楊 陽(yáng)，劉少靜，焦淑玲，曾寶平，毋 卓，權(quán)科佳，何孝文

(西安醫(yī)學(xué)院藥學(xué)院 藥物研究所，陜西 西安 710021)

α-二羰基化合物(α-dicarbonyl compounds，α-DCs)，如甲基乙二醛(MGO)、乙二醛(GO)等(圖1)，是在體內(nèi)和體外都能產(chǎn)生的化學(xué)和生物活性物質(zhì)。在體內(nèi)，α-DCs主要是由一些腸道細(xì)菌及人體細(xì)胞的代謝產(chǎn)生的，如細(xì)胞內(nèi)的糖酵解、酮體的新陳代謝、蘇氨酸的降解、磷酸丙糖的分裂等[1]。在體外，α-DCs主要存在于一些熱加工(如焙烤或油炸等)食品或者長(zhǎng)期儲(chǔ)存的食品中。

α-DCs是一類(lèi)具有高反應(yīng)活性的糖化因子，是晚期糖化終產(chǎn)物(AGEs)最重要的前體物質(zhì)。AGEs與相鄰蛋白上的游離氨基以共價(jià)鍵結(jié)合的形式形成交聯(lián)結(jié)構(gòu)，穩(wěn)定且不可逆， 導(dǎo)致蛋白質(zhì)的沉積和淀粉樣變性[2]，這也是AGEs涉及多種疾病(糖尿病腎病、糖尿病心肌病、糖尿病動(dòng)脈粥樣硬化、阿茨海默癥等)發(fā)病機(jī)制的重要原因[2-4]。醫(yī)學(xué)檢測(cè)發(fā)現(xiàn)，以上慢性疾病患者體液(血液、尿液、透析液等)內(nèi)α-DCs的水平與正常人的相比明顯偏高，這說(shuō)明α-DCs在體液內(nèi)濃度的升高很可能與這些慢性疾病的發(fā)生發(fā)展密切相關(guān)。因此，對(duì)食品中α-DCs進(jìn)行檢測(cè)可以指導(dǎo)糖尿病患者和正常人健康飲食，防止病情加重或降低患病幾率；而對(duì)血清、唾液等生物樣品中α-DCs進(jìn)行檢測(cè)可輔助診斷糖尿病及其并發(fā)癥。作者在此對(duì)α-DCs的檢測(cè)方法進(jìn)行綜述，并比較不同檢測(cè)方法的適用范圍和優(yōu)缺點(diǎn)。

圖1 常見(jiàn)α-DCs的結(jié)構(gòu)式Fig.1 Structure formula of common α-DCs

1 高效液相色譜法(HPLC)

HPLC法分離效率高、選擇性好、檢測(cè)靈敏度高、對(duì)樣品的適用范圍廣、不受分析對(duì)象揮發(fā)性和熱穩(wěn)定性的限制。測(cè)定α-DCs較為常用的檢測(cè)器有熒光檢測(cè)器、紫外檢測(cè)器和質(zhì)譜檢測(cè)器。

1.1 高效液相色譜-熒光檢測(cè)器聯(lián)用(HPLC-FLD)

由于α-DCs本身無(wú)固有熒光，直接使用熒光檢測(cè)法檢測(cè)會(huì)比較困難，需要先對(duì)α-DCs進(jìn)行衍生化。

苯甲醛及其衍生物適合作為α-DCs的熒光衍生化試劑。Kishikawa課題組[5]在乙酸銨(CH3COONH4)存在下，向α-DCs溶液中加入4-甲酯基苯甲醛(圖2)，改變待測(cè)物的檢測(cè)特性，以增加其對(duì)檢測(cè)器的響應(yīng)，混合后，在100 ℃加熱30 min后用熒光分光光度計(jì)對(duì)α-DCs進(jìn)行檢測(cè)，或者將混合物裝入HPLC系統(tǒng)再進(jìn)行定量分析。

圖2 4-甲酯基苯甲醛與α-DCs的衍生化反應(yīng)Fig.2 Derivatization reaction between 4-methoxycar-bonylbenzaldehyde with α-DCs

Palomino-Vasco課題組[6]以3,4-二氨基吡啶(3,4-DAP)為衍生化試劑，在90 ℃、pH值為2的條件下進(jìn)行120 min的衍生化反應(yīng)(圖3)，然后在優(yōu)化色譜條件下，采用HPLC-FLD法在4 min內(nèi)即可完成對(duì)葡萄酒中α-DCs的檢測(cè)。

圖3 3,4-DAP與α-DCs的衍生化反應(yīng)Fig.3 Derivatization reaction between 3,4-DAP with α-DCs

Ogasawara等[7]以1,2-二氨基-4,5-亞甲基二氧苯(DMB)為衍生化試劑，在60 ℃下進(jìn)行40 min的衍生化反應(yīng)(圖4)，然后采用HPLC-FLD法對(duì)人血漿中的MGO進(jìn)行檢測(cè)。結(jié)果表明，健康受試者血漿中MGO濃度在0.024～0.258 μmol·L-1之間，日內(nèi)和日間精密度的RSD值分別為2.55%和4.03%。

圖4 DMB與MGO的衍生化反應(yīng)Fig.4 Derivatization reaction between DMB with MGO

Wrobel課題組[8]以4-甲氧基鄰苯二胺(4-MPD)為衍生化試劑、二乙基乙二醛(DEGO)為內(nèi)標(biāo)物，采用HPLC-FLD法測(cè)定尿液中GO、MGO和DA，GO、MGO、DA的檢測(cè)限分別為0.46 μg·L-1、0.39 μg·L-1、0.28 μg·L-1，日內(nèi)精密度的RSD值小于6%。

1.2 高效液相色譜-紫外檢測(cè)器聯(lián)用(HPLC-UV)

α-DCs是一類(lèi)高度水溶且缺乏發(fā)色團(tuán)的化合物，可以通過(guò)對(duì)α-DCs的衍生化，引入一些具有紫外吸收的基團(tuán)，從而提高其可檢測(cè)性和檢測(cè)靈敏度[9]。鄰苯二胺(OPDA)是一種較好的衍生化試劑，可與α-DCs形成喹喔啉類(lèi)化合物(圖5)，而喹喔啉的結(jié)構(gòu)具有穩(wěn)定性好、紫外吸收靈敏等特點(diǎn)，可以通過(guò)HPLC-UV法進(jìn)行檢測(cè)[10]。如Ta?bi等[11]在測(cè)定牛血清中的MGO時(shí)，先用OPDA將血清中的MGO衍生化為2-甲基喹喔啉，再以乙腈-0.2%乙酸水溶液為流動(dòng)相進(jìn)行梯度洗脫，采用RP-HPLC法進(jìn)行檢測(cè)。

圖5 OPDA與α-DCs的衍生化反應(yīng)Fig.5 Derivatization reaction between OPDA with α-DCs

由于OPDA在衍生化時(shí)需要加熱或長(zhǎng)時(shí)間孵育并且在酸性條件下進(jìn)行，會(huì)影響樣品中α-DCs的實(shí)際含量，從而使得檢測(cè)結(jié)果不太準(zhǔn)確。于是Wang等[12]在分析測(cè)定血漿中α-DCs時(shí)，以新合成的4-(2,3-二甲基-6-喹喔啉基)-1,2-苯二胺(DQB)為衍生化試劑(圖6)，在弱堿性條件下不加熱進(jìn)行衍生化。比較發(fā)現(xiàn)，DQB和OPDA的衍生化產(chǎn)物無(wú)明顯差異，說(shuō)明堿性條件對(duì)檢測(cè)結(jié)果沒(méi)有影響。在此基礎(chǔ)上， Wang等[13]以 DQB為衍生化試劑，對(duì)Ⅱ型糖尿病患者唾液中的3-DG、GO、MGO、DA、戊烷-2,3-二酮(PD)進(jìn)行了定量分析，發(fā)現(xiàn)5種α-DCs含量的RSD值為0.34%～4.64%，回收率為80.26%～100.63%。

圖6 DQB與α-DCs的衍生化反應(yīng)Fig.6 Derivatization reaction between DQB with α-DCs

1.3 高效液相色譜-質(zhì)譜檢測(cè)器聯(lián)用(HPLC-MS)

圖7 TRI、DDP分別與α-DCs的衍生化反應(yīng)Fig.7 Derivatization reaction between TRI,DDP with α-DCs

高效液相色譜-串聯(lián)質(zhì)譜法(HPLC-MS/MS)在α-DCs的定量分析中也有廣泛應(yīng)用。Henning等[17]采用LC-MS/MS法檢測(cè)血樣中的15種α-DCs、2種α-酮羧酸，衍生化反應(yīng)在氬氣環(huán)境中進(jìn)行，以避免氧氣環(huán)境下產(chǎn)生新的α-DCs。Gensberger-Reigl等[18]采用UHPLC-DAD-MS/MS法對(duì)艾考糊精中的3,4-DDPS、3-DG、4-DG等α-DCs和5-羥甲基糠醛(5-HMF)進(jìn)行檢測(cè)。通常情況下，需先將樣品中的5-HMF與葡萄糖的降解產(chǎn)物分開(kāi)，再進(jìn)行檢測(cè)，Gensberger-Reigl等則使用OPDA將5-HMF衍生化為苯并咪唑衍生物進(jìn)行平行分析，操作簡(jiǎn)便、分析快速、誤差較小。陳榮祥等[19]采用HPLC-MS/MS法對(duì)木瓜飲料中GO、MGO、DA進(jìn)行檢測(cè)，3種化合物在0.012～0.900 mg·L-1范圍內(nèi)線性關(guān)系良好(R2>0.99),檢測(cè)限分別為5.3 μg·L-1、3.1 μg·L-1、3.5 μg·L-1，平均加標(biāo)回收率為86.26%～95.29%，RSD值為2.49%～7.31%。

2 氣相色譜法(GC)

GC是以氣體為流動(dòng)相的色譜方法，主要用于分離分析易揮發(fā)的物質(zhì)，具有效率高、靈敏度高、選擇性高等優(yōu)點(diǎn)。由于α-DCs屬于中間體，反應(yīng)活性高、不穩(wěn)定，因此在用GC法檢測(cè)時(shí)需要對(duì)其進(jìn)行衍生化以提高其穩(wěn)定性。最常用的衍生化試劑是OPDA。氣相色譜聯(lián)用氫火焰離子化檢測(cè)器(FID)、電子捕獲檢測(cè)器(ECD)等是目前檢測(cè)α-DCs的重要方法。

2.1 氣相色譜-氫火焰離子化檢測(cè)器(GC-FID)

FID是一種質(zhì)量型檢測(cè)器，一般只對(duì)含碳元素的化合物具有靈敏度高、響應(yīng)快、噪音小等優(yōu)點(diǎn)。Khuhawar等[20]以1,2-二氨基丙烷(DAP)為衍生化試劑來(lái)測(cè)定MGO和DA(圖8)，由于衍生化需在pH值為3的環(huán)境中進(jìn)行，且反應(yīng)運(yùn)行時(shí)間太短(4.6 min)，導(dǎo)致目標(biāo)峰與雜質(zhì)峰不能有效分離。王晨等[21]以O(shè)PDA為衍生化試劑，建立了同時(shí)在線檢測(cè)MGO和GO的GC法，OPDA用量為二羰基化合物的67倍，衍生化時(shí)間為10 min，MGO和GO的定量限分別為0.06 mg·L-1和0.08 mg·L-1，檢測(cè)限分別為0.02 mg·L-1和0.03 mg·L-1，方法靈敏度高。

MGO：R1=CH3，R2=H；DA：R1=CH3，R2=CH3

2.2 氣相色譜-電子捕獲檢測(cè)器(GC-ECD)

ECD是一種濃度型檢測(cè)器、離子化檢測(cè)器，只對(duì)含有強(qiáng)電負(fù)性元素的化合物具有高選擇性和高靈敏度。OSHA Method 1012[22]是以鄰五氟芐基羥胺鹽酸鹽(PFBHA)為衍生化試劑(圖9)，通過(guò)硅膠管-GC-ECD來(lái)檢測(cè)二乙酰基化合物，該方法以兩個(gè)串聯(lián)的專(zhuān)門(mén)干燥的硅膠管來(lái)收集DA，代替了NIOSH Method 2557法[23]中的Anasorb碳分子篩(CMS)吸附劑管和OSHA Method PV2118法[24]中的硅膠管，從而解決了使用單個(gè)硅膠管所遇到的遷移問(wèn)題。

2.3 氣相色譜-氮磷檢測(cè)器(GC-NPD)

氮磷檢測(cè)器(NPD)是一種質(zhì)量檢測(cè)器，對(duì)含氮、磷元素的化合物具有高靈敏度和高選擇性。由于喹喔啉類(lèi)化合物含氮元素，因此Jiang等[25]以2-甲基吡嗪(500 mg·L-1)-乙酸乙酯溶液為內(nèi)標(biāo)，以O(shè)PDA為衍生化試劑，通過(guò)固相萃取-GC-NPD來(lái)檢測(cè)α-DCs，12種商業(yè)軟飲料中的總α-DCs為5.75～50.72 μg·mL-1，DA的檢測(cè)限為0.3 ng·mL-1，回收率為75.6%～106.3%。Stephanie等[26]使用OPDA處理過(guò)的硅膠管代替固相萃取進(jìn)行樣品前處理，DA的檢測(cè)限為7 ng·mL-1，回收率達(dá)到95%以上，與Jiang等的方法相比靈敏度較低，但準(zhǔn)確度高、穩(wěn)定性好，且解決了NIOSH Method 2557法[24]中的濕度問(wèn)題，可以檢測(cè)其它方法難以檢測(cè)的化合物。

圖9 PFBHA與二乙?；衔锏难苌磻?yīng)Fig.9 Derivatization reaction between PFBHA with diacetyl compounds

2.4 氣相色譜-質(zhì)譜聯(lián)用(GC-MS)

GC-MS是目前發(fā)展最完善、應(yīng)用最廣泛的聯(lián)用儀器，具有靈敏度高、檢測(cè)范圍廣等優(yōu)點(diǎn)。LeBouf等[27]用質(zhì)譜儀代替FID，通過(guò)硅膠管-氣相色譜-選擇性離子監(jiān)測(cè)(SIM)條件下的質(zhì)譜聯(lián)用來(lái)檢測(cè)DA，與OSHA Method 1013/1016法相比，定量限降低6.2～6.6倍。Lim 等[28]以2,2,2-三氟乙基肼(TFEH)為衍生化試劑，采用頂空固相微萃取(HS-SPME)-GC-MS法對(duì)酒精飲料和發(fā)酵食品中GO和MGO進(jìn)行檢測(cè)，樣品中只有揮發(fā)性化合物被固相微萃取(SPME)送到GC系統(tǒng)，而非揮發(fā)性干擾物質(zhì)留在小瓶中，GC-MS的SIM可以獲得低干擾峰，GO和MGO的檢測(cè)限分別為0.001 1 μg·mL-1、0.000 7 μg·mL-1,定量限分別為0.003 6 μg·mL-1、0.002 1 μg·mL-1，RSD值均小于8%。

3 離子色譜法(IC)

IC使用裝有離子交換樹(shù)脂的分離柱進(jìn)行分離，使用電導(dǎo)檢測(cè)器(ELCD)進(jìn)行檢測(cè)，ELCD對(duì)含鹵、硫、氮元素的化合物具有高選擇性和高靈敏度。王永梅等[29]在堿性條件下使GO與過(guò)氧化氫反應(yīng)生成草酸根(圖10)，然后使用IC法測(cè)定煙用紙張中GO的含量，檢測(cè)限為5.0×10-5μg·mL-1，具有靈敏度高、重現(xiàn)性好、有機(jī)溶劑使用量少等優(yōu)點(diǎn)。

圖10 GO與過(guò)氧化氫反應(yīng)生成草酸根Fig.10 GO reacts with hydrogen peroxide to form oxalate

4 紫外分光光度法

衛(wèi)佳歡等[30]和劉卓欽等[31]采用紫外分光光度法測(cè)定生活用紙中GO的含量，以水為提取溶液，GO與2-亞肼基-2，3-二氫-3-甲基苯并噻唑鹽(HMBT)在乙酸溶液中80 ℃下反應(yīng)生成一種黃色化合物(圖11)，然后使用紫外分光光度計(jì)測(cè)定405 nm處吸光度。與其它方法相比，紫外分光光度法不需要繁瑣的衍生化條件，而且操作簡(jiǎn)便，實(shí)用性強(qiáng)。

圖11 GO與HMBT的反應(yīng)Fig.11 GO reacts with HMBT

5 傳感器檢測(cè)法

傳感器的工作原理是把化學(xué)能轉(zhuǎn)變?yōu)殡娔埽瑥亩箼z測(cè)方便、快速、有效地進(jìn)行。多種傳感器技術(shù)可應(yīng)用于MGO的分析檢測(cè)，包括熒光傳感技術(shù)、電化學(xué)傳感技術(shù)等。Wang等[32]開(kāi)發(fā)了一種熒光傳感器(甲基二氨基苯-bodipy，MBo)，可以在生理?xiàng)l件下檢測(cè)MGO。MBo利用了OPD對(duì)MGO的反應(yīng)性，同時(shí)通過(guò)調(diào)節(jié)熒光團(tuán)和芳基部分的電子特性來(lái)克服喹啉的缺電子性質(zhì)。MBo對(duì)MGO的選擇性優(yōu)于其它生物學(xué)相關(guān)的二羰基類(lèi)化合物，且對(duì)低濃度(50 nmol·L-1)的MGO也很敏感，適用于檢測(cè)復(fù)雜環(huán)境中的MGO，包括活細(xì)胞環(huán)境。

Wu等[33]成功設(shè)計(jì)了一種基于羧化功能化多壁碳納米管(MWCNTs-COOH)與羧甲基纖維素(CMC)和殼聚糖納米圈(CSN)共功能化的納米復(fù)合傳感器，用于新西蘭麥努卡蜂蜜中MGO的簡(jiǎn)單、低成本、高靈敏度的伏安識(shí)別和測(cè)定。CSN-CMC粘附在MWCNTs-COOH表面；納米復(fù)合傳感器表現(xiàn)出較大的電化學(xué)有效面積及優(yōu)異的電催化活性，線性范圍為5×10-8～8×10-4mol·L-1，檢測(cè)限為9.6×10-9mol·L-1，在優(yōu)化條件下具有良好的穩(wěn)定性和選擇性。

6 結(jié)語(yǔ)

α-DCs是AGEs的重要前體物質(zhì)，而AGEs是糖尿病并發(fā)癥的重要發(fā)病機(jī)制之一。對(duì)生物樣本中α-DCs的檢測(cè)有助于對(duì)糖尿病腎病、糖尿病心肌病、糖尿病動(dòng)脈粥樣硬化等糖尿病并發(fā)癥的發(fā)病機(jī)制的研究，并對(duì)糖尿病的輔助診斷具有一定意義。對(duì)食物中α-DCs的檢測(cè)能夠指導(dǎo)糖尿病患者和正常人健康飲食，有效控制外源性α-DCs的攝入量?？梢?jiàn)，α-DCs的檢測(cè)在臨床診斷、代謝、藥物研究等方面具有重要作用。

α-DCs的檢測(cè)方法中，應(yīng)用最廣泛的是HPLC和GC。色譜分析前，需要進(jìn)行衍生化處理，OPDA是使用最廣泛的衍生化試劑，4-MPD和DQB作為其衍生化產(chǎn)物也被用作衍生化試劑測(cè)定α-DCs；此外，其它鄰二氨基化合物，如DAP、3,4-DAP、DDP也可用于α-DCs的柱前衍生化；羥胺、肼等含氨基化合物(2,2-三氟乙肼、鄰五氟芐基羥胺鹽酸鹽等)也可作為衍生化試劑。傳感器技術(shù)檢測(cè)α-DCs可以避免或縮短復(fù)雜樣品前處理及衍生化過(guò)程，排除樣品中有色物質(zhì)的干擾，較現(xiàn)有基于色譜學(xué)的檢測(cè)方法更快、更省時(shí)，可用于測(cè)定復(fù)雜樣品中的α-DCs，在臨床和基礎(chǔ)科學(xué)研究及實(shí)踐中具有潛在的應(yīng)用價(jià)值。