周禮 ，黃旭明，張明興

1.廣東藥科大學(xué)附屬第一醫(yī)院康復(fù)醫(yī)學(xué)科，廣東 廣州 510075；

2.清遠(yuǎn)市連南自治縣人民醫(yī)院腦科，廣東 清遠(yuǎn) 540000

我國(guó)于2019年12月發(fā)現(xiàn)新型冠狀病毒(2019-nCoV)感染性肺炎。傳統(tǒng)治療療效不明確，尋找新的有效藥物應(yīng)成為治療研究的重點(diǎn)。目前研究發(fā)現(xiàn)20%SARS-CoV表位與SARS-CoV-2，即2019-nCoV完全匹配，這些引起SARS-CoV免疫炎性反應(yīng)的B細(xì)胞和T細(xì)胞表位極有可能對(duì)2019-nCoV有效[1]。因此進(jìn)行SARS-CoV冠狀病毒感染性肺炎的研究對(duì)于新型冠狀病毒肺炎的疫情控制有極大意義。

目前對(duì)冠狀病毒的研究多見于臨床實(shí)驗(yàn)，體內(nèi)研究有助于闡明冠狀病毒感染的致病性，臨床尸檢結(jié)果都往往受經(jīng)藥物治療等影響，觀察不到單純病毒感染造成的損傷，動(dòng)物模型能更真實(shí)地反映冠狀病毒感染情況及機(jī)制，更有利于篩選及研發(fā)藥物[2]。回顧15 年前SARS-CoV 病毒流行亦引起肺部炎癥及重癥急性呼吸綜合征，兩種病毒均為同屬冠狀病毒，SARS-CoV的體內(nèi)研究較2019-nCoR 有著較成熟和安全的實(shí)驗(yàn)條件，因此選擇其進(jìn)行相應(yīng)研究[3-4]。

在多次疫情中，中藥發(fā)揮了其特殊的作用，但其給藥方式及療效不確切。前期多項(xiàng)研究中也證實(shí)黃芩甙元(Baicalein)具有抗病毒及改善AD 大鼠神經(jīng)系統(tǒng)免疫炎性反應(yīng)的療效[5-6]，文獻(xiàn)報(bào)道黃芩有廣泛的生物活性，體內(nèi)外實(shí)驗(yàn)證實(shí)其抗氧化可清除自由基，抑制人免疫缺陷病毒，治療白血病[7-9]。但目前臨床中多采取直接中藥制劑口服，應(yīng)用于冠狀病毒中療效不穩(wěn)定，而脂質(zhì)納米粒(SLN)有緩釋和穩(wěn)定的生物特性，直接肺部給藥，肺泡吸收面積大血管網(wǎng)絡(luò)豐富，利于藥物吸收轉(zhuǎn)運(yùn)[10-13]。本研究將Baicalein作為先導(dǎo)化合物進(jìn)行結(jié)構(gòu)修飾、納米包裝，在肺泡灌注基礎(chǔ)上予定位給藥，發(fā)現(xiàn)治療后大鼠反應(yīng)較前靈敏，考慮肺泡灌注黃芩甙元載藥納米治療發(fā)揮抗病毒、抗免疫炎性反應(yīng)的生理功能，該治療方式比單純肺泡灌注或口服給藥更有利于發(fā)揮作用。

本實(shí)驗(yàn)制備SARS-CoV 大鼠模型，用肺泡灌注Baicalein載藥納米技術(shù)進(jìn)行給藥治療，以行為學(xué)實(shí)驗(yàn)、病理學(xué)及生化等多項(xiàng)研究，驗(yàn)證其減輕免疫炎性反應(yīng)的有效性及可行性，并揭示肺泡灌注Baicalein載藥納米技術(shù)改善冠狀病毒感染大鼠的呼吸窘迫綜合征作用機(jī)制。

1 材料與方法

1.1 實(shí)驗(yàn)動(dòng)物與分組 SPF 級(jí)雄性Lewis大鼠(6周齡)96 只，體質(zhì)量150～160 g，購(gòu)于中山大學(xué)實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心，飼養(yǎng)及實(shí)驗(yàn)按《實(shí)驗(yàn)動(dòng)物使用及實(shí)驗(yàn)規(guī)程國(guó)家標(biāo)準(zhǔn)》及在P3+動(dòng)物實(shí)驗(yàn)室[許可證號(hào)SYXK (京)2019.0003]負(fù)壓隔離器中進(jìn)行。所有實(shí)驗(yàn)動(dòng)物在本實(shí)驗(yàn)室飼養(yǎng)環(huán)境中穩(wěn)定1 周后按研究動(dòng)物倫理委員會(huì)(IAEC)動(dòng)物實(shí)驗(yàn)指南進(jìn)行實(shí)驗(yàn)。根據(jù)隨機(jī)數(shù)表法將Lewis 大鼠分為正常對(duì)照組、CoV 組、藥物治療組、安慰劑組，每組24 只。本研究使用的分離自冠狀病毒肺炎患者的病毒PUMC01 株，主要使用Vero 細(xì)胞進(jìn)行培養(yǎng)傳代，經(jīng)RT-PCR 確定為SARS 病毒，TCID50為106pfu/mL。

1.2 主要試劑及儀器 Baicalein購(gòu)自美國(guó)APE×BIO公司；戊巴比妥鈉購(gòu)自中國(guó)中山大學(xué)實(shí)驗(yàn)中心；山崳酸甘油酯購(gòu)自法國(guó)GATTEFOSSE 公司；水溶性PVAc-203 購(gòu)自北京正潔利達(dá)經(jīng)貿(mào)有限公司；甘油、磷酸酶抑制劑、無(wú)水乙醇、蘇木素-伊紅染液購(gòu)自天津大茂化學(xué)試劑有限公司；二甲苯、中性樹膠購(gòu)自國(guó)藥集團(tuán)化學(xué)試劑有限公司；SARS 病毒抗體診斷試劑盒購(gòu)自北京華大生物技術(shù)有限公司；蛋白磷酸酶抑制劑混合物購(gòu)自上海貝博生物公司；細(xì)胞因子ELISA試劑盒購(gòu)自晶美生物有限公司。主要實(shí)驗(yàn)儀器：T型迷宮，酶標(biāo)儀，電熱恒溫水浴箱，微量加樣器，手術(shù)器械，病理切片機(jī)，渦旋混合器，超低溫冰箱，脫色搖床，磁力攪拌器，高速攪拌機(jī)；Thermo Ascent FL熒光化學(xué)發(fā)光微孔板；ZetasizerNano ZS系列納米粒度及Zeta電位分析儀；高速離心機(jī)，光學(xué)顯微鏡等。

1.3 實(shí)驗(yàn)方法

1.3.1 動(dòng)物處理方法 對(duì)照組常規(guī)喂養(yǎng)，余組進(jìn)行CoV 攻毒。鼻噴霧法接種病毒105TCID50(1 mL 體積)。于感染后第3、7天檢測(cè)血清IgG抗體均為陽(yáng)性，且抽樣活檢證書感染后肺部有相應(yīng)病理變化。攻毒后7 d，隨機(jī)分成CoV組、治療組、安慰劑組；CoV組繼續(xù)研究觀察，治療組按設(shè)計(jì)劑量肺泡灌注Baicalein載藥納米[Baicalein 10 mg/(kg·d)]治療兩周，安慰劑組給予肺泡灌注PBS 灌注液治療兩周。各組大鼠取攻毒后0 d、3 d、7 d、14 d、28 d進(jìn)行體征反應(yīng)等評(píng)估，觀察比較各組皮毛、體重、食欲反應(yīng)及“T”型迷宮實(shí)驗(yàn)，上述時(shí)間點(diǎn)行咽拭子及肺組織病毒分離方法檢測(cè)病毒外排與復(fù)制的情況，于0 d、3 d、7 d、14 d、28 d每組各抽取模型動(dòng)物安樂死后，肺組織勻漿上清細(xì)胞因子TNF-α、IL-6、IFN-γ及肺組織病理檢測(cè)等后續(xù)實(shí)驗(yàn)。評(píng)估病程及治療前后各組的動(dòng)物病理變化及免疫學(xué)改變。

1.3.2 載藥納米的制備 黃芩甙標(biāo)準(zhǔn)品購(gòu)自衛(wèi)生部藥品檢定所；黃芩甙元標(biāo)準(zhǔn)品購(gòu)自美國(guó)APExBIO公司；取0.5 g PVAc-203 和0.25 g 甘油加入到50 mL水中，在加熱攪拌溶解后冷卻。山崳酸甘油酯0.5 g及1 mg Baicalein 熔融成有機(jī)相后逐滴加入75℃的上述水相中，11 000 r/min攪拌保持75℃，用高速剪切法，剪切速率為24 000 r/min，剪切時(shí)間為10 min，呈乳狀液，4℃冰箱放置固化得平均粒徑分別為200 nm 的Baicalein 的納米水混懸液[11-12]。用HPLC 檢測(cè)納米制劑中黃芩甙元的含量，并作酶解前后的對(duì)比，可以準(zhǔn)確而可靠地鑒定其保甙的效果，保證其內(nèi)在質(zhì)量[14-15]。

1.3.3 支氣管肺泡灌洗術(shù) 按經(jīng)典的灌洗操作方法進(jìn)行設(shè)計(jì)[16-17]。灌洗液選取磷酸鹽緩沖液(PBS，pH7.4)，配置加入適量藥物或安慰劑后，氣管插管后進(jìn)行在體操作的全肺灌洗技術(shù)，緩慢輕柔灌洗兩次，單次灌洗量3～5 mL，灌洗液每次在肺組織內(nèi)停留時(shí)間28 s[18-19]。

1.3.4 T 迷宮行為學(xué)實(shí)驗(yàn) 實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì)“T”型迷宮兩臂，正確臂亮燈并放置食物，為獎(jiǎng)勵(lì)區(qū)，非正確臂盡頭不亮燈無(wú)食物，轉(zhuǎn)換開關(guān)變換正確臂區(qū)，進(jìn)入亮燈區(qū)成功覓食，動(dòng)物在實(shí)驗(yàn)前進(jìn)行連續(xù)3 d的訓(xùn)練。第4日測(cè)試記錄15 次隨機(jī)變換正確臂，計(jì)算3 min 內(nèi)每只大鼠成功到達(dá)正確臂的時(shí)間。

1.3.5 病毒分離及抗體檢測(cè) 各組動(dòng)物各時(shí)間點(diǎn)取肺臟組織標(biāo)本0.5 mm3剪碎研磨成勻漿液，加于1.5 mL 離心管。離心6 000 r/min，10 min。將第一代上清24孔板內(nèi)接種于VERO細(xì)胞孵化傳代，三代后鑒定病毒。利用酶聯(lián)免疫法進(jìn)行SARS-CoV 特異性抗體IgG 檢測(cè)，動(dòng)物3%戊巴比妥鈉麻醉后，心尖插入針頭取血l mL分離血清，按試劑盒說明書進(jìn)行操作。

1.3.6 肺組織勻漿上清細(xì)胞因子的測(cè)定 各組實(shí)驗(yàn)動(dòng)物在相應(yīng)時(shí)間點(diǎn)取血后，分二批取材。第一批處死后取肺組織冰域研磨勻漿，加入DMEM液配成10%的肺組織勻漿，2 800×g離心10 min，取上清。利用ELISA試劑盒測(cè)定細(xì)胞因子TNF-α、IL-6、IFN-γ的水平。

千里之行，始于足下，重視一堂課的導(dǎo)入，是一堂課成功的關(guān)鍵。若選準(zhǔn)、選活了“切入點(diǎn)”，則能有效地設(shè)置問題情景，激活學(xué)生的思維，迅速地使學(xué)生進(jìn)入“角色”，從而充分調(diào)動(dòng)學(xué)習(xí)的積極性，主動(dòng)性，使學(xué)生學(xué)起來(lái)興趣盎然。俗話說：“好的開始是成功的一半”，因此，我非常重視課堂的導(dǎo)入設(shè)計(jì)，本文就是筆者的一點(diǎn)粗淺的體會(huì)。

1.3.7 病理組織學(xué)實(shí)驗(yàn) 各組實(shí)驗(yàn)動(dòng)物第二批處死后取肺等組織，常規(guī)固定包埋、病理組織切片處理后，HE 染色，脫水封片，顯微鏡鏡檢觀察各組動(dòng)物的肺組織學(xué)結(jié)構(gòu)，并對(duì)相關(guān)圖像采集。

1.4 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法 應(yīng)用SPSS18.0 統(tǒng)計(jì)學(xué)軟件分析實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)，計(jì)量數(shù)據(jù)符合正態(tài)分布，以均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差(±s)表示，多組間比較采用單因素方差分析，組間兩兩比較采用獨(dú)立樣本t 檢驗(yàn)，以P＜0.05 表示差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 建模評(píng)估 CoV組、治療組及安慰劑組動(dòng)物均采用鼻腔噴霧接種病毒105TCID50(1 mL體積)。于攻毒處理后第0、3、7 天檢測(cè)血清IgG 抗體為陽(yáng)性，感染后Lewis 大鼠具有精神萎靡、被毛粗亂，消瘦，活動(dòng)減少，覓食量減少等表現(xiàn)，合造模成功檢測(cè)標(biāo)準(zhǔn)，完成造模，見表1。

表1 攻毒SARS-CoV后各組大鼠IgG滴度值

2.2 行為學(xué)檢查

2.2.1 動(dòng)物行為學(xué)表現(xiàn) 攻毒處理后第1、3、7天CoV 組、治療組及安慰劑組感染后Lewis 大鼠具有精神萎靡、被毛粗亂、消瘦、活動(dòng)減少、覓食量減少等表現(xiàn)，攻毒7 d 后，予肺泡灌注黃芩甙元載藥納米、肺泡灌注安慰劑治療。在實(shí)驗(yàn)14 d、28 d兩個(gè)時(shí)間點(diǎn)，CoV組大鼠體質(zhì)量進(jìn)行性下降，反應(yīng)萎靡；治療組動(dòng)物體質(zhì)量無(wú)繼續(xù)下降，活動(dòng)及覓食量有明顯改善，大致恢復(fù)攻毒前水平；安慰劑組動(dòng)物體質(zhì)量無(wú)繼續(xù)下降，活動(dòng)稍增多，覓食量較前稍增多。

2.2.2 T 迷宮實(shí)驗(yàn) 結(jié)果顯示在0 d 各組大鼠達(dá)正確臂端耗時(shí)大致相同，差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。3 d時(shí)，與對(duì)照組相比，治療組、CoV組、安慰劑組在迷宮中到達(dá)正確臂使用的時(shí)間增加，差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P＞0.05)。在7 d時(shí)，與對(duì)照組相比，治療組、CoV組、安慰劑組在迷宮系統(tǒng)達(dá)正確臂時(shí)間增加，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P＜0.05)；治療組、CoV 組、安慰劑組組間比較差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P＞0.05)；7 d予肺泡灌注黃芩甙元載藥納米、肺泡灌注安慰劑治療。14 d時(shí)，CoV組大鼠在到達(dá)正確臂時(shí)間為(36.29±1.58)s，與對(duì)照組(17.04±1.68)s比較差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P＜0.05)。而通過治療14 d，治療物組大鼠到達(dá)食物臂端的時(shí)間為(22.05±1.14)s，耗時(shí)較同時(shí)間點(diǎn)CoV組的明顯減少，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P＜0.05)。安慰劑組大鼠到達(dá)食物臂端所花費(fèi)的時(shí)間減少；與安慰劑相比，治療組大鼠到達(dá)食物臂端所花費(fèi)的時(shí)間明顯減少，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P＜0.05)。在28 d，與CoV組相比較，治療組、安慰劑組大鼠到達(dá)食物臂端所花費(fèi)的時(shí)間明顯減少，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P＜0.05)，見圖1。

圖1 各組大鼠的T型迷宮實(shí)驗(yàn)結(jié)果

2.2.3 病毒分離 CoV 組大鼠感染后3 d、7 d、14 d、28 d 的肺部病毒分離為陽(yáng)性。治療組大鼠感染后3 d、7 d 肺部病毒分離均為陽(yáng)性，治療干預(yù)后在14 d、28 d 病毒分離為陰性。安慰劑組感染后3 d、7 d肺部病毒分離均為陽(yáng)性，治療干預(yù)后在14 d、28 d病毒分離仍為陽(yáng)性。

表2 各組大鼠的病毒檢測(cè)匯總

2.2.5 肺勻漿上清細(xì)胞因子改變 在接種病毒前，各組大鼠肺組織勻漿上清中，TNF-α、IL-6、IFN-γ水平差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P＞0.05)。在接種病毒后3 d，CoV 組、治療組、安慰劑組肺組織勻漿TNF-α、IL-6、IFN-γ水平均明顯高于對(duì)照組水平，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P＜0.05)。接種病毒后7 d，CoV 組、治療組、安慰劑組肺組織勻漿TNF-α、IL-6、IFN-γ水平增高程度均較3 d 時(shí)更加明顯，與各自攻毒前水平有顯著增高，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P＜0.05)，與對(duì)照組相比有顯著增高，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P＜0.05)。在14 d、28 d，各組細(xì)胞因子水平有所下降，其中CoV 組TNF-α、IL-6、IFN-γ水平接種后3 d 相比，差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P＞0.05)；治療組、安慰劑組動(dòng)物的TNF-α、IL-6、IFN-γ水平下降明顯，與7 d 時(shí)各組的細(xì)胞因子水平相比，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P＜0.05)，見圖2～圖4。

2.2.6 肺組織病理學(xué)結(jié)果 在實(shí)驗(yàn)取大鼠肺組織活檢，顯微鏡下提示在0 d 時(shí)各組大鼠肺組織無(wú)炎性浸潤(rùn)等異常(圖5A)。攻毒后 3 d、7 d 時(shí)，Cov 組、治療組、安慰劑組動(dòng)物的肺組織可見：支氣管上皮鱗狀化生及脫落、黏膜層黏液腺增生；肺間隔增寬并相互融合、血管擴(kuò)張充血、周圍水腫伴大量炎細(xì)胞浸潤(rùn)，肺泡腔內(nèi)存在纖維素樣滲出物。與3 d 時(shí)比較，7 d 時(shí)各組的炎性損傷加重，出現(xiàn)嚴(yán)重的肺泡損傷(圖5B)。14 d 時(shí)，對(duì)照組大致同前；CoV 組可見肺間隔斷裂，肺泡彌漫性破壞伴單核細(xì)胞浸潤(rùn)，肺泡上皮細(xì)胞增生，有的融合形成多核肺細(xì)胞，相關(guān)周圍血管水腫明顯(圖5C)；治療組可見炎癥組織病變區(qū)縮小，淋巴細(xì)胞浸潤(rùn)數(shù)量較前減少，肺泡內(nèi)滲出物減少，炎癥改變較前減輕；安慰劑組見肺組織局限性炎癥改變，與第7 天類似，并有肺間隔增厚增寬，肺間隔內(nèi)有出血及滲出，內(nèi)見大量單核細(xì)胞、組織細(xì)胞浸潤(rùn)。28 d時(shí)，對(duì)照組大致同前；CoV組見肺泡結(jié)構(gòu)被破壞，纖維結(jié)締組織增生，伴增厚的肺間隔內(nèi)有紅細(xì)胞及淋巴細(xì)胞浸潤(rùn)(圖5D)；安慰劑組炎癥組織病變區(qū)縮小，肺間隔增厚，可見纖維結(jié)締組織增生，肺間隔內(nèi)見出血及滲出，其中可見少許單核細(xì)胞、組織細(xì)胞浸潤(rùn)(圖5E)；治療組可見炎癥組織病變區(qū)明顯縮小，肺泡結(jié)構(gòu)完整，無(wú)滲出，未見纖維結(jié)締組織增生(圖5F)。

圖2 各組大鼠攻毒后肺組織勻漿上清TNF-ɑ水平變化

圖3 各組大鼠攻毒后肺組織勻漿上清IL-6水平變化

圖4 各組大鼠攻毒后肺組織勻漿上清IFN-γ水平變化

圖5 各組大鼠大肺組織病理組織學(xué)改變(HE×100)

3 討論

據(jù)報(bào)道，冠狀病毒感染性肺炎患者以呼吸道癥狀為主，輔助檢查可見典型的胸部CT影像特征，給人類健康帶來(lái)了巨大的危害，因此，研究其病因及有效治療手段十分重要。本研究擬通過表位匹配的冠狀病毒模型進(jìn)行相關(guān)研究，闡明新型冠狀病毒感染的發(fā)病機(jī)制及系統(tǒng)探討治療手段。

根據(jù)目前臨床流行病學(xué)研究報(bào)道指出，冠狀病毒感染性肺炎的臨床癥狀聚焦感染，為以肺部感染為主的全身性免疫炎性反應(yīng)。本研究鼻噴霧法接種構(gòu)建冠狀病毒感染性肺炎大鼠模型，觀察到病毒感染后7 d時(shí)，與對(duì)照組相比，CoV組大鼠出現(xiàn)明顯的精神萎靡、活動(dòng)覓食減少、被毛粗亂、消瘦，行為學(xué)檢查提示在T迷宮中到達(dá)正確臂耗時(shí)顯著增加；CoV組大鼠肺組織分離出冠狀病毒血清SARS-CoV特異性抗體IgG檢測(cè)陽(yáng)性，且隨著感染的時(shí)間延長(zhǎng)而滴度增高，7～14 d時(shí)達(dá)峰值；肺組織病理學(xué)檢查見肺間隔增寬并相互融合、血管擴(kuò)張充血、周圍水腫伴大量炎細(xì)胞浸潤(rùn)等炎癥改變。14 d時(shí)，無(wú)治療的CoV組大鼠病理檢查提示肺部炎性損傷加重，與調(diào)研中冠狀病毒感染患者的癥狀相吻合。本研究也觀察了肺組織勻漿上清炎性相關(guān)細(xì)胞因子的表達(dá)情況。實(shí)驗(yàn)結(jié)果亦顯示與正常對(duì)照組相比，CoV 組大鼠的肺勻漿上清中檢測(cè)出的IL-6、TNF-α、IFN-γ水平明顯增高，而與3 d 時(shí)比較，7 d 時(shí)CoV組大鼠的肺勻漿上清中IL-6、TNF-α、IFN-γ水平也被證實(shí)增高更加明顯。

目前臨床研究報(bào)告指出中藥及肺泡灌注在冠狀病毒感染的疫情控制中發(fā)揮了其特殊作用，多項(xiàng)研究發(fā)現(xiàn)黃芩甙元具有抗病毒及改善免疫炎性反應(yīng)的療效，肺泡灌注清除肺泡黏液[19]。分組進(jìn)行肺泡灌注載藥納米黃芩甙元技術(shù)治療有效性的探討，研究觀察到，在14 d、28 d 兩個(gè)時(shí)間點(diǎn)，無(wú)治療的CoV 組大鼠體重進(jìn)行性下降，反應(yīng)萎靡；治療組及安慰劑組大鼠體重?zé)o繼續(xù)下降，活動(dòng)及覓食量有改善，其中治療組改善較安慰劑組明顯。行為學(xué)實(shí)驗(yàn)亦提示在實(shí)驗(yàn)7 d、14 d 時(shí)，治療組大鼠T 迷宮實(shí)驗(yàn)中達(dá)正確臂耗時(shí)顯著少于CoV 組，且療效隨著時(shí)間發(fā)展得到進(jìn)一步改善。病理學(xué)結(jié)果提示14 d 時(shí)，CoV 組肺部炎性損傷加重，治療組見炎癥組織病變區(qū)縮小，淋巴細(xì)胞浸潤(rùn)數(shù)量及肺泡內(nèi)滲出物減少，安慰劑組仍可見肺組織呈局限性的大致同前的炎癥改變；28 d 時(shí)治療組可見炎癥組織病變區(qū)明顯縮小好轉(zhuǎn)，肺泡結(jié)構(gòu)完整，無(wú)出血、滲出；而CoV 組可見病變區(qū)肺泡破壞并出現(xiàn)纖維結(jié)締組織增生，伴有出血、滲出等嚴(yán)重的破壞。安慰劑組亦有相應(yīng)好轉(zhuǎn)，炎癥組織病變縮小，但可見肺間隔內(nèi)見出血、滲出、少許單核細(xì)胞等浸潤(rùn)。上述研究結(jié)果證實(shí)冠狀病毒感染性疾病有淋巴細(xì)胞浸潤(rùn)數(shù)量及肺泡內(nèi)滲出物增多等特征性病理改變；感染冠狀病毒后，應(yīng)用肺泡灌注黃芩甙元載藥納米的治療方式，可有效減輕該炎性反應(yīng)，改善大鼠的機(jī)能，通過內(nèi)源性抗氧化防御保護(hù)了器官組織的炎性損傷。冠狀病毒感染可造成肺泡黏液組織分泌增多等病理改變，而安慰劑組單純肺泡灌注清除肺泡黏液，療效不如治療組。

目前國(guó)內(nèi)外研究指出，冠狀病毒感染性肺炎的間質(zhì)性肺炎與免疫炎癥反應(yīng)程度、冠狀病毒的感染及復(fù)制相關(guān)。本研究中，14 d時(shí)治療組肺部病毒分離轉(zhuǎn)陰，血清IgG抗體滴度在治療后即逐漸下降，在28 d時(shí)，滴度下降明顯，與對(duì)照組比較差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。而安慰組單純肺泡灌注干預(yù)后病毒分離仍為陽(yáng)性，在14 d、28 d 時(shí)，血清IgG 抗體滴度有所下降。另外，在14 d、28 d，治療組及安慰劑組的肺勻漿上清中IL-6、TNF-α、IFN-γ因子水平下降，在28 d 時(shí)，治療組上述因子水平與同組在3 d、7 d時(shí)相比，細(xì)胞因子水平明顯下降，改變是有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義的；且在28 d時(shí)，與對(duì)照組相比，治療組上述因子水平差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。結(jié)果所示，經(jīng)肺泡灌注載藥納米黃芩甙元技術(shù)治療后，治療組的大鼠行為臨床狀態(tài)、肺部病變的改變與其肺組織勻漿上清的IL-6、TNF-α、IFN-γ水平改變相關(guān)。安慰劑組肺部炎癥減輕，勻漿上清細(xì)胞因子水平所下降，但治療組較安慰劑組有效。驗(yàn)證肺泡灌注黃芩甙元載藥納米的治療方式通過內(nèi)源性抗氧化防御，減輕免疫炎性反應(yīng)，并抑制了病毒的復(fù)制及存活，抑制了肺組織的應(yīng)激損傷；而安慰劑組單純使用肺泡灌注技術(shù)可稀釋氣管肺泡分泌物、暢通氣道，無(wú)法從根本上清除病毒，療效不及治療組。

綜上所述，肺泡灌注載藥納米黃芩甙元技術(shù)通過減輕免疫炎性反應(yīng)改善冠狀病毒感染大鼠的急性呼吸綜合征，對(duì)冠狀病毒感染性肺炎有明確治療效果的，值得應(yīng)用推廣。這一發(fā)現(xiàn)為新型冠狀病毒的臨床藥物研發(fā)奠定了基礎(chǔ)，對(duì)新型冠狀病毒的發(fā)病機(jī)制的研究提供研發(fā)新思路。