李彩紅，劉冰蕾，李 飛，梅正鼎，郭莉莉，何叔軍，張志剛，趙瑞元

(湖南省棉花科學(xué)研究所，湖南常德 415101)

0 引 言

【研究意義】近年來(lái)棉花生產(chǎn)輕簡(jiǎn)化及綠色化成為洞庭湖棉區(qū)的發(fā)展趨勢(shì)，免膜直播逐漸成為一種新的生產(chǎn)模式。但洞庭湖棉區(qū)5～6月連續(xù)陰雨天氣較多，直播后往往引起棉花苗期病害大面積發(fā)生，每年都有因爛種、爛芽、死苗導(dǎo)致大面積補(bǔ)種、毀種和重播,苗期病害亦可間接誘發(fā)中后期病害及鈴病的發(fā)生，嚴(yán)重影響棉花的優(yōu)質(zhì)高產(chǎn)[1]。研究油后免膜直播棉苗期病害發(fā)生的氣候影響因子及致病原，對(duì)于針對(duì)性防控棉花苗期病害具有重要意義?！厩叭搜芯窟M(jìn)展】棉花苗期病害是一種復(fù)合性病害，在我國(guó)通常認(rèn)為其發(fā)病類(lèi)型主要有立枯病、炭疽病、疫病、褐斑病、猝倒病、紅腐病等[2-8]，各棉區(qū)因氣象因素、土壤質(zhì)地及地勢(shì)、種植模式的影響，苗期病害種類(lèi)及致病菌各有不同。目前對(duì)于苗期病害大多數(shù)為概括性報(bào)道且年限較早，普遍認(rèn)為長(zhǎng)江流域棉區(qū)苗床上主要為炭疽病[9]?！颈狙芯壳腥朦c(diǎn)】隨著湖南免膜直播模式的逐步推廣，有必要對(duì)油后直播棉的主要?dú)夂蛴绊懸蜃蛹耙鹈缙诓『Πl(fā)生的病原種類(lèi)進(jìn)行鑒定。研究油后免膜直播棉苗期病害發(fā)生及病原分析?！緮M解決的關(guān)鍵問(wèn)題】結(jié)合氣象資料分析苗期病害發(fā)生與氣候因子的關(guān)系，研究苗期病害大發(fā)生流行的氣象條件；同時(shí)從致病菌入手，通過(guò)病原種類(lèi)鑒定，分析湖南免膜直播棉田引發(fā)苗期病害發(fā)生的病原種類(lèi)。

1 材料與方法

1.1 材 料

供試品種：湘K25，由湖南省棉花科學(xué)研究所育種二組提供。

自動(dòng)氣象站：型號(hào)PH，購(gòu)自武漢新普惠科技有限公司。

馬鈴薯葡萄糖瓊膠培養(yǎng)基(PDA)：馬鈴薯200 g，葡萄糖18 g，瓊脂粉24 g，水1 000 mL，pH值自然。將馬鈴薯洗凈后去皮，稱(chēng)量200 g切碎，加水適量煮沸20～30 min，用紗布過(guò)濾后，濾液中加入葡萄糖和瓊脂繼續(xù)加熱攪勻，稍冷卻后加水補(bǔ)足1 000 mL，分裝到錐形瓶，加塞包扎后120℃滅菌20 min。

Czapek液體培養(yǎng)基：硝酸鈉2 g、氯化鉀0.5 g、硫酸鎂0.5 g、硫酸亞鐵0.01 g、磷酸氫二鉀1 g、蔗糖30 g，加水定容至1 000 mL，pH調(diào)整至7.0，然后分裝到錐形瓶，加塞包扎后120℃滅菌20 min。

1.2 方 法

1.2.1 苗期病害發(fā)生調(diào)查

試驗(yàn)地設(shè)在湖南省棉花科學(xué)研究所常德鼎城科研基地，試驗(yàn)地前茬為油菜，土質(zhì)為粘土，土地平整，田間管理?xiàng)l件一致。小區(qū)隨機(jī)排列，行長(zhǎng)10 m，2行區(qū)，3次重復(fù)。人工開(kāi)溝直播，每小區(qū)定量播種200粒，開(kāi)始出苗后每2～3 d調(diào)查1 次死苗數(shù)和出苗數(shù)，至不再有棉苗死亡時(shí)調(diào)查結(jié)束。2016 年播種時(shí)間為5 月11 日，2019年為5月22日。試驗(yàn)期間日平均氣溫及日降水量數(shù)據(jù)來(lái)自試驗(yàn)地自動(dòng)氣象站。

1.2.2 病原菌分離與純化

于苗期病害發(fā)生期采集發(fā)病嚴(yán)重的病苗，采用常規(guī)組織分離法分離病原菌。具體方法：于超凈工作臺(tái)中，用無(wú)菌剪刀剪取病斑與病健交界處的莖葉，放入75%乙醇中浸泡3～5 s后，置于次氯酸鈉中浸泡50 s，接著用無(wú)菌水清洗3次，剪成3 mm的小塊。將小塊部位接種于PDA培養(yǎng)基上，25℃恒溫培養(yǎng)箱中培養(yǎng)。待菌絲長(zhǎng)出后，按稀釋平板法獲取單孢菌株，并于超低溫冰箱保存。

1.2.3 病原菌鑒定

1.2.3.1 培養(yǎng)特性

將所得病原菌在PDA 培養(yǎng)基上25℃恒溫倒置培養(yǎng)7 d 后，觀(guān)察菌落形態(tài)、菌絲生長(zhǎng)及孢子形態(tài)等。

1.2.3.2 分子生物學(xué)鑒定

將分離得到的病原菌在PDA 培養(yǎng)基上25℃恒溫倒置培養(yǎng)7 d 后收集菌絲，采用CTAB法提取菌株的DNA。以通用引物ITS4(5'-TCCTCCGCTTATTGATATGC-3')和ITS5(5'-GGAAGTAAAAGTCGTAACAAGG-3')進(jìn)行聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)(Polymerasechain reaction，PCR)擴(kuò)增。引物由蘇州金維智生物科技有限公司合成。

PCR 反應(yīng)體系為：10×Taqbuffer2.5 μL(Mg2+pLus)，dNTP Mixture 2 μL，引物ITS4和ITS5各1 μL，模板1 μL，TaqDNA PoLymerase 1U ，ddH2O補(bǔ)足至25 μL。

PCR 反應(yīng)條件為：94℃預(yù)變性3 min，94℃變性50 s，55℃退火30 s，72℃延伸1 min，進(jìn)行35 個(gè)循環(huán)，最后72℃延伸10 min，4℃保存。以1%瓊脂糖凝膠電泳檢測(cè)擴(kuò)增條帶的大小和有無(wú)，將PCR 擴(kuò)增產(chǎn)物送至蘇州金維智生物科技有限公司測(cè)序。

1.3 數(shù)據(jù)處理

數(shù)據(jù)統(tǒng)計(jì)采用Microsoft office Excel 2010；測(cè)序的拼接結(jié)果在NCBI 上進(jìn)行BLAST 比對(duì)，根據(jù)比對(duì)結(jié)果，構(gòu)建系統(tǒng)發(fā)育樹(shù)。

2 結(jié)果與分析

2.1 苗期病害發(fā)生

研究表明，2016年5月11日棉花播種后，于5月15日出現(xiàn)第1次降雨(9.3 mm)，5月23日開(kāi)始有死苗出現(xiàn)，平均死苗數(shù)為1.3，5月25日和5月31日呈現(xiàn)2次死苗高峰，平均死苗數(shù)分別為4.0和5.3，期間日均溫分布在17.2～28.3℃，降雨總量為183.8 mm。2019年湖南上半年低溫陰雨天氣持續(xù)不斷，油菜收獲較往年偏晚，棉花5月22日播種，5月25日出現(xiàn)第1次降雨(6.2 mm)，6月3日出現(xiàn)第1次死苗，死苗數(shù)為30，為本年度死苗最高峰，6月10日出現(xiàn)第2次死苗小高峰，死苗數(shù)為9.7，試驗(yàn)期間日平均氣溫分布在21.1～28.3℃，降雨總量為251.6 mm，2019年棉花直播后，日均氣溫高于2016年，但降水量大，空氣濕度大，土壤濕度較大，苗期病害發(fā)生較2016年偏重。表1

表1 試驗(yàn)地日降雨量、日均溫及死苗情況Table 1 Dailyprecipitation，mean temperature and seedling diseases in test fields

2.2 病原菌

采集病株分離純化，共得到53個(gè)菌株。通用引物ITS4/ITS5 PCR擴(kuò)增得到大小約550 bp的rDNA-ITS基因片段，將測(cè)序得到的基因序列在NCBI網(wǎng)站上進(jìn)行BLAST比對(duì)分析，同時(shí)結(jié)合形態(tài)學(xué)觀(guān)察，分離到的53個(gè)菌株被鑒定為鐮刀菌屬、鏈格孢屬、曲霉屬、絲核菌屬和附球菌屬等共5類(lèi)。其中，T9、M1、M52、M53等21株屬于鐮刀菌屬，占分離到菌株總數(shù)的39.6%，鏈格孢屬菌株17株，包括T5、M9等，占總株數(shù)的32.1%，曲霉屬11株，如M17等，占總株數(shù)的20.7%，絲核菌屬如M1～15和附球菌屬分別為3株和1株，占分離菌株的5.7%和1.9%。圖1

圖1 部分菌落形態(tài)及菌絲、孢子形態(tài)Fig.1 Culture characteristics of some strains

M53、M52與登錄號(hào)GU724513.1 (Fusariumoxysporum)一致性為99.81%，與登錄號(hào)KX196807.1 (Fusariumoxysporum)一致性為100%；T9與登錄號(hào)GU724513.1 (Fusariumoxysporum)和登錄號(hào)KX196807.1 (Fusariumoxysporum)一致性均為99.62%；M2、M31、M1～15與登錄號(hào)FJ746938.1(Rhizoctoniasolani)一致性分為99.28%、98.71%、99.86%，與登錄號(hào) KJ866423.1(Rhizoctoniasolani)一致性分為99.28%、98.71%、99.86%。圖2

圖2 部分菌株的18S rDNA 系統(tǒng)發(fā)育樹(shù)Fig.2 Phylogenetic trees of partial strains based on 18S rDNA

3 討 論

引發(fā)苗期病害的因素主要包括棉苗本身的抗病性、氣候條件和菌源[9]。棉花苗期為營(yíng)養(yǎng)生長(zhǎng)期，影響棉苗生長(zhǎng)的主要環(huán)境因素有溫度、降水和光照，春季低溫多雨，尤其4～5月寒潮來(lái)襲，田間濕度大，會(huì)加重苗期病害的發(fā)生[10-13]。油后免膜直播模式為油菜收貨后播種棉花，播種時(shí)間通常在5月10日以后，此時(shí)已到春末夏初，氣溫較高，有利于棉苗生長(zhǎng)，降水量成為影響該模式下棉花苗期病害發(fā)生的最重要因子之一，播種后水量多，空氣和土壤濕度較大，就會(huì)使棉花苗期病害嚴(yán)重發(fā)生。研究探討了降雨量與苗期病害發(fā)生的關(guān)系，即出苗后20 d內(nèi)是棉苗易受病原菌侵染的時(shí)期，病害主要在距播種后第1次降雨1周左右的時(shí)間開(kāi)始發(fā)生，持續(xù)20 d左右，且大降雨后1周為發(fā)病高峰期，應(yīng)特別做好苗期病害的防控工作，如可通過(guò)播前種子包衣、噴施植物誘導(dǎo)免疫劑等措施減輕病害的發(fā)生。

我國(guó)長(zhǎng)江流域棉區(qū)春季多雨，病苗率高達(dá)90%，以根腐為主的死苗率達(dá)20%～30%，根據(jù)以往調(diào)查，長(zhǎng)江流域棉區(qū)主要為營(yíng)養(yǎng)缽育苗移栽方式，苗期病害以炭疽病發(fā)生最為普遍，立枯病和紅腐病次之[9]。關(guān)于油后免膜直播方式下的苗期病害病原發(fā)生尚未開(kāi)展相關(guān)研究工作。研究分離獲得53個(gè)菌株，分屬于鐮刀菌屬、鏈格孢屬、曲霉屬、絲核菌屬和附球菌屬等。鐮刀菌是一類(lèi)重要的土傳病原真菌，其中尖孢鐮刀菌可侵染棉苗引發(fā)枯萎?。淮殓牭毒?、木賊鐮刀菌等可引起棉苗紅腐病；立枯絲核菌可誘發(fā)棉苗立枯?。绘湼矜呔蓪?dǎo)致棉苗黑斑病[14-19]。關(guān)于曲霉菌，趙麗紅等報(bào)道在棉花種子帶菌檢測(cè)中發(fā)現(xiàn)了黃曲霉[20]，曲霉屬真菌亦可引起棉鈴曲霉病，但關(guān)于曲霉和附球菌對(duì)棉苗的影響未見(jiàn)相關(guān)報(bào)道，尚需對(duì)其作用進(jìn)一步研究。

4 結(jié) 論

降水量為影響油后免膜直播模式下棉花苗期病害發(fā)生的最重要因子之一，病害發(fā)生主要在距播種后第1次降雨后1周左右的時(shí)間開(kāi)始，且大降雨后1周為發(fā)病高峰期，做好苗期病害的防控工作。

分離到的病原菌中以鐮刀菌屬、鏈格孢屬和曲霉屬為主，其次為絲核菌屬和附球菌屬。