李靜，王金銘，任琛琛，楊立，劉泇希，白楊

卵巢癌是常見的婦科惡性腫瘤，在卵巢腫瘤中它的發(fā)病率占50%～70%［1］。在早期，卵巢癌多無明顯表現(xiàn)，具有較高的病死率［1-2］。目前研究的主要理論認(rèn)為：細(xì)胞的過度增殖和侵襲力的異常參與了腫瘤的發(fā)生發(fā)展［2］，微小RNA（microRNA，miRNA）和卵巢癌的發(fā)生發(fā)展存在密切關(guān)系，通過對下游靶基因的調(diào)控表達(dá)，miRNA 影響了細(xì)胞的增殖和侵襲能力，可能導(dǎo)致卵巢癌的發(fā)生發(fā)展［3］。其中，miR-558 是目前被發(fā)現(xiàn)參與腫瘤發(fā)生發(fā)展過程的一種非常重要的新的癌基因，但是miR-558在卵巢癌組織中的表達(dá)以及miR-558 在卵巢癌發(fā)生發(fā)展過程中的作用機(jī)制尚不明確，并且miR-558和叉頭框轉(zhuǎn)錄因子C1（FOXC1）之間的調(diào)控關(guān)系尚未見報道［4］。本研究主要探討miR-558 在卵巢癌組織中的表達(dá)情況、miR-558 與FOXC1 基因之間的調(diào)控關(guān)系和miR-558 對人卵巢癌腺癌細(xì)胞SKOV3 細(xì)胞增殖、侵襲能力的影響，在卵巢癌的發(fā)生機(jī)制及治療思路方面提供一些新的方向。

1 資料與方法

1.1 一般資料選擇2014年1月至2017年12月鄭州大學(xué)第三附屬醫(yī)院婦產(chǎn)科同期收治的25 例上皮性卵巢癌、25例交界性卵巢上皮性腫瘤和25例良性卵巢上皮性腫瘤病人，經(jīng)過知情同意，取其手術(shù)切除的部分卵巢組織標(biāo)本；上皮性卵巢癌組年齡范圍為35～76 歲，臨床分期Ⅰ～Ⅱ期6 例、Ⅲ～Ⅳ期19 例，中高分化10例、低分化15例；交界性卵巢上皮性腫瘤組年齡范圍為39～65歲，臨床分期Ⅰ～Ⅱ期12例、Ⅲ～Ⅳ期13例，中高分化13例、低分化12例；良性卵巢上皮性腫瘤組年齡范圍為31～55歲。本研究符合《世界醫(yī)學(xué)協(xié)會赫爾辛基宣言》相關(guān)要求。病人對研究方案均簽署了知情同意書。由第四軍醫(yī)大學(xué)病原微生物學(xué)教研室惠贈卵巢腺癌細(xì)胞系SKOV3細(xì)胞。

1.2 方法

1.2.1主要試劑 從廣州銳博科技有限公司購買miR-558 的模擬物、抑制物及陰性對照。miR-558、小核RNA6（U6）的特異性引物、FOXC1 的引物由上海生工生物工程有限公司合成。β-肌動蛋白（β-actin）抗體、FOXC1 抗體購買于美國Abcam 生物技術(shù)有限公司。實時熒光定量PCR 試劑盒購買于北京鼎國公司產(chǎn)品。

1.2.2驗證 miR-558對FOXC1基因的調(diào)控作用借助于權(quán)威的生物信息學(xué)靶基因預(yù)測網(wǎng)站（PicTar、mi-Randa 和 TargetScan），將 miR-558 的名稱和物種輸入，預(yù)測與miR-558相關(guān)的靶基因FOXC1；通過熒光素酶報告基因?qū)嶒灒炞CmiR-558對FOXC1基因的靶向調(diào)控作用，構(gòu)建熒光素酶報告基因載體質(zhì)粒［（含有FOXC1 基因3’-非翻譯區(qū)（UTR）中潛在結(jié)合位點）］，野生型FOXC1基因3’-UTR（野生型-FOXC1-2-3’-UTR）和突變型FOXC1 基因3’-UTR（突變型-FOXC1-3’-UTR），放入-20 ℃冰箱保存?zhèn)溆?。把質(zhì)粒和miR-558共同轉(zhuǎn)染到SKOV3細(xì)胞系中，培養(yǎng)48 h，用熒光素酶活性檢測試劑盒測定并計算海腎熒光素酶與螢火蟲熒光素酶的比值，以此值表示細(xì)胞熒光素酶的水平。

1.2.3細(xì)胞培養(yǎng)及轉(zhuǎn)染 在RPMI1640 培養(yǎng)基中（含1%青霉素及鏈霉素及10%胎牛血清）加入SKOV3 細(xì)胞，恒溫培養(yǎng)箱的溫度為37 ℃，含5%二氧化碳，后續(xù)實驗選取對數(shù)生長期的SKOV3 細(xì)胞；選取并計數(shù)對數(shù)生長期的SKOV3 細(xì)胞，按照2.0×105個/孔接種到6 孔培養(yǎng)板中進(jìn)行培養(yǎng)。轉(zhuǎn)染在細(xì)胞生長態(tài)勢較好的時候進(jìn)行。將轉(zhuǎn)染實驗細(xì)胞分成三組，分別為miR-558 模擬物組、miR-558 抑制物組及陰性對照組。將miRNA 轉(zhuǎn)染到SKOV3 細(xì)胞中，miRNA 由羧基熒光素（Carboxyfluorescein，F(xiàn)AM）標(biāo)記。轉(zhuǎn)染之前，充分混合miRNA 和轉(zhuǎn)染試劑，在室溫下放置5 min，然后放置到培養(yǎng)箱的細(xì)胞培養(yǎng)板內(nèi)，開始轉(zhuǎn)染反應(yīng)；轉(zhuǎn)染24 h 以后，在200 倍光鏡及熒光顯微鏡下分別觀察并計數(shù)，把表達(dá)熒光蛋白的細(xì)胞作為陽性細(xì)胞，計算其轉(zhuǎn)染效率，轉(zhuǎn)染效率為陽性細(xì)胞數(shù)與總細(xì)胞數(shù)的比值。

1.2.4實時熒光定量PCR 技術(shù)檢測 卵巢組織SKOV3 細(xì)胞中 miR-558 的表達(dá)水平以及 SKOV3 細(xì)胞中FOXC1 的mRNA 的表達(dá)水平將細(xì)胞的總RNA用Trizol一步法提取，濃縮，計算總RNA的純度和質(zhì)量。采用實時熒光定量PCR技術(shù)進(jìn)行試驗后，行融解曲線分析，每個實驗均重復(fù)3 次。對結(jié)果采用2-△△ct法分析（ct值為反應(yīng)的實時熒光強(qiáng)度明顯大于背景值時的循環(huán)數(shù)）。

1.2.5蛋白印跡法檢測 SKOV3 細(xì)胞中FOXC1 蛋白的表達(dá)水平提取總蛋白后測定濃度，依標(biāo)準(zhǔn)進(jìn)行凝膠電泳，封閉液進(jìn)行封閉，加入兔抗人FOXC1 一抗（1∶5 000 稀釋），在室溫下孵育2 h，然后洗滌3次，加入二抗，室溫下再孵育1 h，洗滌3次，把β-actin 作為內(nèi)參，分析其灰度值，計算FOXC1 蛋白的相對表達(dá)水平（FOXC1 蛋白與β-actin 的灰度值的比值）。該實驗重復(fù)進(jìn)行3次。

1.2.6CCK-8 法檢測 轉(zhuǎn)染后SKOV3 細(xì)胞的增殖情況將對數(shù)生長期的SKOV3 細(xì)胞接種于96 孔板中，在轉(zhuǎn)染后24、48、72、96 h，采用CCK-8 試劑盒來檢測細(xì)胞處于450 nm的吸光度（A）值并且記錄。計算細(xì)胞增殖率［（實驗組A值-空白對照組A值）/（對照組組A 值-空白對照組A 值）×100%］。本實驗重復(fù)進(jìn)行3次。

1.2.7基質(zhì)膠侵襲實驗檢測 轉(zhuǎn)染后SKOV3 細(xì)胞的侵襲力將轉(zhuǎn)染后24 h的SKOV3細(xì)胞進(jìn)行收集，細(xì)胞懸液加入到穿膜小室內(nèi)，培養(yǎng)36 h，取出小室，擦拭掉上室細(xì)胞，把那些已經(jīng)侵入并且貼附于下層微孔膜的細(xì)胞用多聚甲醛固定5 min，磷酸鹽緩沖液（PBS）清洗后在顯微鏡下觀察，隨機(jī)在每張微孔膜中選5個視野進(jìn)行細(xì)胞計數(shù)。此實驗重復(fù)進(jìn)行3次。

1.3 統(tǒng)計學(xué)方法使用SPSS 21.0 軟件包對實驗數(shù)據(jù)進(jìn)行統(tǒng)計分析。計量資料用±s 來表示，所有數(shù)據(jù)均進(jìn)行正態(tài)檢驗并且符合正態(tài)分布，采用單因素方差分析進(jìn)行多組間的比較，采用獨立樣本t檢驗對兩組間進(jìn)行比較。P＜0.05 時，差異有統(tǒng)計學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 驗證miR-558對FOXC1基因的靶向調(diào)節(jié)作用上述3個權(quán)威的生物信息學(xué)靶基因預(yù)測數(shù)據(jù)庫預(yù)測得出miR-558的靶基因是FOXC1，熒光素酶報告基因?qū)嶒烇@示，含有miR-558的質(zhì)粒以及含有FOXC1基因的重組質(zhì)粒共同轉(zhuǎn)染SKOV3細(xì)胞后，模擬物組熒光素酶相對活性為（0.56±0.01），陰性對照組熒光素酶相對活性為（1.12±0.02），與陰性對照組相比較，模擬物組的熒光素酶活性下降了49.50%（P＜0.05）。

2.2 卵巢組織中的miR-558 的相對表達(dá)水平比較實時熒光定量-PCR技術(shù)結(jié)果顯示，上皮性卵巢癌、交界性卵巢上皮性腫瘤和良性卵巢上皮性腫瘤病人卵巢組織中miR-558 的相對表達(dá)水平分別為（3.43±0.42）、（2.47±0.35）、（1.37±0.31)，各組之間兩兩比較，均差異有統(tǒng)計學(xué)意義（均P＜0.05）。

實時熒光定量-PCR技術(shù)的結(jié)果顯示，在miR-558模擬物組、抑制物組和陰性對照組中，SKOV3 細(xì)胞miR-558 的表達(dá)水平分別為（2.37±0.17）、（0.64±0.17）、（1.14±0.11），miR-558各組間兩兩比較，差異有統(tǒng)計學(xué)意義（均P＜0.05）；在miR-558模擬物組、抑制物組和陰性對照組中，SKOV3細(xì)胞的FOXC1基因轉(zhuǎn)錄出的mRNA的表達(dá)水平分別為（0.51±0.10）、（2.27±0.12）、（0.99±0.11），F(xiàn)OXC1的mRNA表達(dá)水平各組間兩兩比較，差異有統(tǒng)計學(xué)意義（均P＜0.05）。

蛋白印跡法結(jié)果顯示，在miR-558模擬物組、抑制物組和陰性對照組SKOV3細(xì)胞中，F(xiàn)OXC1蛋白的表達(dá)水平分別為（0.83±0.07）、（2.17±0.15）、（1.47±0.21），F(xiàn)OXC1 蛋白的表達(dá)水平各組間兩兩比較，差異有統(tǒng)計學(xué)意義（均P＜0.05）。

CCK-8 結(jié)果顯示，miR-558 模擬物組的細(xì)胞增殖率顯著高于陰性對照組，抑制物組細(xì)胞的細(xì)胞增殖率明顯低于陰性對照組，模擬物組中增殖率水平高于抑制物組，各組間兩兩比較，差異有統(tǒng)計學(xué)意義（均P＜0.05），見圖1。

圖1 卵巢癌組織CCK-8實驗結(jié)果

基質(zhì)膠侵襲實驗結(jié)果顯示，在miR-558 模擬物組、抑制物組和陰性對照組SKOV3 細(xì)胞中，SKOV3細(xì)胞穿透基底膜的細(xì)胞數(shù)分別為（158.33±9.45）、（67.01±10.58）、（117.67±16.86）（P＜0.05）。miR-558細(xì)胞侵襲力水平各組間兩兩比較，差異有統(tǒng)計學(xué)意義（均P＜0.05）。

3 討論

卵巢癌的發(fā)病率位居女性生殖系統(tǒng)惡性腫瘤的前3 位，而它的死亡率卻位居婦科惡性腫瘤之首［1］。據(jù)不完全統(tǒng)計，2015年，我國大約有5萬多名女性被確診為卵巢癌，約3 萬例病人死于卵巢癌［1-2］。腫瘤細(xì)胞異常的增殖和侵襲能力是惡性腫瘤的主要生物學(xué)特征，細(xì)胞的增殖和侵襲能力是影響癌癥治療和預(yù)后的重要因素。腫瘤細(xì)胞異常的增殖力與侵襲力相互作用，共同促進(jìn)癌細(xì)胞的生長，最終導(dǎo)致癌癥的發(fā)展轉(zhuǎn)移和化療耐藥［1，5-7］。因此，明確卵巢癌細(xì)胞增殖和侵襲能力過度的具體原因?qū)刂坡殉舶┑陌l(fā)生發(fā)展具有重大意義。腺癌是卵巢上皮性癌中的主要病理類型，本研究所選用的SKOV3 細(xì)胞系是卵巢腺癌細(xì)胞系能夠更為真實地反映卵巢癌的生物學(xué)特性。

miRNA 是小分子單鏈 RNA，由 21 至 23 個核苷酸組成，位于內(nèi)源非編碼區(qū)，通過與靶mRNA 特異性的堿基配對，將靶mRNA 降解，或者抑制它的翻譯，繼而實現(xiàn)對目的基因的調(diào)控［3］。miR-558 是miRNA 中的一種，位于人類2 號染色體p22.3，能夠調(diào)節(jié)環(huán)氧合酶2和白細(xì)胞介素-1β的表達(dá)，誘導(dǎo)人關(guān)節(jié)軟骨細(xì)胞分解代謝［4］。有研究表明，miR-558可通過調(diào)控細(xì)胞的凋亡、增殖以及細(xì)胞的遷移、侵襲等生物學(xué)行為從而參與腫瘤的進(jìn)展，如胃癌、成神經(jīng)細(xì)胞瘤［8，10］。Li Y等［9］通過研究發(fā)現(xiàn)，在膀胱癌病人體 內(nèi) ，環(huán) 狀 RNAHIPK3（circHIPK3）是 低 表 達(dá)的，circHIPK3 能夠抑制miR-558 的表達(dá)水平，降低乙酰肝素酶的表達(dá)，從而調(diào)控細(xì)胞的遷移和侵襲及膀胱癌的血管生成，由此提示我們，miR-558能夠促進(jìn)膀胱癌的腫瘤發(fā)生。華中科技大學(xué)同濟(jì)醫(yī)學(xué)院的 Qu H 教授團(tuán)隊［10］通過研究發(fā)現(xiàn) miR-558 能夠與缺氧誘導(dǎo)因子2的5’-非編碼區(qū)結(jié)合，促進(jìn)缺氧誘導(dǎo)因子2 的表達(dá)從而促進(jìn)成神經(jīng)細(xì)胞瘤細(xì)胞的生長、遷移、侵襲和血管生成，從而促進(jìn)腫瘤的發(fā)生，研究表明，高表達(dá)miR-558 的病人生存預(yù)后較差。同時Qu H教授團(tuán)隊［11］也在成神經(jīng)細(xì)胞瘤的細(xì)胞中，通過敲除內(nèi)源性miR-558 的表達(dá)，證實其能夠通過活化乙酰肝素酶促進(jìn)成神經(jīng)細(xì)胞瘤的腫瘤生成和侵襲。華中科技大學(xué)同濟(jì)醫(yī)學(xué)院的Zheng L 教授團(tuán)隊［8］發(fā)現(xiàn)在胃癌的體內(nèi)實驗和體外實驗中，miR-558 能夠識別乙酰肝素酶啟動子中的互補(bǔ)位點，以AGO蛋白家族成員1（Argonaute 1）依賴的方式結(jié)合SMAD 家族成員4（Smad4）降低Smad4的表達(dá)，從而促進(jìn)胃癌的進(jìn)展。這些研究與我們的結(jié)果相一致，從而更加明確了miR-558的致癌作用。

FOXC1 基因長約1787kb，位于人類6 號染色體p25.3，經(jīng)轉(zhuǎn)錄翻譯形成FOXC1 蛋白。最新的研究表明，F(xiàn)OXC1通過激活趨化因子受體4（CXCR4），能夠參與癌癥的發(fā)生發(fā)展，并且能夠與活化T-細(xì)胞核因子1（NFATC1）構(gòu)成基因遺傳軸參與疾病的發(fā)展［12］。本課題組的前期研究已經(jīng)通過QRT-PCR 技術(shù)和免疫組化法分析上皮性卵巢癌、交界性卵巢上皮性腫瘤和良性卵巢上皮性腫瘤病人的卵巢組織，明確在上皮性卵巢癌中FOXC1 的表達(dá)水平是降低的，與本次研究中的miR-558 的表達(dá)水平呈負(fù)向相關(guān)性［13-14］。同時本研究我們通過分析miRNA 靶基因預(yù)測（PicTar、miRanda 和TargetScan）數(shù)據(jù)庫和熒光素酶報告實驗明確了miR-558 對FOXC1 的靶向調(diào)控作用。本課題組通過前期研究發(fā)現(xiàn)在重組FOXC1慢病毒表達(dá)穩(wěn)定的SKOV3的細(xì)胞中，細(xì)胞的增殖和侵襲能力受到明顯抑制，在本次研究中我們進(jìn)一步通過細(xì)胞實驗明確了FOXC1 對卵巢癌細(xì)胞的增殖和侵襲能力的抑制作用是由miR-558 對FOXC1的靶向調(diào)控實現(xiàn)的［15］。

綜上所述，miR-558 通過靶向調(diào)控FOXC1 的表達(dá)，能夠促進(jìn)卵巢癌細(xì)胞的增殖和侵襲能力，這為卵巢癌的發(fā)病機(jī)制提供了重要的理論依據(jù)。但是miR-558在卵巢癌病人血清中的具體表達(dá)情況以及在卵巢癌裸鼠移植瘤動物模型中的具體作用尚不明確，且與卵巢癌病人生存預(yù)后之間的關(guān)系尚不清楚，這仍然是本課題組下一步要深入研究的重點。