 430060)

骨肉瘤(osteosarcoma, OS)是一種好發(fā)于兒童和青少年長管狀骨干骺端的惡性腫瘤，早期容易出現(xiàn)遠(yuǎn)處轉(zhuǎn)移，肺臟是最常見的轉(zhuǎn)移部位。由于缺乏早期診斷手段，據(jù)估計(jì)，有15%～20%的骨肉瘤患者在確診時已經(jīng)出現(xiàn)遠(yuǎn)處轉(zhuǎn)移。對于局限性骨肉瘤患者，經(jīng)過規(guī)范診療后，患者5年生存率可達(dá)65%～70%，而對于發(fā)生轉(zhuǎn)移的骨肉瘤患者，缺乏有效的治療手段，患者預(yù)后較差，5年生存率僅20%左右[1-2]。因此，尋找骨肉瘤早期轉(zhuǎn)移的分子標(biāo)記、探究骨肉瘤早期轉(zhuǎn)移的分子機(jī)制、尋找新的藥物作用靶點(diǎn)，對于骨肉瘤患者的早期診斷和個體化治療具有重要意義。

本研究利用GEO(Gene Expression Omnibus)數(shù)據(jù)庫中數(shù)據(jù)集GSE32981及TCGA數(shù)據(jù)庫(The Cancer Genome Atlas)中骨肉瘤患者的臨床數(shù)據(jù)，利用生物信息學(xué)手段進(jìn)行聯(lián)合分析，篩選出感興趣基因，并通過后續(xù)的實(shí)驗(yàn)進(jìn)行驗(yàn)證，以期為闡明骨肉瘤轉(zhuǎn)移的分子機(jī)制及相關(guān)藥物的開發(fā)提供研究基礎(chǔ)。

1 材料與方法

1.1 材料

人骨肉瘤143B細(xì)胞系(中國科學(xué)院上海細(xì)胞庫)；α-MEM培養(yǎng)基和胎牛血清(Gibco公司)；1%雙抗(青霉素100U/mL, 鏈霉素100μg/mL)、胰蛋白酶(武漢谷歌生物科技公司)；Cell Counting Kit-8 (CCK-8)(上海碧云天生物科技有限公司)；抗E-Cad、N-Cad、Vim和GAPDH一抗(CST公司)；抗GPRC5A一抗(SCBT公司)；PC3.1-EGFP-Flag和PC3.1-GPRC5A-Flag過表達(dá)載體及GPRC5A特異性siRNA序列(siGPRC5A)及對照組序列(siNeg)(武漢生工生物工程公司)。

1.2 方法

1.2.1 生物信息學(xué)分析：使用R軟件對原始數(shù)據(jù)集GSE32981進(jìn)行差異基因的篩選和數(shù)據(jù)的可視化，設(shè)置篩選條件為：|log2(Fold Change)|>1且P<0.05，結(jié)合TCGA數(shù)據(jù)庫中骨肉瘤轉(zhuǎn)錄組數(shù)據(jù)以及患者臨床特征對差異基因進(jìn)行生存分析。數(shù)據(jù)集GSE126209用來分析骨肉瘤腫瘤組織和相應(yīng)正常組織中GPRC5A表達(dá)水平。

1.2.2 細(xì)胞的培養(yǎng)及轉(zhuǎn)染：用含有10%胎牛血清和1%雙抗的α-MEM培養(yǎng)基培養(yǎng)人骨肉瘤143B細(xì)胞，隔天換液，取對數(shù)期細(xì)胞進(jìn)行實(shí)驗(yàn)。細(xì)胞轉(zhuǎn)染時，將143B細(xì)胞接種在6孔板中，待細(xì)胞匯合度為60%～70%后，棄掉培養(yǎng)基，PBS洗滌2次后，加入1 mL培養(yǎng)基，根據(jù)轉(zhuǎn)染試劑說明書，將質(zhì)粒(PC3.1-EGFP-Flag或PC3.1-GPRC5A-Flag)或者siRNA(siNeg或siGRPC5A)轉(zhuǎn)染至HepG2細(xì)胞中，共包括4組：siNeg組、siGPRC5A組、EGFP組和GPRC5A組。

1.2.3 CCK-8法檢測細(xì)胞增殖：將轉(zhuǎn)染48 h后的143B細(xì)胞重懸，調(diào)整細(xì)胞濃度為5×104個/mL，取100 μL接種在96孔板中，待接種8、24、48和72 h后，每孔加入10 μL CCK-8試劑，培養(yǎng)箱中避光孵育1 h后，用全自動多功能酶標(biāo)儀檢測每孔細(xì)胞在450 nm波長下的吸光度值(A)。

1.2.4 劃痕實(shí)驗(yàn)：將143B細(xì)胞接種在6孔板中，待細(xì)胞匯合度達(dá)60%～70%后，轉(zhuǎn)染GRPC5A過表達(dá)質(zhì)粒和特異性siRNA及各自對照組，轉(zhuǎn)染后8 h換液，待6孔板底細(xì)胞匯合度達(dá)100%，在各組細(xì)胞6孔板底劃出“十”字線，用無血清的α-MEM培養(yǎng)基繼續(xù)培養(yǎng)24 h后，用倒置顯微鏡觀察劃痕愈合度，拍照記錄。

1.2.5 Transwell小室法侵襲實(shí)驗(yàn)：用α-MEM不完全培養(yǎng)基重懸轉(zhuǎn)染48 h后的143B細(xì)胞，調(diào)整細(xì)胞濃度為5×105個/mL，在Transwell小室上室中加入200 μL細(xì)胞懸液，下室中加入500 μL完全培養(yǎng)基。繼續(xù)培養(yǎng)48 h后，用PBS清洗Transwell小室，4%多聚甲醛室溫固定30 min后，用結(jié)晶紫染液染色20 min，使用倒置顯微鏡拍照，計(jì)數(shù)，每組重復(fù)3次。

1.2.6 RT-qPCR檢測GPRC5A和EMT相關(guān)基因的表達(dá)：收集各組細(xì)胞，Trizol法提取總RNA，取1 μg總RNA反轉(zhuǎn)錄成為cDNA后，進(jìn)行實(shí)時熒光定量PCR檢測，條件設(shè)置為：預(yù)變性94 ℃, 2 min；變性94 ℃ 30 s, 退火60 ℃ 30 s, 延伸 72 ℃ 30 s，共計(jì)45個循環(huán)，采用2-ΔΔCt法計(jì)算各基因表達(dá)水平。RT-qPCR引物(表1)。

表1 RT-qPCR實(shí)驗(yàn)的引物序列Table 1 Primer Sequence of RT-qPCR

1.2.7 Western blot檢測GPRC5A和EMT相關(guān)蛋白的表達(dá)：收集各組細(xì)胞，提取總蛋白，用BCA法蛋白定量后取10 μg總蛋白，進(jìn)行10%或12% SDA-PAGE蛋白膠電泳分離，轉(zhuǎn)膜后室溫封閉1 h，TBST洗滌3次將條帶置入相應(yīng)的一抗中孵育過夜。TBST溶液振搖洗滌3次，將條帶置于辣根過氧化物酶標(biāo)記的二抗(1∶3 000稀釋)中室溫?fù)u床孵育1 h。用TBST洗滌3次后，將條帶置于ECL試劑盒A液和B液混合液(1∶1混合)中，然后進(jìn)行曝光分析。蛋白表達(dá)水平=目的蛋白吸光度值/GAPDH的吸光度值。

1.3 統(tǒng)計(jì)學(xué)分析

2 結(jié)果

2.1 骨肉瘤轉(zhuǎn)移瘤生物信息學(xué)分析

數(shù)據(jù)集GSE32981含有23個人骨肉瘤組織樣本，其中原發(fā)瘤12個，轉(zhuǎn)移瘤11個。與原發(fā)瘤相比，轉(zhuǎn)移瘤中有299個基因表達(dá)水平發(fā)生改變(圖1A，B)。

A.volcano map of differentially expressed genes in GSE32981 data set; B.heatmap of differentially expressed genes in GSE32981 data set圖1 骨肉瘤原位瘤和轉(zhuǎn)移瘤差異基因分析Fig 1 Differential expression genes analysis in primary and metastatic osteosarcoma

2.2 差異基因生存分析

分析TCGA數(shù)據(jù)庫中骨肉瘤患者的臨床信息，發(fā)現(xiàn)有2 310個基因的表達(dá)水平與骨肉瘤患者生存相關(guān)(P<0.05)，有37個基因在骨肉瘤轉(zhuǎn)移瘤中差異表達(dá)(圖2A)。其中，GPRC5A在轉(zhuǎn)移瘤中上調(diào)明顯(P<0.01)(圖2B)并且高表達(dá)與骨肉瘤患者生存差相關(guān)(P<0.05)(圖2C)。此外，與正常組織相比，骨肉瘤組織中GPRC5A表達(dá)明顯增高(P<0.01)(圖2D)。

A.Venn diagram of differentially expressed genes in GSE32981 data set and genes related to survival in TCGA data set; B.heatmap of the 37 genes in primary and metastasis osteosarcoma; C.survival analysis of osteosarcoma patients with different expression level of GPRC5A; D.the expression of GPRC5A in osteosarcoma sample and adjacent normal圖2 骨肉瘤轉(zhuǎn)移瘤差異基因生存分析Fig 2 Survival analysis of differential expression genes in primary and metastatic n=3)

2.3 骨肉瘤143B細(xì)胞中GPRC5A敲低或過表達(dá)效率驗(yàn)證

siGPRC5A組細(xì)胞中GPRC5A的mRNA和蛋白表達(dá)水平低于siNeg組(P<0.01,P<0.05)(圖3A～C)；GPRC5A組細(xì)胞中GPRC5A的mRNA和蛋白表達(dá)水平顯著高于EGFP組(P<0.01)(圖3D～F)。

A.after transfection with siGPRC5A, the expression of GPRC5A were detected by RT-qPCR; B.Western blot; C.quantitative analysis of Western blot; D.after transfection with GPRC5A over-expression plasmid, the expression of GPRC5A were detected by RT-qPCR; E: Western blot; F: quantitative analysis of Western blot; *P<0.05，**P<0.01 compared with siNeg or EGFP圖3 RT-qPCR和Western blot檢測各組細(xì)胞中GPRC5A表達(dá)水平Fig 3 RT-qPCR and Western blot detected the expression levels of GPRC5A in different n=3)

2.4 GPRC5A對骨肉瘤細(xì)胞增殖的影響

與siNeg組相比，siGPRC5A組細(xì)胞增殖能力無顯著改變(圖4A)。與EGFP組相比，GPRC5A組細(xì)胞增殖能力無顯著改變(圖4B)。

2.5 GPRC5A對骨肉瘤細(xì)胞遷移和侵襲的影響

GPRC5A組24 h后劃痕愈合明顯，而siGPRC5A組24 h后未見明顯愈合(圖5A，B)。GPRC5A組24 h后侵襲穿過Transwell小室和基質(zhì)膠的細(xì)胞數(shù)目明顯增多，而siGPRC5A組24 h后穿過Transwell小室和基質(zhì)膠的細(xì)胞數(shù)目顯著減少(圖5C)。

2.6 GPRC5A對骨肉瘤細(xì)胞EMT相關(guān)基因表達(dá)的影響

敲低143B細(xì)胞中GPRC5A的水平，可引起E-Cad的mRNA和蛋白水平顯著升高, Vim的mRNA和蛋白水平顯著降低(圖6A～C)，而GPRC5A過表達(dá)143B細(xì)胞中E-Cad的mRNA和蛋白水平顯著降低，N-Cad和Vim的mRNA和蛋白水平顯著升高(圖6D～F)。

A.after transfection with siGPRC5A, the expression of EMT associated genes were detected by RT-qPCR; B.Western blot; C.quantitative analysis of Western blot; D.after transfection with GPRC5A over-expression plasmid, the expression of EMT associated genes was detected by RT-qPCR; E.Western blot; F.quantitative analysis of Western blot; *P<0.05，**P<0.01 compared with siNeg or EGFP group圖6 GPRC5A對骨肉瘤細(xì)胞EMT相關(guān)基因mRNA和蛋白表達(dá)的影響Fig 6 Effect of GPRC5A on the mRNA and protein levels EMT associated markers of osteosarcoma n=3)

3 討論

GPRC5A(G protein-coupled receptor family C, member 5, group A)是G蛋白偶聯(lián)受體C型家族5A基因的簡稱，位于人12號染色體上，其編碼的蛋白質(zhì)含有7個跨膜結(jié)構(gòu)域，廣泛參與細(xì)胞內(nèi)信號傳導(dǎo)，并參與調(diào)控細(xì)胞增殖、分化、凋亡等生物學(xué)過程，與腫瘤的發(fā)生、發(fā)展、轉(zhuǎn)移密切相關(guān)[3-4]。目前關(guān)于GPRC5A與腫瘤的研究集中在肺癌、胃癌和乳腺癌中， 研究表明[5]，GPRC5A是肺癌特異的抑癌基因，但在胃癌和乳腺癌中，高表達(dá)的GPRC5A能起到癌基因的作用，而GPRC5A在骨肉瘤中的作用目前還未見報道。

本研究通過分析公共數(shù)據(jù)庫發(fā)現(xiàn)GPRC5A在骨肉瘤轉(zhuǎn)移瘤中高表達(dá)并與患者的生存密切相關(guān)，并且在腫瘤組織中的表達(dá)也高于相應(yīng)的正常組織，提示GPRC5A在骨肉瘤的發(fā)生和轉(zhuǎn)移中可能發(fā)揮重要作用。為進(jìn)一步探究GPRC5A在骨肉瘤中的作用，本研究檢測GPRC5A敲低或過表達(dá)對骨肉瘤細(xì)胞增殖、遷移和侵襲的影響，結(jié)果表明，GPRC5A不影響骨肉瘤細(xì)胞增殖，GPRC5A過表達(dá)的骨肉瘤細(xì)胞遷移和侵襲能力顯著提高，敲低骨肉瘤細(xì)胞中GPRC5A表達(dá)水平能顯著抑制骨肉瘤細(xì)胞的遷移和侵襲，這些結(jié)果表明GPRC5A能促進(jìn)骨肉瘤的轉(zhuǎn)移。

上皮-間充質(zhì)轉(zhuǎn)化(epithelial-mesenehymal transition, EMT)是具有黏附性的上皮細(xì)胞失去極性，向無極性的具有高度遷移和侵襲能力的間質(zhì)細(xì)胞轉(zhuǎn)化的過程[6]，伴隨著上皮表型蛋白如E-cad的減少，間充質(zhì)表型蛋白如N-cad, Vim的增多[7]。本研究表明，GPRC5A過表達(dá)能引起間充質(zhì)表型蛋白N-Cad和Vim的水平顯著升高，敲低骨肉瘤細(xì)胞中GPRC5A可引起上皮表型蛋白E-Cad顯著升高，說明GPRC5A過表達(dá)可能是通過促進(jìn)骨肉瘤細(xì)胞發(fā)生EMT進(jìn)而促進(jìn)其遷移和侵襲。不過，本研究僅從細(xì)胞水平探究GPRC5A對骨肉瘤細(xì)胞遷移和侵襲的影響，而骨肉瘤的轉(zhuǎn)移是一個在體發(fā)生的多階段、多因素參與的復(fù)雜過程[8]，因此，在動物水平上驗(yàn)證GPRC5A對骨肉瘤轉(zhuǎn)移的影響有待后續(xù)進(jìn)一步研究。

綜上所述，本研究表明，GPRC5A能通過誘導(dǎo)EMT促進(jìn)骨肉瘤細(xì)胞遷移和侵襲，并與骨肉瘤患者生存密切相關(guān)，可作為抗骨肉瘤轉(zhuǎn)移藥物潛在作用靶點(diǎn)。