徐梓馨 羅昕 羅聲政 徐銘益 林仁坤

非酒精性脂肪性肝病(nonalchoholic fatty liver disease,NAFLD)是以脂肪在肝臟異位沉積為特征的一組臨床病理綜合征[1-2]。近年隨著生活水平的提高和飲食習(xí)慣的改變， NAFLD 的患病率不斷提高，但是對(duì)于NAFLD 發(fā)病機(jī)制的研究尚不完全清楚，治療選擇有限[3-5]。microRNA(miRNA)是一類(lèi)高度保守的組織特異性小非蛋白質(zhì)編碼RNA，在細(xì)胞生長(zhǎng)、分化和死亡等過(guò)程中起重要作用，其表達(dá)失調(diào)會(huì)引起疾病[6-7]。miRNA已被證明在嚙齒動(dòng)物和人類(lèi)肝病中具有預(yù)后和預(yù)測(cè)價(jià)值[8-10]。文獻(xiàn)報(bào)道m(xù)iR-27、miR141、miR-212-5p、miR-122、miR-34a和miR-16等在慢性肝病中發(fā)揮重要作用[12-16]。研究發(fā)現(xiàn)，miR-27參與調(diào)節(jié)脂肪細(xì)胞和巨噬細(xì)胞中的脂質(zhì)代謝，并與動(dòng)脈粥樣硬化的發(fā)生發(fā)展有關(guān)[17]。

研究表明，轉(zhuǎn)分化(或“激活”)的肝星狀細(xì)胞是分泌基質(zhì)蛋白的成肌纖維細(xì)胞的主要細(xì)胞來(lái)源，是肝纖維化的主要驅(qū)動(dòng)力[18]。本研究通過(guò)觀察過(guò)表達(dá) miR -27a 之后肝星狀細(xì)胞脂質(zhì)沉積變化和相關(guān)脂質(zhì)代謝蛋白的表達(dá)水平，以及脂肪肝模型小鼠 miR -27a 表達(dá)水平和相關(guān)脂質(zhì)代謝蛋白水平的變化，探討肝星狀細(xì)胞中 miR -27a 表達(dá)水平與肝脂肪變的關(guān)系。

資料與方法

一、材料與試劑

實(shí)驗(yàn)小鼠購(gòu)于中國(guó)科學(xué)院上海實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心，LX2細(xì)胞保存于上海市第一人民醫(yī)院臨床轉(zhuǎn)化院實(shí)驗(yàn)室，DMEM培養(yǎng)基、胎牛血清購(gòu)自美國(guó) Hyclone公司、0.25%的胰蛋白酶、膠原酶Ⅰ均購(gòu)自上海曜登生物科技有限公司，LipofectamineTM2000 脂質(zhì)體轉(zhuǎn)染試劑盒、磷酸鹽緩沖液(phosphate buffer saline，PBS)購(gòu)自上海碧云天生物技術(shù)有限公司；Trizol試劑購(gòu) 自 美 國(guó) Invitrogen公司，反轉(zhuǎn)錄試劑盒購(gòu)自日本 TaKaRa公司，SYBR GreenPCR 試劑盒購(gòu)自美國(guó) ApplideBiosystem公司，PCR引物序列由生工生物工程(上海)股份有限公司合成，HE、天狼星紅染色試劑購(gòu)于上海萌椏生物科技有限公司。

二、方法

(一)實(shí)驗(yàn)動(dòng)物 健康雄性C57BL/6小鼠10只，SPF級(jí)，約 4周齡，體質(zhì)量 12～15 g，由中國(guó)科學(xué)院上海實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心提供，飼養(yǎng)于上海交通大學(xué)附屬第一人民醫(yī)院實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心，自由飲水，溫度濕度符合標(biāo)準(zhǔn)，實(shí)驗(yàn)小鼠隨機(jī)分為普通飲食加CCL4組、高脂加CCL4組，每組各5只，均腹腔注射CCL4,分別給予普通飼料，高脂飼料喂養(yǎng)，喂養(yǎng)至8周處死，部分肝組織放于14% 甲醛溶液中，石蠟包埋組織學(xué)染色；同時(shí)留取少量組織存放于-80℃冰箱用于后續(xù)PCR。

(二)細(xì)胞培養(yǎng) 采用含10%FBS的DMEM培養(yǎng)基培養(yǎng)人星狀細(xì)胞，置于 37℃、體積分?jǐn)?shù)為0.05的CO2培養(yǎng)箱中進(jìn)行培養(yǎng)。加入 0.25% 的胰蛋白酶消化細(xì)胞，并進(jìn)行傳代。傳代時(shí)，將細(xì)胞懸液均勻地分配至細(xì)胞培養(yǎng)皿中，完全培養(yǎng)基補(bǔ)充至每皿 6 mL，繼續(xù)培養(yǎng)，根據(jù)需要收集細(xì)胞,用于PCR、油紅染色實(shí)驗(yàn)。

(三)肝臟組織病理檢查 肝組織固定48 h后，常規(guī)脫水、透明和石蠟包埋。以4 μm厚度進(jìn)行石蠟組織切片， HE和天狼猩紅染色，光學(xué)顯微鏡下檢測(cè)其病理程度并拍照。

(四)過(guò)表達(dá) miR-27a的LX2細(xì)胞建立 取生長(zhǎng)狀態(tài)良好的LX2細(xì)胞接種于6孔板中，每孔加入 2×105個(gè)細(xì)胞，當(dāng)細(xì)胞融合度達(dá)到80%左右時(shí)，使用 LipofectamineTM2000轉(zhuǎn)染試劑盒進(jìn)行轉(zhuǎn)染， 瞬時(shí)轉(zhuǎn)染按照說(shuō)明書(shū)進(jìn)行。設(shè)置空白對(duì)照組、過(guò)表達(dá)組(miR-27a)，轉(zhuǎn)染濃度為50 nmol/mL 的miR27a mimics，轉(zhuǎn)染48 h；

(五)qRT-PCR 法檢測(cè) miR-27a、FAS、SCD1相對(duì)表達(dá)量 按照試劑說(shuō)明書(shū)采用TRIzol法提取總RNA并純化, 利用 Nanodrop 系統(tǒng)測(cè)定 RNA 樣品的濃度和純度，檢測(cè) 260 nm 和 280 nm 下吸光度(A)值，判斷樣品純度是否符合實(shí)驗(yàn)要求。測(cè)定RNA濃度。反轉(zhuǎn)錄合成cDNA后行RT-PCR。RT-PCR引物序列見(jiàn)表1。實(shí)驗(yàn)過(guò)程中以U6 、β-actin分別作為miRNA-27a、FAS、SCD1 的內(nèi)參對(duì)照, 進(jìn)行標(biāo)準(zhǔn)化轉(zhuǎn)換得到各樣本的拷貝數(shù)(Ct 值), 樣品目的基因的相對(duì)表達(dá)率(Relative expression，RQ)采用 △△CT 方法計(jì)算，RQ=2-△△CT。每個(gè)樣品的內(nèi)參基因和靶基因各設(shè)3個(gè)重復(fù)試驗(yàn)。

表1 qRT-PCR相關(guān)引物序列

(七)油紅染色檢測(cè)脂質(zhì)沉積程度 棄掉培養(yǎng)液，用PBS輕緩清洗3次，加入10%多聚甲醛固定30 min后，按照儲(chǔ)備液：稀釋液=5：2的比例配制染色液，配好后用慢速濾紙濾過(guò)，染色10 min，染液體積覆蓋住孔板即可，用60%異丙醇漂洗，除去多余染料，保持背景色干凈，復(fù)染12 s，封片，鏡檢。

三、統(tǒng)計(jì)學(xué)分析

正態(tài)分布的計(jì)量資料以均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差表示，采用 SPSS16.0 統(tǒng)計(jì)軟件分析。兩組間比較采用獨(dú)立樣本t檢驗(yàn)，3組間采用方差分析，偏態(tài)分布時(shí)采用非參數(shù)檢驗(yàn)，P<0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

結(jié) 果

一、小鼠肝組織病理檢查

HE染色結(jié)果顯示普通飲食加CCL4組肝小葉結(jié)構(gòu)不完整，中央靜脈周?chē)渭?xì)胞索排列紊亂，匯管區(qū)可見(jiàn)有炎性細(xì)胞浸潤(rùn),部分肝細(xì)胞點(diǎn)狀壞死。高脂加CCL4組肝組織可見(jiàn)肝小葉結(jié)構(gòu)不完整，中央靜脈周?chē)渭?xì)胞索明顯紊亂,匯管區(qū)肝細(xì)胞片狀壞死，同時(shí)可見(jiàn)中央靜脈周?chē)渭?xì)胞脂肪變性，出現(xiàn)大量大小不等的脂滴泡。天狼星紅染色顯示，普通飲食加CCL4組和高脂加CCL4組均有纖維增生，可見(jiàn)明顯染色成紅色的纖維間隔，如圖1。

圖1 各組小鼠肝組織光鏡下表現(xiàn) A、B：HE染色(×100)；C、D：天狼星紅染色結(jié)果(×100)

二、miR-27a在高脂加CCL4組小鼠肝組織中表達(dá)下降

在高脂加CCL4組小鼠肝組織中，miR-27a相對(duì)表達(dá)水平為(0.230±0.001,P=0.02)，普通飲食加CCL4組小鼠肝組織中miR-27a相對(duì)表達(dá)水平為(1.00±0.0021)，高脂加CCL4組miR-27a表達(dá)明顯下降，說(shuō)明在CCL4誘導(dǎo)肝纖維化的情況下，高脂誘導(dǎo)肝臟脂肪變時(shí)miR-27a表達(dá)水平也會(huì)下降。

三、高脂加CCL4組小鼠肝臟組織中FAS、SCD1相關(guān)mRNA表達(dá)上升：

FAS、SCD1均為促進(jìn)脂肪酸合成的關(guān)鍵酶。普通飲食加CCL4組FAS與SCD1分別為(1.00±0.016)、(1.00±0.032)，高脂加CCL4組小鼠肝組織中FAS、SCD1相關(guān)的mRNA表達(dá)量明顯增高，分別為(2.23±0.24)，P=0.0267，(1.98±0.17)，P=0.011；說(shuō)明在高脂喂養(yǎng)的情況下，F(xiàn)AS、SCD1的表達(dá)可增強(qiáng)，提示脂肪酸合成增強(qiáng)。

四、PA刺激后LX2細(xì)胞中miR-27a表達(dá)下降

對(duì)照組miR-27a表達(dá)為(1.00±0.131), 200 μmol/L、400 μmol/L PA刺激LX2細(xì)胞后miR-27a 的相對(duì)表達(dá)量為分別為(0.333±0.003，P=0.0024)和(0.413±0.005，P=0.001)，PA刺激常用來(lái)誘導(dǎo)細(xì)胞脂肪變性，提示在脂肪變性的LX2細(xì)胞中miR-27a的表達(dá)可能受到抑制。

五、過(guò)表達(dá)miR-27a后LX2細(xì)胞脂質(zhì)沉積減輕

空白對(duì)照組細(xì)胞輪廓稍變圓，細(xì)胞內(nèi)可見(jiàn)散在紅色脂滴分布，位于細(xì)胞膜內(nèi)側(cè)邊緣。在過(guò)表達(dá)miR-27a后48 h，LX2細(xì)胞內(nèi)鮮見(jiàn)脂滴，胞內(nèi)可見(jiàn)細(xì)胞核，邊緣清晰。如圖2。

圖2 空白對(duì)照組(A)和miRNA-27a過(guò)表達(dá)組(B)油紅染色(×200)

六、在過(guò)表達(dá)miR-27a后LX2細(xì)胞FAS、SCD1的mRNA表達(dá)下降

對(duì)照組FAS、SCD1相關(guān)mRNA表達(dá)量分別為(1.00±0.085)和(1.00±0.034) ，miR-27a過(guò)表達(dá)組中FAS、SCD1相關(guān)mRNA表達(dá)量分別為(0.21±0.001)和(0.35±0.005)，與對(duì)照組比較，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(均P<0.05)，說(shuō)明miR-27a過(guò)表達(dá)可能抑制FAS、SCD1的表達(dá)，F(xiàn)AS、SCD1均為促進(jìn)脂肪酸合成的關(guān)鍵因素，提示miR-27a可能通過(guò)抑制下游靶基因FAS、SCD1抑制肝星狀細(xì)胞脂質(zhì)代謝。

討 論

文獻(xiàn)報(bào)道，miR-27在肝臟脂質(zhì)代謝紊亂時(shí)表達(dá)受到抑制[19]。Zhang等[20]發(fā)現(xiàn)在肝原代細(xì)胞中，miR-27a能通過(guò)抑制脂肪酸合酶(fatty acid synthase，F(xiàn)AS)和硬脂酰輔酶A去飽和酶1(stearoyl-CoA desaturase 1 ，SCD1)調(diào)節(jié)肝臟脂質(zhì)代謝從而減輕NAFLD。FAS、SCD1是高等動(dòng)物內(nèi)源性脂肪酸合成的重要的酶，其在肝臟中的表達(dá)水平與肝臟脂肪變性的程度相關(guān)[21-23]。肝星狀細(xì)胞的活化一直被認(rèn)為是肝纖維化發(fā)生的啟動(dòng)步驟[18]，但肝星狀細(xì)胞在脂肪肝發(fā)生發(fā)展過(guò)程的變化鮮見(jiàn)報(bào)道。本課題組前期實(shí)驗(yàn)發(fā)現(xiàn)，在PA誘導(dǎo)脂肪變性的肝星狀細(xì)胞中miR-27a相對(duì)表達(dá)量出現(xiàn)顯著下降，說(shuō)明肝星狀細(xì)胞脂肪變性時(shí)，miR-27a的表達(dá)也會(huì)受到抑制。同時(shí)檢測(cè)小鼠肝臟組織中miR-27a的相對(duì)表達(dá)量發(fā)現(xiàn)，相比較普食加CCL4組的小鼠，高脂加CCL4組小鼠miR-27a表達(dá)量也明顯下降， miR-27a的表達(dá)在脂肪變性的肝細(xì)胞中受到抑制[21]。本實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明在肝臟脂肪變性時(shí)，miR-27a的表達(dá)不僅會(huì)在肝細(xì)胞中受抑制，肝星狀細(xì)胞也會(huì)出現(xiàn)同樣的現(xiàn)象。將肝星狀細(xì)胞過(guò)表達(dá)miR-27a，油紅檢測(cè)脂質(zhì)沉積發(fā)現(xiàn)，相比對(duì)照組，過(guò)表達(dá)組肝星狀細(xì)胞中脂質(zhì)沉積明顯減輕，說(shuō)明在肝星狀細(xì)胞中，miR-27a可能是通過(guò)抑制脂質(zhì)沉積來(lái)減緩脂肪變性的進(jìn)程；同時(shí)PCR結(jié)果顯示，過(guò)表達(dá)miR-27a后的肝星狀細(xì)胞中促脂肪酸合成因子FAS、SCD1的mRNA表達(dá)量均顯著下降，而高脂加CCL4組小鼠肝組織FAS、SCD1相關(guān)mRNA表達(dá)量顯著高于普食加CCL4組小鼠的表達(dá)水平，提示在肝星狀細(xì)胞中，miR-27a可能是通過(guò)抑制這兩種酶的表達(dá)導(dǎo)致脂肪酸合成減少進(jìn)而抑制脂質(zhì)沉積，逆轉(zhuǎn)脂肪變的發(fā)生發(fā)展。

本研究中結(jié)果表明，miR-27a可抑制肝星狀細(xì)胞的脂質(zhì)代謝，這一作用的發(fā)揮可能是通過(guò)促進(jìn)FAS、SCD1在脂質(zhì)代謝過(guò)程的作用，但是進(jìn)一步的相關(guān)機(jī)制尚未清楚。探討肝星狀細(xì)胞中 miR -27a 表達(dá)水平與肝脂肪變的關(guān)系，可為研究肝脂肪變提供一個(gè)不同的思路。