段俊偉 倪文

肝細(xì)胞癌(hepatocellular carcinoma，HCC)是一種實(shí)質(zhì)性臟器的高惡性度腫瘤，疾病進(jìn)展快，預(yù)后多不佳[1]。肝癌治愈的唯一方法仍為手術(shù)切除，化療藥物已成為治療肝癌的治療手段之一，但肝癌細(xì)胞對(duì)不少化療藥物存在明顯耐藥，增加了臨床治療難度[2]。隨著分子靶向治療藥物的不斷開拓，索拉非尼是 NCCN 指南推薦的晚期肝癌治療的首選方案[3]。 但索拉非尼長(zhǎng)期服用會(huì)出現(xiàn)耐藥，延長(zhǎng)肝癌患者生存期僅不足 3 個(gè)月，最終導(dǎo)致治療失敗[4]。索拉非尼于2008年作為第一個(gè)HCC的全身治療藥物獲批上市，索拉非尼在臨床上的口服制劑為多激酶抑制劑，可抑制VEGF、KIT以及下游Raf信號(hào)等并直接抑制腫瘤的增殖以及腫瘤新生血管的生成[5,6]。本研究擬首先建立親本SMMC-7721細(xì)胞株以及SMMC-7721-SR耐藥株，而后檢測(cè)索拉非尼對(duì)細(xì)胞活性的抑制作用，借此探討NRF2/PI3K相關(guān)通路與HCC患者索拉非尼耐藥發(fā)生風(fēng)險(xiǎn)之間的關(guān)聯(lián)機(jī)制。

資料與方法

一、細(xì)胞株的培養(yǎng)建立

親本的SMMC-7721細(xì)胞株培養(yǎng)通過將細(xì)胞株均接種于胎牛血清完成(胎牛血清，取濃度10%，且含高糖 DMEM)，培養(yǎng)箱孵育(孵育條件： 37 ℃、5% CO2)；隨后將肝癌SMMC-7721細(xì)胞在索拉非尼培養(yǎng)液中培養(yǎng)(0.5 μmol/L)，待培養(yǎng)穩(wěn)定后使用濃度梯度遞增法完成耐藥細(xì)胞株的建立(即SMMC-7721-SR細(xì)胞株)，直至細(xì)胞能在索拉非尼的培養(yǎng)液中穩(wěn)定生長(zhǎng)。

二、NRF2-siRNA質(zhì)粒構(gòu)建和轉(zhuǎn)染

構(gòu)建NRF2-siRNA質(zhì)粒，按照 lipofectamine 2 000 的操作說(shuō)明對(duì)肝癌細(xì)胞SMMC-7721進(jìn)行轉(zhuǎn)染，驗(yàn)證質(zhì)粒及 siRNA 的轉(zhuǎn)染效率。siRNA 序列參照文獻(xiàn)設(shè)計(jì)并由上海吉瑪制藥技術(shù)有限公司合成。 序列為：(1)NRF2 正義鏈：GCACCUUAUAUCUCGA-AGUTT；反義鏈：ACUUCGAGAUAUAAGGUGC-TT。對(duì)照siRNA:正義鏈：UUCUCCGAACGUGUC-ACGUdTdT；反義鏈：ACGUGACACGUUCGGAG-AAdTdT。

三、細(xì)胞存活率的測(cè)定

細(xì)胞存活率測(cè)定在本次研究中使用CCK-8法檢測(cè)完成：抑制NRF2 mRNA表達(dá)并給予索拉非尼處理后，SMMC-7721細(xì)胞株及SMMC-7721-SR細(xì)胞株換培養(yǎng)液后接種于96孔板中，換培養(yǎng)基繼續(xù)培養(yǎng)(培養(yǎng)基添加10ul 的CCK8，培養(yǎng)時(shí)間2 h)，測(cè)定OD值，計(jì)算細(xì)胞存活率。

四、細(xì)胞凋亡率的測(cè)定

對(duì)于SMMC-7721細(xì)胞株，抑制NRF2 mRNA表達(dá)并給予索拉非尼處理，完成細(xì)胞株以及耐藥株細(xì)胞懸液的制作，采用TUNEL試劑盒進(jìn)行逐步操作。在顯微鏡下查找熒光陽(yáng)性細(xì)胞，判斷SMMC-7721細(xì)胞株及SMMC-7721-SR細(xì)胞的凋亡率。

五、檢測(cè)相關(guān) mRNA表達(dá)

借助Real-time PCR完成相關(guān)mRNA 的定量測(cè)定，使用Trizol提取總RNA，逆轉(zhuǎn)錄，完成PCR實(shí)驗(yàn)。比較閾值循環(huán)數(shù)(cycle threshold, CT)值等。

六、Western Blot檢測(cè)NRF2、Keap1、ARE以及PI3K、Akt蛋白的表達(dá)

取肝癌細(xì)胞冰上裂解2 h并低溫離心，提取組織中蛋白上清液，加入20 μg/μL蛋白樣品至SDS凝膠(10%)，電泳轉(zhuǎn)膜，隨后分別加入對(duì)應(yīng)的抗體，使用堿性磷酸酶二抗進(jìn)行抗體孵育，顯色劑DAB顯色。計(jì)算各組條帶中NRF2、Keap1、ARE、PI3K和Akt蛋白表達(dá)量。

七、統(tǒng)計(jì)學(xué)處理

結(jié) 果

一、細(xì)胞存活率測(cè)定結(jié)果

索拉非尼可明顯抑制肝癌細(xì)胞SMMC-7721的存活率(P<0.05)，索拉非尼對(duì)SMMC-7721-SR細(xì)胞存活率沒有明顯影響(P>0.05)。抑制NRF2 mRNA表達(dá)并給予索拉非尼處理后，SMMC-7721-SR細(xì)胞存活率明顯降低(P<0.05)。

二、細(xì)胞凋亡率測(cè)定結(jié)果

與對(duì)照組對(duì)比分析結(jié)果提示，索拉非尼可增加SMMC-7721 凋亡 (P<0.05)；與耐藥細(xì)胞株對(duì)比，其對(duì)SMMC-7721的凋亡促進(jìn)作用更強(qiáng)(P<0.05)。抑制NRF2 mRNA表達(dá)并給予索拉非尼處理，耐藥細(xì)胞凋亡率增加(P<0.05)。

四、Real-Time PCR檢測(cè)基因水平表達(dá)

SMMC-7721-SR細(xì)胞中NRF2 mRNA表達(dá)明顯高于SMMC-7721細(xì)胞，Keap1、ARE、PI3K和Akt mRNA表達(dá)明顯增加(P<0.05)。抑制NRF2 mRNA表達(dá)并給予索拉非尼處理后，NRF2、Keap1、ARE、PI3K和Akt mRNA表達(dá)明顯降低(P<0.05)。

五、Western Blot檢測(cè)蛋白含量表達(dá)

SMMC-7721-SR細(xì)胞中NRF2 蛋白水平明顯高于SMMC-7721細(xì)胞，Keap1、ARE、p-PI3K和p-Akt蛋白水平明顯增加(P<0.05)。抑制NRF2 mRNA表達(dá)并給予索拉非尼處理后，NRF2、Keap1、ARE、p-PI3K和p-Akt 蛋白水平明顯降低(P<0.05)。

討 論

肝癌作為第六大最常見的惡性腫瘤，占新發(fā)癌癥病例的5.7%，也是全球癌癥相關(guān)死亡的第二大殺手[7]，在成人的原發(fā)性肝腫瘤中，肝細(xì)胞癌(HCC)是最常見的[8-9]。索拉非尼單獨(dú)或與其他藥物聯(lián)合進(jìn)行局部靶向干預(yù)可以有效增加晚期肝癌患者的生存時(shí)間，美國(guó) FDA已經(jīng)批準(zhǔn)認(rèn)可索拉非尼作為干預(yù)晚期肝癌的重要靶向藥物[10]。索拉非尼的抗腫瘤功效主要通過抑制 Raf MEK ERK相關(guān)通路，可以有效阻止腫瘤的生長(zhǎng)，與此同時(shí)其還可以調(diào)控VEGF表達(dá)，間接減低腫瘤發(fā)生和進(jìn)展[11-14]。但長(zhǎng)期服藥索拉非尼，會(huì)引起患者出現(xiàn)獲得性耐藥[15]，因此探討相關(guān)耐藥機(jī)制并在此基礎(chǔ)上開發(fā)有效阻控干預(yù)意義重大。

本次研究中可見索拉非尼對(duì)肝癌細(xì)胞SMMC-7721的存活率具有明確的抑制作用，促進(jìn)細(xì)胞株凋亡；索拉非尼耐藥細(xì)胞株中腫瘤細(xì)胞凋亡明顯減少。提示索拉非尼可以有效抑制SMMC-772活性，索拉非尼作用下，SMMC-7721細(xì)胞NRF2 蛋白水平及mRNA含量增高，另外本研究中分析的幾種蛋白水平也可見高表達(dá)，并且相關(guān)mRNA表達(dá)也增加，提示索拉非尼調(diào)控NRF2/PI3K信號(hào)通路，但對(duì)耐藥株SMMC-7721-SR的促凋亡作用并不明顯。抑制NRF2 mRNA表達(dá)并給予索拉非尼處理后，耐藥株SMMC-7721-SR細(xì)胞中NRF2/Keap1通路蛋白水平明顯降低，細(xì)胞存活率顯著降低，細(xì)胞凋亡率升高。說(shuō)明肝癌細(xì)胞下調(diào)siRNA-NRF2 基因后，促進(jìn)了耐藥株SMMC-7721-SR細(xì)胞出現(xiàn)凋亡，而非耐藥SMMC-7721細(xì)胞株索拉非尼單藥效果更為敏感， 抑制 NRF2 可逆轉(zhuǎn)肝癌對(duì)索拉非尼耐藥，索拉非尼持續(xù)作用直接導(dǎo)致NRF2/PI3K通路的激活，引發(fā)肝癌對(duì)索拉非尼獲得性耐藥。

表1 索拉非尼處理SMMC-7721細(xì)胞和SMMC-7721-SR細(xì)胞基因水平表達(dá)

表2 抑制NRF2 mRNA表達(dá)后，肝癌耐藥細(xì)胞SMMC-7721-SR基因水平表達(dá)

表3 索拉非尼處理SMMC-7721細(xì)胞和SMMC-7721-SR細(xì)胞基因水平表達(dá)

表4 抑制NRF2 mRNA表達(dá)后，肝癌耐藥細(xì)胞SMMC-7721-SR基因水平表達(dá)